专利名称：一种极耐热β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用的制作方法
一种极耐热β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用技术领域
本发明属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及一种极耐β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用。
背景技术：
聚葡萄甘露糖类是除聚木糖类植物多糖外的另一重要的半纤维素。广泛存在于椰子、魔芋粉、海藻及针叶材等植物体中。甘露聚糖酶和甘露糖苷酶是聚葡萄甘露糖半纤维素酶系中的最为关键的水解酶，前者通过随机切割甘露聚糖的β -I, 4-糖苷键，将甘露聚糖水解为甘露寡糖，后者再将甘露寡糖或一定聚合度的甘露聚糖降解为甘露糖甘露糖，是一种重要的糖质营养素，广泛分布于体液和组织中，在调节免疫系统、增加伤口愈合、抗发炎效果等生理调节方面有重要作用。
β_甘露糖苷酶作为一种工具酶，它还可以使腐烂植物材料糖化来用作家禽饲料添加剂。另有研究报道，β_甘露糖苷酶在生物燃料和生物塑料工业发挥重要作用。目前国际上报道的β -甘露糖苷酶主要是来源于一些真菌(如黑曲霉)以及一些常温、中温细菌， 而来源于极耐热细菌及古菌的甘露糖苷酶鲜有报道。发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种极耐热甘露糖苷酶基因，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种上述极耐热甘露糖苷酶基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供上述一种极耐热甘露糖苷酶基因的应用。
技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种极耐热甘露糖苷酶基因，其DNA序列如SEQ NO :1所示。
上述的极耐热甘露糖苷酶基因表达的极耐热甘露糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。
一种极耐热甘露糖苷酶，氨基酸序列为权利要求2所述的SEQ NO :2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有甘露糖苷酶活性的衍生蛋白质。
一种重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。
一种用于扩增极耐热甘露糖苷酶基因的引物，所使用的引物对为 manl :5’ -GGAATTCCATATGGATTTCCTGCTGGGTATTAACT-3’ ；man2 :5’ -CCGCTCGAGGAAGTTCAGCAGCTTATACTCTTTC-3’ 。
上述的极耐热甘露糖苷酶在酶解甘露聚糖或甘露寡糖中的应用。酶解反应温度为 70-95°C, pH5. 0-7. 5。所述的甘露聚糖来源于天然植物的甘露聚糖。
上述的重组体系在酶解甘露聚糖或甘露寡糖中的应用。
上述的极耐热甘露糖苷酶在酶解角豆树甘露聚糖中的应用。
有益效果与现有技术相比，本发明所提供的甘露糖苷酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在85°C、pH5. 5的条件下酶活性最高，比酶活达到144. 6U/mg ； 该蛋白酶在温度为WV -95°C, pH为5. 0-7. 5的范围内，均具有较高的酶活。该甘露糖苷酶的耐热性能极高，在75°C的反应体系中，保温2h酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的甘露糖苷酶比现有甘露糖苷酶具有更大的优越性，适用于80°C以上高温、偏酸性PH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。该甘露糖苷酶因其具有高效的酶解能力及较强的热稳定性，因此可作为一种高效的工业酶制剂用于甘露糖的生产。
图I是甘露糖苷酶Tth manB的SDS-PAGE蛋白电泳2是Tth manB的最适温度结果图；图3是Tth manB的最适pH结果图；图4是Tth manB的热稳定性结果图；图5是Tth manB降解角豆树甘露聚糖的TLC图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例I甘露糖苷酶基因Tth manB的制备可采用如下人工合成的方式制备基因，也可以以thermarum DSM5069 (DSMz, German)的总DNA为模板通过常规PCR方法得到(引物采用实施例2的引物 manl、2)。
本实施例的甘露糖苷酶基因RA 通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ NO 1所示。
实施例2甘露糖苷酶基因Tth manB的亚克隆用下述引物对PCR扩增实施例I中的甘露糖苷酶基因 manl :5’ -GGAATTCCATATGGATTTCCTGCTGGGTATTAACT-3’ ； man2 :5’ -CCGCTCGAGGAAGTTCAGCAGCTTATACTCTTTC-3’ 。
上述引物合成时，manl引入Nde I酶切位点，man2引入Xho I酶切位点。
PCR反应体系1 μ L T. thermarum 合成DNA, I μ L manl, I μ L man2, 25 μ L Premix ExTaq，22y L 超纯水。
PCR 反应条件94°C变性 5min ;94°C变性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min， 30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保温。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(BI0MIGA，上海)。
实施例3重组克隆、表达载体pET-20b-7iA manB的构建与验证将纯化过的PCR产物(实施例2制备)、pET-20b (Novagen)用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8μ L无菌水重悬，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含100μ g/mL Amp (氨苄青霉素)的培养皿，37°C培养 10-12h。
从转化平板上挑取多个单菌落，采用BI0MIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。 对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为1824bp)，进而得到重组克隆、表达载体pET-20b-RA manB，_、DNA序列如SEQ NO 1所示，其表达的蛋白(极耐热甘露糖苷酶)的氨基酸序列如 SEQ NO 2所示，将该蛋白命名为甘露糖苷酶Tth imnB。
实施例4重组甘露糖苷酶Tth manB的表达与纯化将重组克隆、表达载体pET-20b-RA manB (实施例3制备)电转至宿主菌疋coli BL21(DE3) (Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有 100 μ g/ml氨节青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基,在37°C温度下,200rpm震荡培养8-12h。取4mL菌液接种于含400mL培养基的IOOOmL摇瓶中，37°C温度下，200rpm震荡培养，当吸光度(OD6qq)达到O. 6-0. 8时，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C温度下，120rpm 诱导表达10-12h。4°C，用高速冷冻离心机13000rpm将培养液离心15min，收集菌体。用 50mL超纯水洗漆并在4°C下，以13000rpm离心15min,回收菌体,接着用20mL I XBinding Buffer 重悬(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4°C下13000rpm离心15min，得到含甘露糖苷酶Tth manB的粗提液。
粗提液先经70°C加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化(方法见His-Bind Kits, Novagen),得纯酶液。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，图中，I为经粗提液中的Tth manB蛋白，2 为200 mM咪唑洗脱纯化过后的Tth manB蛋白，3为400 mM咪唑洗脱纯化过后的Tth manB 蛋白，分子量约为70 kDa，与理论值相近。
实施例5重组甘露糖苷酶Tth manB的酶学性质分析酶活定义为lmin内催化角豆树甘露聚糖(Megazyme, Ireland)产生I μ mol甘露糖所需的酶量。
( I)最适温度用PH值为6. O的0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4得到的纯酶液(稀释的倍数是30倍)，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200 μ L，由0. 5%角豆树甘露聚糖100 μ L，90 μ L 0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10 μ L稀释酶液组成； 反应体系的PH为6. O。将反应体系在60-95°C温育IOmin后，加入300 μ L DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定550nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图，结果如图2所示， 研究结果表明在85°C时，该甘露糖苷酶具有最高的酶活性；将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性100%，其它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中，在温度80-100°C的反应体系中酶活性较高。
(2)最适 pH酶活性测定体系为200 μ L，由0. 5%角豆树甘露聚糖100 μ L, ρΗ4· 5-8. 5的90 μ L 0. IM 咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10 μ L稀释酶液组成。将反应体系在85°C温育IOmin后， 加入300 μ L DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定550nm的吸光值，实验设3次重复实验，取平均值。结果如图3所示，研究结果表明，在pH为5. 5时，甘露糖苷酶具有最高的酶活性，为144. 6U/mg ;将此pH值下的酶活反应体系的作为相对活性100%，其它pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在PH5. 0-7. 5的条件下，酶活均较高。
(3)重组酶热稳定性用PH值为7. O的O. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4得到的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释酶液在751、801、851和90°C水浴30min、60min、90min 和120min，测定酶的残存酶活，如图4所示。酶活测定反应体系中pH为5. 5，测定温度为 85 °C。实验设3次重复，取平均值，结果如图4所示。研究结果显示，75 °C处理2h未见酶活下降，80°C处理2h，残存酶活为70%，结果显示可见该甘露糖苷酶有较强的热稳定性。
实施例6重组甘露糖苷酶Tth manB在角豆树甘露聚糖降解中的应用重组甘露糖苷酶Tth manB对角豆树甘露聚糖降解研究，具体步骤如下所述(I)用pH5. 5的O. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液配制2%角豆树甘露聚糖溶液。混勻，吸取100 μ L混合液，加入上述的缓冲溶液90 μ L与含10 μ L的纯化酶于100 μ L的反应体系中，80°C水浴震荡O. 5h、lh和2h。
(2)分别收集上述O. 5h、Ih和2h水解液于_20°C的冰箱中保存。
(3)配置上述水解液适宜的TLC的展层剂和显色剂，展层剂中正丁醇乙酸水=2 I :1，显色剂为将Ig的3，5-二羟基甲苯加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2 8)中配制而成。
(4)用毛细吸管蘸取少量的1%的甘露糖溶液及上述样品，分别点至宽度为10cm、 长度为20cm的玻璃硅胶板上，点完样后用吹分机吹干并将硅胶板放置于上述展层剂的层析缸中。
(5) 5h后取出玻璃板先风干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通风橱中用喷壶将硅胶板均匀喷洒，接着在再放置于100°c的干燥箱中烘干。
结果如图5所示，M为1%甘露糖标准液，I、2和3分别为O. 5h、lh和2h的水解液。研究结果表明，重组甘露糖苷酶Tth manB可以快速有效水解角豆树甘露聚糖的非还原性末端，生成甘露糖。综上所述，该甘露糖苷酶适于聚合度较高的甘露聚糖的降解，能有效降解甘露寡糖。因此，该极耐热甘露糖苷酶在甘露糖的生产中有潜在的应用价值。
权利要求
1.一种极耐热甘露糖苷酶基因，其DNA序列如SEQ NO :1所示。
2.权利要求I所述的极耐热甘露糖苷酶基因表达的极耐热甘露糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。
3.一种极耐热甘露糖苷酶，其特征在于氨基酸序列为权利要求2所述的SEQ N0:2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有甘露糖苷酶活性的衍生蛋白质。
4.一种重组体系，其特征在于在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO :1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。
5.一种用于扩增权利要求I所述的极耐热甘露糖苷酶基因的引物，其特征在于所使用的引物对为manl :5’ -GGAATTCCATATGGATTTCCTGCTGGGTATTAACT-3’ ；man2 :5’ -CCGCTCGAGGAAGTTCAGCAGCTTATACTCTTTC-3’ 。
6.权利要求2所述的极耐热甘露糖苷酶在酶解甘露聚糖中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于酶解反应温度为70-95°C，pH5.0-7. 5。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的甘露聚糖来源于角豆树。
9.权利要求4所述的重组体系在酶解甘露聚糖中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种极耐热β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用，该极耐热甘露糖苷酶基因的DNA序列如SEQNO1所示。极耐热甘露糖苷酶基因表达的极耐热甘露糖苷酶的氨基酸序列如SEQNO2所示。该极耐热甘露糖苷酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在85℃、pH5.5的条件下酶活性最高，比酶活达到144.6U/mg；该蛋白酶在温度为70-95℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该甘露糖苷酶的耐热性能极高，在80℃下保温2h，残存酶活大约为70%。上述特性使得本发明得到的甘露糖苷酶比现有甘露糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏酸性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。
文档编号C12N15/56GK102978222SQ20121055332
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者王飞, 时号, 黄颖娟, 李迅, 邓若冰 申请人:南京林业大学