专利名称：一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー株植物乳杆菌。
背景技术：
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的ー类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。绝大部分乳酸菌都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。植物乳杆菌是乳酸菌的ー种，属于乳杆菌属，有很强的发酵碳水化合物的能力，较 耐盐，与其它乳酸菌有协同作用，具有免疫调节、拮抗致病菌、抗突变和防癌等益生性质，其代谢产生的有机酸、过氧化氢、双こ酰、细菌素等物质能够抑制病原菌的生长和粘附，调节宿主肠道、阴道、尿道的微生态平衡、预防和治疗由于微生态失衡而造成的腹泻、感染；植物乳杆菌是厌氧细菌(兼性好氧)，能够降低血清胆固醇。在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是ー种生物型的防腐剤。
发明内容
本发明提供了一株植物乳杆菌。一株植物乳杆菌，它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017,属于乳杆菌属(Lactobacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC NO :5448，保藏日期为2011年11月08日；它为革兰氏阳性菌，呈短杆状、两端呈圆形，长为1. Oym 1. 7 ym，宽为0. 4iim 0. 9iim,无芽孢,无鞭毛；在MRS培养基上形成白色的圆形菌落、直径为0. 5 2mm、菌落边缘整齐、细致有光泽、中央有凸起。本发明所述植物乳杆菌，它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC75017，该菌株能够利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、a -甲基-D-甘露糖甙、N-こ酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维ニ糖、麦芽糖、乳糖、蜜ニ糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、拢牛儿糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸盐发酵产酸；该菌株不能利用甘油、赤癖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、P _甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、肌醇、山梨醇、a -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-匍萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐发酵产酸；该菌株过氧化氢酶实验呈阴性、明胶液化实验呈阴性、硝酸盐还原实验呈阴性、硫化氢实验呈阴性、吲哚实验呈阴性、动カ实验为不运动；该菌株的最适生长温度为30 35°C，10°C能生长，45°C不生长，生长pH为4. 5 9. 5，最适合生长pH为 5. 8。本发明中一株植物乳杆菌，它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017，经16S rDNA序列测序，结果在NCBI上进行同源性比较，菌株NDC 75017与Lactobacillusplantarum JDMl、Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-1II>Lactobacillus plantarumWCFSl 的亲缘关系最近，同源性达 99. 8%。经 IGS (intergenicspacer)序列测序，将IGS测序结果的785个碱基在NCBI上进行同源性比较，菌株NDC75017 与 Lactobacillus pIantarumffCFSK LactooaciIIus plantarum subsp. plantarumST-1II的亲缘关系最近，同源性达99. 5%。所述植物乳杆菌其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。所述植物乳杆菌其IGS序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明中一株植物乳杆菌，它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC75017,属于乳杆菌属(Lactobacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC NO :5448，保藏日期为2011年11月08日。 本发明中一株植物乳杆菌，它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC75017，该菌具有高产Y -氨基丁酸的能力，经高效液相色谱检测其产量高达138mg/L ；Y -氨基丁酸是ー种重要的抑制性神经递质，它參与多种代谢活动，具有很高的生理活性，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、増加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进こ醇代谢(醒酒)、改善更年期综合症等多种功效，也可与各种各样的食品组合，制造成各种各样富含Y-氨基丁酸的功能食品。
图1为具体实施方式
一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017单个菌的电镜图；图2为具体实施方式
一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017多个菌的电镜图；图3为具体实施方式
一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017的16S rDNA的系统发育树；图4为具体实施方式
一中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017的IGS的系统发育树。
具体实施例方式实施例1 :植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) NDC 75017,属于乳杆菌属(Lactobacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC NO :5448，保藏日期为2011年11月08日；它为革兰氏阳性菌，呈短杆状、两端呈圆形，长为！.(^!!! ^!!!!!，宽为匕扑!!! 0.9 u m，无芽孢，无鞭毛；在MRS培养基上形成白色的圆形菌落、直径为0. 5 2mm、菌落边缘整齐、细致有光泽、中央有凸起。本实施方式中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC 75017的最适生长温度为30 35°C，10°C能生长，45°C不生长，生长pH为4. 5 9. 5，最适合生长pH为5. 8。本实施方式一株具有高产Y -氨基丁酸能力的菌株，它从内蒙古传统发酵乳制品中分离得到，筛选方法按以下步骤实现一、样品的采集 采集样品时双手戴上无菌的一次性乳胶手套，用一次性无菌注射器吸取内蒙古通辽地区牧民家庭中自制的传统酸奶样品，放入事先已经灭菌的器皿中，用记号笔在器皿上标注样品编号并封好放入冰盒内，将冰盒放入含有冰袋的保温箱；測定采集样品的PH值与温度，并记录采集地点到调查采样表中，同时用相机采集样品的图片资料；采集后的样品带回实验室于4°C冰箱中保存备用。ニ、乳酸菌的分离与纯化用灭菌移液器取ImL酸奶样品，接种于灭菌的生理盐水中，进行梯度稀释；在灭菌培养皿中倒入灭菌、冷却至50°C的含有0. 75%CaC03的MRS固体培养基，冷却至凝固后，将稀释的样品接入MRS固体培养基中，放入恒温厌氧培养箱，37°C培养48 72h。观察并记录菌 落特征。从平板上长出的菌落中挑选出周围形成透明圈的单个菌落，进行革兰氏染色，将G+菌株继续划线于MRS固体培养基，直至确定为纯菌；将纯化的菌株再进行革兰氏染色并做H2O2酶试验，凡革兰氏染色阳性、H2O2酶试验阴性的菌株可初歩确定为乳酸菌；三、乳酸菌分离株的保存将纯化菌株接种到MRS斜面培养基中，经培养后置4°C冰箱中保存备用，同时将分离菌株的纯培养物接种于MRS液体培养基中，37°C厌氧培养16h，连续传代培养3次，将培养液与30%灭菌甘油以1:1的比例混合均匀，置于_80°C冰箱冷冻保存；其中所述MRS固体培养基(IOOOmL)由5g的蛋白胨、5g的牛肉膏、5g的酵母粉和IOg的胰蛋白胨、1. OmL的TWeen-80、20g的葡萄糖、各10毫升的5种盐溶液和余量的蒸馏水组成，调pH至5. 8，121 °C高压灭菌15min ;其中5种盐溶液20g K2HPO4 .SH2CHlOOmL蒸馏水,20g朽1檬酸氢ニ铵+IOOmL蒸懼水,50gこ酸钠+IOOmL蒸懼水,5. 8g MgSO4 7H20+100mL蒸懼水，2. 5g MnSO4 H2O+1OOmL 蒸懼水。本实施方式筛选所得菌的电镜图见图1和2。对筛选所得菌进行生理生化试验依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)和《常见细菌系统鉴定手册》对其进行常规生理生化鉴定，实验结果为该菌株能够利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、a-甲基-D-甘露糖式、N-こ酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维ニ糖、麦芽糖、乳糖、蜜ニ糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、棉子糖、拢牛儿糖、D-阿拉伯糖醇和葡萄糖酸盐发酵产酸；该菌株不能利用甘油、赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、阿东醇、@ -甲基-D-木糖甙半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、肌醇、山梨醇、a -甲基-D-甘露糖甙、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐发酵产酸；该菌株过氧化氢酶实验呈阴性、明胶液化实验呈阴性、硝酸盐还原实验呈阴性、硫化氢实验呈阴性、吲哚实验呈阴性、动カ实验为不运动。分子生物学鉴定对筛选所得菌经16S rDNA序列测序，结果在NCBI上进行同源性比较，菌株NDC75017 与 Lactobacillus plantarum JDMl、Lactobacillus plantarum subsp. plantarumST-1I1、Lactobacillusplantarum WCFSl的亲缘关系最近，同源性达99. 8% (如图3所示)。经IGS (intergenic spacer)序列测序，将IGS测序结果的785个碱基在NCBI上进行同源性比较，菌株 NDC 75017 与 Lactobacillus plantarum WCFSl、Lactobacillusplantarum subsp. plantarum ST-1II的亲缘关系最近，同源性达99. 5% (如图4所示)。结合菌株NDC 75017形态学观察、生理生化试验鉴定结果，确定菌株NDC 75017为乳杆菌属(Lactobacillus)的一个新菌株，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC75017。本实施方式筛选所得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017,通过高效液相色谱检测对其进行产Y-氨基丁酸的能力的测试，结果为138mg/L。实施例2 小鼠灌服植物乳杆菌NDC 75017菌悬液后，利用Real-time RT PCR方法检测肠道 内免疫相关基因的差异表达变化。结果显示，1し10、1レ10、1レ6、1し17、1し18和1即-0这六个目的基因的表达均呈现出先増加后减小的趋势，并且所有基因表达量都在小鼠灌胃第5天出现最大值，同时表达量与对照组相比差异极显著(p〈0. 01)。实施例3 植物乳杆菌NDC 75017作用于Caco-2细胞0.5、1、2和4h后，利用Western Blot方法检测TLR2、P-NF- K B p65和p-p38MAPK蛋白水平的表达。结果显示，植物乳杆菌NDC75017能短期诱导TLR2、p-NF-k B P65和p-p38MAPK的表达，表明植物乳杆菌NDC 75017能快速的激活TLR2介导的两条免疫相关信号通路，并且能够进ー步促进免疫相关细胞因子的产生。实施例4 因本申请采用菌株筛选自内蒙古传统发酵乳制品，植物乳杆菌NDC75017可用于发酵生产酸奶，在牛乳中添加L-谷氨酸钠(lOOmmol/L)，磷酸吡哆醛浓度为20 u mol/L,植物乳杆菌NDC 75017接种量2% (活菌数5X 1011)，30摄氏度发酵24小时，在酸奶中检测到GABA含量为113mg/L，发酵得到的成品酸奶，经过感官评价，总体结果是色泽气味良好，呈均匀的乳白色，有酸奶的奶香味；组织状态良好，凝块细小均匀光滑无气泡，无异味，只有微量的乳清析出。实施例5 植物乳杆菌NDC 75017在pH 3. 0条件下处理lh_3h，存活率分别为53. 66%、28. 46%和10. 57% ;将菌悬液以2%接种量接至含0. 3%胆酸盐的MRS液体培养基中37°C培养12h，存活率能达到84. 31% ;将菌悬液按2%分别接种至7g/100ml的高盐浓度MRS液体培养基中37°C培养箱中分别培养24h，活菌数可达108CFU/mL。实施例6 将制备好的菌悬液按2%接种量接种至过滤除菌的pH3. 0的人工胃液中37°C培养O、1、2、3h后取样，測定其活菌数。然后，分别无菌吸取处理O、1、2、3h后的含菌人工胃液，以2%接种量接种至过滤除菌的pH8. 0的人工肠液中，继续置37°C培养，分别在0h、3h、5h、7h、8h后測定活菌数。人工胃液NaCl 0. 2%、胃蛋白酶0. 35%，用IN HCl调整pH值为3. 0后，0. 22um滤
膜过滤除菌备用。
人工肠液将下述a液和b液以2:1混合即为人工肠液a胰腺液=NaHCO3L 1%、NaCl 0. 2%、胰蛋白酶0. 1%，调整pH为8. 0后，过滤除菌备用。b胆液胆盐1. 2%,调整pH为8. 0后，过滤除菌备用。存活率=Nt/N。X100%式中，Nt——菌体在人工消化液培养不同时间后的活菌数；
N0——菌体在MRS培养基中培养不同时间后的活菌数。植物乳杆菌NDC 75017在pH3.0的人工胃液中作用l-3h，存活率分别可达到34. 23%,26. 43%、18. 92%，在人工胃液中存活率较高，说明其能耐受胃液酸性及胃蛋白酶环境，可以通过胃进入肠道并保持活性。植物乳杆菌NDC 75017经人工胃液处理后，在人工肠液中分别作用3h、5h、7h、8h后，存活率分别可达到82. 54%、68. 25%,63. 49%,58. 73%，这表明，在模拟小肠中食物消化吸收的时间内，植物乳杆菌NDC 75017可在肠液中保持一定活性，对肠液的耐受性能较好。
权利要求
1.一株植物乳杆菌，其特征在于它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NDC75017，属于乳杆菌属(Lactobaci I Ius )，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC NO 5448, 保藏日期为2011年11月08日。
全文摘要
本发明公开了一株具有高产γ-氨基丁酸能力的菌株，为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017，属于乳杆菌属，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO5448，保藏日期为2011年11月08日。本发明中菌株NDC 75017具有高产γ-氨基丁酸的能力，经高效液相色谱检测其产量高达138mg/L；γ-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质，具有很高的生理活性，有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、营养神经细胞、增加生长激素分泌、改善更年期综合症等多种功效。
文档编号C12N1/20GK103013879SQ201210552498
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月19日 优先权日2011年12月23日
发明者姜毓君, 单艺, 满朝新, 邓宇 申请人:黑龙江省乳品工业技术开发中心