专利名称：一个控制早期水稻叶绿体发育的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业和植物生物技术等领域，特别是在分子水平上进行植物遗传育种以及植物生理、基因功能等基础研究。
背景技术：
高等植物叶绿体是进行光合作用的场所，而叶绿体的发育受一系列核质基因的控制。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受阻，进而使植物叶色发生异常，甚至使光合作用效率急剧下降。目前，研究工作者们利用物理、化学、生物等诱变创制水稻叶色突变体，将其应用于水稻的遗传育种、生理及其相关基因的克隆和功能研究。本研究利用经物理诱变创制的水稻早期苗色突变体并通过图位克隆技术定位到一个控制叶绿体发育的基因，至今尚未有与此基因相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一个控制早期水稻叶绿体发育的基因、该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。水稻中该控制早期水稻叶绿体发育的基因若被破坏，即可导致早期水稻植株黄化。这种控制早期水稻叶绿体发育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的基因序列所编码的蛋白质，具有SEQ ID No. 2所不的氣基酸序列。优选的，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。—对用于检测上述基因的特异性引物，序列为上游5'-AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3'下游5'-ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3'即SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 5 所示的序列。检测这种控制早期水稻叶绿体发育的基因的方法为，采用上述特异性PCR引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到799bp核苷酸片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。优选的，799bp核苷酸片段序列如SEQ ID No. 3所示。优选的，将所得到的得到799bp片段用Taq I酶切，出现长度为536bp和263bp的特异性片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。在本发明研究中，发明人设计的特异性的PCR引物和检测方法，能对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增，其产物用Taq I进行酶切鉴定，根据酶切带型能快速检测到含有此基因的水稻品种，其检测的准确性高，操作简单，成本低廉。若一个水稻品种中含有此基因，则用上述引物能够扩增出长度为799bp的特异性片段。然后用Taq I对该片段进行酶切，其酶切带型为出现两个特异性片段，长度为536bp和263bp。水稻叶色(黄化)突变体材料是由粳稻“嘉花I号”经6tlCo Y射线辐照而来，经海南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。发明人在研究中将此突变品系与籼稻“培矮64S”配制正反交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将控制叶绿体发育的基因定位在水稻的第2号染色体。本发明控制早期水稻叶绿体发育的基因与其启动子同农杆菌表达载体连接，并通过农杆菌介导的转基因技术将该DNA序列转入黄化突变体后，其后代植株叶色变绿，说明该基因被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻，使植株黄化。通过本发明得到的控制早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度。
图1为本发明的特异性PCR引物对该基因进行PCR扩增结果；图2为本发明对PCR扩增产物进行Taq I酶切检测结果。图中，M代表Marker ；T1 代表扩增的PCR产物；T2代表扩增的PCR产物Taq I酶切后的片段。
具体实施例方式实施例1水稻DNA提取1、根据分子克隆实验手册进行操作，称取O. 5g新鲜的苗期水稻叶片(野生型“嘉花I号”)，把叶片剪成O. 5cm长的小段，放到预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，之后转入1. 5ml离心管中，加入Iml 60°C预热的2XCTAB，轻轻震荡后60°C水浴45min，期间震荡2次。2、取出离心管，冷却置室温，12000转/分的条件下离心5min，吸取上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24 1)混合液，充分混匀。3、将含有溶液的离心管进行平衡，12000转/分的条件下离心5min，吸取上清液，加入其2/3体积异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。4、12000转/分的条件下离心5min，使核酸沉淀，弃上清，用70%乙醇洗涤，室温干燥后溶于10 μ I的无菌水中。5、取2μ I用于后续的PCR扩增反应。实施例2PCR扩增和基因检测(一)获得控制早期水稻叶绿体发育的基因1,25μ L PCR 反应体系如下100mM Tris-HCl pH9. O ； IOOmMKCl; 20mM MgSO4 ；80mM(NH4)2SO4 ；2. 5mM dNTP; 10 μ M 引物，5U/μ I Taq 酶，I μ I 模板 DNA/10 μ I。引物序列为上游引物5’ -GGGGTACCCACAATGCATCTCGATTCTTA-3’(所用内切酶是 KpnI)下游引物5’ -GCTCTAGAGCAGAATGGGGGGATATCTCA-3’(所用内切酶是 XbaI)3、PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。温度和反应条件为94°C预变性4min，94°C变性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸60sec, 35个循环；最后72°C延伸6min。PCR扩增产物长度为3. 7kbp，测序结果如SEQ ID No.1。参照KOME网站上获得的ORF序列，设计特异性RT-PCR引物，上游端和下游端分别为5’ -GAAGATCTATGAGCTACTTCACTTGC-3’5' -GGGGTACCCCAGACTCCTGCGCATGC-3'对所提取的正常植株总cDNA进行扩增，其目的片段长度为750bp，并进行测序。将测序得到的DNA序列即ORF利用Bioxm软件翻译成氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。将测序得到的DNA序列即ORF利用Bioxm软件翻译成氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。(二)检测控制早期水稻叶绿体发育的基因 1,25μ L PCR 反应体系如下IOOmM Tris-HCl ρΗ9. O; IOOmMKCl; 20mMMgSO4;80mM(NH4)2SO4; 2. 5mM dNTP; 10 μ M 引物，5U/μ I Taq 酶，I μ I 模板 DNA/10 μ I。引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示上游5'-AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3'下游5'-ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3'2、PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。温度和反应条件为94°C预变性4min，94°C变性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸60sec, 35个循环；最后72°C延伸6min。得到的扩增产物，上样于1%琼脂糖凝胶上并电泳，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，结果如图1，出现799bp条带，序列如SEQ ID NO. 3所示，是SEQ ID No.1中的一段。3、酶切反应体系Ιμ 无菌水，Ιμ IOXTaq Ibuffer, I μ I O. 1%BSA，O. 5 μ I lOU/μΙ TaqI 和6· 5 μ I PCR扩增产物(总体积10 μ I )。4、酶切处理将酶切反应体系混匀后，放入37 °C恒温水浴中，温浴I小时，每管加入1μ IIOXLoading buffer终止酶切反应。将扩增产物，上样于1%琼脂糖凝胶上并电泳，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像。结果如图2。其酶切带型为出现两个特异性片段，长度为 536bp 和 263bp。实施例3基因功能验证采用Y射线或者其他物理方法诱变，破坏水稻中SEQ ID No.1的基因序列。经测序该基因中的碱基缺失，RNA水平降低，则水稻早期植株黄化。该基因的功能互补实验结果表明含有该正常基因的突变体后代植株叶色呈绿色。水稻叶色突变体材料是由粳稻“嘉花I号”经6tlCo Y射线辐照而来，是一种黄化突变体，经海南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。1、利用SSR和InDel分子标记进行突变基因的定位，通过测序和半定量RT-PCR技术，表明该基因序列发生突变及其RNA水平的表达量下降。2、将SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接到含有外源启动子CaMV35S的农杆菌表达载体pCAMBIA1301S上，并经过酶切、测序验证为该目的基因序列。3、利用农杆菌介导的转基因技术，将上述重组载体转化受体，受体是黄化突变体的愈伤组织，通过鉴定获得阳性第一代转基因植株，其叶色呈绿色。4、将第一代转基因植株的种子播种，其叶色出现分离，呈绿色和黄化表型，并符合孟德尔遗传分离比即3 :1。5、该基因正常表达是水稻植株叶色呈绿色，而其表达下调的突变植株苗期叶色呈
黄化表型，因此可以通过此表型变化来鉴别水稻品种真伪，提高纯度。
权利要求
1.控制早期水稻叶绿体发育的基因，其特征在于，具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述控制早期水稻叶绿体发育的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。
3.权利要求1或2所述的基因序列所编码的蛋白质，其特征在于，具有SEQID No.2所示的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
5.一对用于检测权利要求1或2所述控制早期水稻叶绿体发育的基因的特异性PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列为上游5' -AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3'下游5' -ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3'。
6.检测权利要求1或2所述控制早期水稻叶绿体发育的基因的方法，其特征在于，用权利要求5所述的特异性PCR引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到799bp 核苷酸片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。
7.权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的799bp核苷酸片段，序列如SEQID No. 3所示。
8.权利要求6所述的检测方法，其特征在于，将所得到的得到799bp片段用TaqI酶切，出现长度为536bp和263bp的特异性片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。
9.权利要求1或2所述控制早期水稻叶绿体发育的基因用于鉴别水稻品种真伪。
全文摘要
本发明涉及一个控制早期水稻叶绿体发育的基因及其检测方法和应用。本发明公开了一个控制早期水稻叶绿体发育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。利用设计的如SEQ ID No.4和No.5特异性PCR引物，通过对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后经Taq I酶切进行鉴定，能快速检测到含有该基因水稻植株，其检测准确性高，操作简单，成本低廉。水稻中该基因被破坏即可导致早期水稻植株黄化。通过本发明得到的控制早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及它配制杂交水稻的纯度。
文档编号C12N15/29GK103014022SQ20121055230
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者马晓静, 巩孝帝, 林冬枝, 董彦君 申请人:上海师范大学