一种高效生产γ-氨基丁酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效生产Y-氨基丁酸的方法，尤其是利用一株分泌表达谷氨酸 脱羧酶的基因工程菌高效生产y-氨基丁酸的方法，属于发酵工程领域。
【背景技术】
[0002] y_氨基丁酸（y-aminobutyricacid，简称GABA)，又称4-氨基丁酸、氨酪酸，是 一种在自然界中广泛存在并具有重要的生理功能的非蛋白类氨基酸。在人体中GABA是中 枢神经系统中三大抑制性神经递质之一，具有缓解焦虑、降低血压、安眠镇定等生理功效， 因此在医疗保健方面应用广泛。发酵法生产GABA主要是利用微生物自身的谷氨酸脱羧酶 (glutamatedecarboxylase，GAD，EC4. 1. 1. 15)，催化谷氨酸或谷氨酸钠发生脱羧反应生 成Y-氨基丁酸。
[0003] 为实现Y_氨基丁酸的合成，需要添加一水合谷氨酸钠作为底物。谷氨酸脱羧酶 是一种胞内酶，在大肠杆菌胞内中过表达谷氨酸脱羧酶来生产y-氨基丁酸时，由于细胞 膜壁对底物和酶的分隔，导致Y-氨基丁酸产量及生产效率的降低。此外，胞内表达的谷氨 酸脱羧酶在大批量分离纯化方面也有诸多困难。因此，实现谷氨酸脱羧酶的胞外表达将有 利于提升y-氨基丁酸生产效率以及谷氨酸脱羧酶的获得。
[0004] 在细菌中，大多数分泌蛋白都是通过Sec系统以未折叠的形式被转运到周质空间 中，再在周质空间中进行折叠。而谷氨酸脱羧酶是一个同源六聚体蛋白，实验室此前研宄显 示，Sec系统信号肽PelB不能在胞外分泌有活性的谷氨酸脱羧酶，可能是由于在周质空间 中的正确折叠难以有效进行。
[0005] 除了Sec系统，还有少量蛋白通过双精氨酸系统转送到胞外。双精氨酸系统转运 胞内已经折叠好的蛋白，以此，对于不能在细胞质以外的环境中正确折叠的蛋白，双精氨酸 信号肽是一个良好的选择。该系统包括具有转运蛋白能力的转运通道复合体TatA和能够 特异性识别的双精氨酸信号肽的信号识别复合体TatBC。
[0006] 本发明用双精氨酸信号肽TorA对E.coliW3110来源的谷氨酸脱羧酶（GadB)在 E.coliBL21(DE3)进行分泌表达。并在发酵罐水平进行了GABA的生产，6h内GABA产量可 达203g/L。此外，谷氨酸脱羧酶的胞外表达对降低其分离纯化的成本将产生积极的作用。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了首先提供了一种分泌表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌基因工程菌，所 述基因工程菌是以双精氨酸信号肽TorA分泌谷氨酸脱羧酶。
[0008] 编码所述双精氨酸信号肽TorA的基因来自大肠杆菌基因组。
[0009] 编码所述谷氨酸脱羧酶的基因来自大肠杆菌基因组。
[0010] 本发明还提供一种构建所述大肠杆菌基因工程菌的方法，是以大肠杆菌E.coli w3110基因组DNA作模板，PCR获得信号肽torA基因和谷氨酸脱羧酶的基因gadB;用限制 性内切酶分别消化处理torA基因和gadB基因的PCR产物，酶切产物纯化后，连接载体并转 化E.coliBL21 (DE3)，获得分泌表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌基因工程菌。
[0011] 本发明还提供一种应用所述大肠杆菌基因工程菌产谷氨酸脱羧酶的方法，是将 37°C、200rpm下过夜培养的种子以5%的接种量转入TB培养基，于37°C、200rpm条件下培 养，〇D6(J直为1. 0时，添加终浓度为0. 7mM的IPTG诱导表达。
[0012] 本发明还提供了另一种应用所述大肠杆菌基因工程菌产谷氨酸脱羧酶的方法，是 将种子培养液以5-10%的接种量转入装有发酵培养基的发酵罐，于37°C、200rpm条件下培 养；待培养基中初始甘油消耗尽，即发酵罐中溶氧上升时，以比生长速率〇. 12-0. 201T1指数 流加补料培养基，通过搅拌转速与溶氧偶联控制溶氧约30%;待0D_达到40-50,补料培养 基由指数流加转为恒速流加，流加速率12mL/h，并开始以0. 8g/L/h的速度流加200g/L的乳 糖进行诱导，诱导12-24h。
[0013] 种子培养基为LB培养基（1L):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCllOg，pH调至 7. 0〇
[0014]TB培养基（1L):胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油5g， K2HP0414. 6g，NaH2P04 ? 2H203. 6g，甘氨酸 7. 5g，NaC15g〇
[0015] 发酵培养基（1L):胰蛋白胨30g，酵母抽提物20g，甘油8g， Na2S042. 0g，（NH4)2S042. 5g，（NH4)2-H-citratel. 0g，K2HP04 14. 6g，NaH2P04 ? 2H203. 6g， MgS04 ? 7H202. 0g，维生素B1 100mg。
[0016] 补料培养基（1L):酵母膏50g，酵母膏50g，甘油500g，MgS04 ? 7H203. 4g。
[0017] 本发明还提供了一种应用所述大肠杆菌基因工程菌高效合成Y-氨基丁酸的 方法，在3L发酵罐培养所述基因工程菌到发酵液中积累谷氨酸脱羧酶后，调整温度为 37-50°〇,50-100%磷酸控制口114.6-5.0，分批次加入总量400-60(^/1的一水合谷氨酸钠， 转化6h。
[0018] 本发明实现了谷氨酸脱羧酶的分泌表达，有利于简化酶的分离纯化程序，降低分 离纯化成本。且本发明涉及的大肠杆菌基因工程菌经培养诱导产谷氨酸脱羧酶后，可直接 利用发酵体系中的一水合谷氨酸钠高效合成GABA，6h内其GABA产量达203. 7g/L。
【附图说明】
[0019] 图1重组菌的谷氨酸脱羧酶SDS-PAGE，1、2为空载的胞内和胞外；3、4为重组菌的 胞内和胞外。
[0020] 图2重组菌发酵生产谷氨酸脱羧酶转化生产GABA的过程曲线。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1重组菌的构建
[0022] 1)从大肠杆菌E.coliW3110提取基因组DNA作模板，进行PCR扩增，扩增信号肽 torA基因的引物为：5' -CGCCATATGATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGC-3' 和 5'-CATCCATGGCCG CTTGCGCCGCAGTC-3'，扩增谷氨酸脱羧酶基因gadB的引物为:5'-CATCCATGGATAAGAAGCAAGT AACG-3' 和 5' -CCCTCGAGTCAGGTATGTTTAAAGCTGTT-3' 〇
[0023] 2)用限制性内切酶Ndel和Ncol消化处理torA基因的PCR产物，用限制性内切酶 Ncol和Xhol消化处理gadB基因的PCR产物，载体pET20b(+)用Ndel和Xhol处理。酶切 产物纯化后，T4连接酶22摄氏度连接过夜，转化E.coliJM109,筛选正确转化子。对于得 到的正确转化子，提取质粒，转化E.coliBL21(DE3)
[0024] 实施例2摇瓶水平重组菌的胞外谷氨酸脱羧酶SDS-PAGE和谷氨酸脱羧酶酶活检 测
[0025] 1)重组菌摇瓶水平发酵
[0026] a)培养基：种子培养基为LB培养基（1L):胰蛋白胨10g，酵