专利名称：基于3d打印平台的数字pcr芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及PCR生物芯片研究领域，特别涉及一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法。
背景技术：
在进行生物研究和实际检测时，有时待测DNA样品的量较少或者从样品中提取的待测DNA分子浓度较低时，为了得到较好的结果，通常需要先对样品分子的量进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。虽然常规的PCR技术已广泛应用于生命科学研究及相关领域，并且在应用过程中不断得到改进，但目前仍然存在着耗时太长，操作繁琐，试剂消耗量大，扩增结果不稳定等缺点。因此人们一直在寻求更快速更简便的PCR方 法。数字PCR是最新的DNA定量技术，其基于单分子PCR并采用计数的方法对DNA进行定量，因此是一种绝对定量的工具。将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微量反应体系中，每个反应体系的DNA模板数至多I个。在PCR循环反应之后，可根据发出荧光信号的微量反应体系所占有的比例来判定原始DNA浓度。微量点喷(Inkjet)技术具有精确数字可控的优越性，基于压电效应在微小喷孔(20-80um直径)里产生皮升(pi)级的液滴，配以微米级(Ium)精度的运动平台，可以实现点、线、面的精细喷涂和打印。广泛应用于生物医药，医疗器械喷涂、微分配、0LED、镀膜、功能材料打印，纳米材料沉积，印刷电子等工艺制程和科研领域。喷墨法与数字PCR两者的结合，利用了数字PCR的特点实现了在微量体系中低浓度待测DNA的定量检测，同时亦可通过喷墨的方法将将稀释后的DNA溶液定量定点地喷在在盖片表面，效率极高，成本极低。不需要任何芯片结构和任何液路就可以快速高效的完成dPCR功能，避免了繁杂的芯片制作和微流控液路的集成工艺。这将成为目前存在的最为理想的dPCR实现方法，具有无可估量的科研价值和市场前景。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，具有制备迅速、精确控制油包液滴的体积，和成本制备低廉的优点。本发明所提供一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤步骤1:取一带有微孔阵列结构的基片；步骤2 :将基片进行表面处理；步骤3 :将基片置于3D打印平台平台；步骤4 :利用3D打印平台上的多个喷头，对基片进行油滴和液滴交替的定量喷射打印，使基片表面的微孔中形成油包液滴阵列结构；步骤5 :在基片上的微孔阵列结构中注满过量的油；步骤6 :取一透明盖片；
步骤7 :将透明盖片固定盖合于基片上，完成制备。本发明还提供一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤步骤1:取一平板基片；步骤2 :将平板基片进行表面处理；步骤3 :将平板基片置于3D打印平台；步骤4 :利用3D打印平台上的多个喷头，对平板基片进行油滴和液滴交替的定量喷射打印，使平板基片表面上形成油包液滴阵列 结构；步骤5 :在平板基片的四周固定挡墙，使平板基片形成一凹槽；步骤6 :在平板基片上的凹槽中加满过量的油；步骤7 :取一透明盖片；步骤8 :将透明盖片固定盖合于平板基片上，完成制备。本发明的优点将较为成熟的喷墨平台与数字PCR反应巧妙结合，芯片制作步骤快速简便，无需任何复杂芯片结构和微流控液路，极大的降低了成本。既综合了喷墨打印法的高效率、定点定量喷滴的优势又同时兼具数字PCR低浓度定量检测的特点，为低浓度、稀有样品DNA定量检测及其后续全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、多重基因表达分析等提供良好的操作平台。本发明基于喷墨平台可以精确控制液滴体积的特点，动态范围很大，可完成几皮升至几微升的精确喷点。
为了进一步说明本发明的内容和特点，以下结合附图及实施例对本发明做一详细描述，其中图1为本发明第一实施例的制作方法流程图；图2为本发明第一实施例的制作方法的制备原理图示意图；图3为本发明第一实施例盖合盖片后的结构示意图；图4为本发明第二实施例的制作方法流程图；图5为本发明第二实施例的制作方法的制备原理图示意图；图6为本发明第二实施例盖合盖片后的结构示意图。
具体实施例方式本发明的喷墨式数字PCR芯片的制作方法是首先准备一洁净的基片；然后利用3D打印平台控制喷头在基片表面上定点定量地分别进行PCR反应试剂和密封用油的阵列式打印，形成阵列式油包液滴结构；最后密封并固定，形成封装好的数字PCR反应芯片。请参阅图1、图2和图3所示，本发明提供一种利用带有微孔阵列的基片并基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法(第一实施例)。具体步骤如下步骤1:取一带有微孔阵列结构11的基片10，该基片10的材料为石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板或有机薄片的材料等任何无生物毒性的材料。其中微孔阵列的具体制备方法为首先要对基片10进行清洗，以去除表面有机及无机杂质。采用的清洗步骤具体为取一基片10，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥，所述基片10材料为硅片、石英片、光纤面板或有机薄片，清洗是依次使用超声波在分析纯三氯乙烯、丙酮、无水乙醇、去离子水中清洗，去除基片10表面的有机杂质，随后使用氨水和双氧水的混合液，盐酸和双氧水的混合液，硫酸和双氧水的混合液加热煮沸基片10,并使用去离子水冲洗,去除基片10表面的无机杂质，此种清洗方式可除去基片10表面的有机附着物和无机颗粒物，将清洗后的基片10用氮气吹干后装入培养皿中，之后放入真空干燥箱内前烘，前烘的温度一般高于100摄氏度，前烘操作目的是去除基片10本身附带的水蒸气；然后在基片10正面生长牺牲层，所述牺牲层材料和生长厚度依据后续刻蚀工艺以及刻蚀的深度而定；通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上的图形转移到牺牲层上；所述光刻工艺包括匀胶、前烘、曝光、显影等步骤，刻蚀工艺包括干法刻蚀和湿法刻蚀两种；最后以牺牲层为掩膜，通过刻蚀工艺，在基片10上形成阵列微孔11 ;根据需要选择物理干法刻蚀或化学湿法腐蚀的方式来制作阵列微孔11，其作用机理是利用气体等离子或化学试剂对基片10的腐蚀作用，在基片10无牺牲层覆盖区域形成阵列微孔11。其中每 个微孔形成一个独立反应池，用于数字化PCR反应，阵列微孔以矩形、环形、镜像或密排等形式阵列排布。微孔的体积可从几个皮升至微升量级变化。微孔个数取决于反应体系的浓度，一般大于5000个。步骤2 :将基片10进行表面处理，所述的表面处理是采用亲水处理。对基片10表面进行亲水处理，具体处理方法为生长二氧化硅层、硅烷化处理或氧等离子体处理。步骤3 :将基片10置于3D打印平台平台，此3D打印平台包括喷墨式打印平台、接触式打印平台或针式打印平台。步骤4 :利用3D打印平台上的多个喷头40，将PCR反应试剂20和密封用油30分别定点定量喷点到微孔内，然后在水平面内移动基片或喷头至另一微孔，重复进行滴液操作，最终得到油包液滴阵列结构，其中孔内油层在孔内反应试剂层的上方，并且液滴20是PCR反应试剂。油滴和液滴的喷射体积可以精确控制，并在液滴或油滴在到达基片之前进行准确测量。通过软件分析液滴20和油滴30，得到液滴20和油滴30的直径、体积、出射速度和出射偏角等相关参数。通过软件调节喷射的各个参数，从而获得符合体积和速度要求的液滴20和油滴30。液滴的体积可以从几个皮升至微升量级精确控制。油滴或液滴体积无上限，可以通过在同一位置多次重复喷射得到大体积的油滴或液滴。通过软件设定需要打印的图形，利用3D打印平台即可打印出任何形状的图形，及任意排布的阵列结构。与其他油包液滴结构的制备方法相比，本制备方法产生的油包液滴结构可以有序排列，而非混合无序状态。步骤5 :在基片10上的微孔阵列结构11中注满过量的油。对步骤4中所得油包液滴阵列基片，进行封装，以避免液滴在热循环过程中挥发采用厚油层密封法，将密封用油注入到基片上的点样区，形成厚油层，全部覆盖油包液滴阵列；密封方法除了厚油层密封法，还有凝胶覆盖法或夹具密封法。步骤6 :取一透明盖片50 ;采用步骤I中的清洗方法将透明盖片50清洗干净并烘干后，步骤7 :将透明盖片50水平覆盖在基片10上，压住油层，盖合并固定后形成数字PCR反应芯片。完成制备。请参阅图4、图5和图6所示，本发明还提供利用无任何结构的平板基片并基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法(第二实施例)。具体步骤如下步骤1:取一平板基片11，该基片11的材料为石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板或有机薄片的材料。首先要对基片11进行清洗，以去除表面有机及无机杂质。采用的清洗步骤具体为取一基片11，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥，所述基片11材料为硅片、石英片、光纤面板或有机薄片，清洗是依次使用超声波在分析纯三氯乙烯、丙酮、无水乙醇、去离子水中清洗，去除基片11表面的有机杂质，随后使用氨水和双氧水的混合液，盐酸和双氧水的混合液，硫酸和双氧水的混合液加热煮沸基片11，并使用去离子水冲洗，去除基片11表面的无机杂质，此种清洗方式可除去基片10表面的有机附着物和无机颗粒物，将清洗后的基片11用氮气吹干后装入培养皿中，之后放入真空干燥箱内前烘，前烘的温度一般高于100摄氏度，前烘操作目的是去除基 片11本身附带的水蒸气；步骤2 :将平板基片11进行表面处理，所述的表面处理是采用亲水处理。为了增大液滴在基片表面的吸附性，防止液滴移动，打乱阵列，对基片11表面进行亲水处理，具体处理方法为生长二氧化硅层、硅烷化处理或氧等离子体处理。步骤3 :将平板基片11置于3D打印平台，此3D打印平台包括喷墨式打印平台、接触式打印平台或针式打印平台。步骤4 :利用3D打印平台上的多个喷头41，对平板基片11进行液滴21和油滴31交替的进行定量喷射打印，使平板基片11表面上形成油包液滴阵列结构；其中液滴21是PCR反应试剂。油滴和液滴的喷射体积可以精确控制，并在液滴或油滴在到达基片之前进行准确测量。通过软件分析液滴21和油滴31，得到油滴21和液滴31的直径、体积、出射速度和出射偏角等相关参数。通过软件调节喷射的各个参数，从而获得符合体积和速度要求的液滴21和油滴31。液滴的体积可以从几个皮升至微升量级精确控制。油滴或液滴体积无上限，可以通过在同一位置多次重复喷射得到大体积的油滴或液滴。通过软件设定需要打印的图形，利用3D打印平台即可打印出任何形状的图形，及任意排布的阵列结构。与其他油包液滴结构的制备方法相比，本制备方法产生的油包液滴结构可以有序排列，而非混合无序状态。步骤5 :在平板基片11的四周固定挡墙，使平板基片11形成一凹槽51 ；步骤6 :在平板基片11上的凹槽51中加满过量的油。为避免液滴在热循环过程中挥发，对步骤4中所得油包液滴阵列基片，进行封装。采用厚油层密封法，将密封用油注入到基片上的点样区，形成厚油层，全部覆盖油包液滴阵列。密封方法除了厚油层密封法，还有凝胶覆盖法或夹具密封法。步骤7 :取一透明盖片61 ;同样采用步骤I中的清洗方法将透明盖片61清洗干净并烘干。步骤8 :将透明盖片61水平覆盖在基片11上，压住油层，盖合并固定后形成数字PCR反应芯片。完成制备。此种方法不需要任何复杂的微结构，即可制备数字PCR反应芯片。综上所述，一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法至少具有以下优点1.本发明一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，提出了一种结合3D打印平台和数字PCR的阵列式油包液滴芯片结构的制备方法。2.本发明一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，将较为成熟的3D打印平台与数字PCR反应巧妙结合，芯片制作步骤快速简便，基于3D打印技术的高速打印功能，大规模阵列式反应体系可以在很短时间内得到，非常高效。3.本发明一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，可以无需任何复杂芯片结构，省去了繁琐的微加工工艺，大大简化了制作工艺，并降低了芯片制作成本。4.本发明一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，是通过3D打印平台定点定量打印的功能完成阵列式反应体系的形成，因此无需复杂的微流控液路，极大地降低了数字PCR反应芯片的制作难度，而且降低了制作成本。5.本发明一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法借助3D打印技术，可以精确控制喷射液滴的体积，动态范围很大，可完成从几个皮升至几百个皮升的精确喷点。6.本发明一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，制备简便，耗材少、成 本低，极具产品化潜力。以上所述，仅是本发明的实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案范围内，因此本发明的保护范围当以权利要求书为准。
权利要求
1.一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤 步骤1:取一带有微孔阵列结构的基片； 步骤2 :将基片进行表面处理； 步骤3 :将基片置于3D打印平台平台； 步骤4 :利用3D打印平台上的多个喷头，对基片进行油滴和液滴交替的定量喷射打印，使基片表面的微孔中形成油包液滴阵列结构； 步骤5 :在基片上的微孔阵列结构中注满过量的油； 步骤6:取一透明盖片； 步骤7 :将透明盖片固定盖合于基片上，完成制备。
2.根据权利要求1所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中该基片的材料为石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板或有机薄片的材料。
3.根据权利要求1所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平台包括喷墨式打印平台、接触式打印平台或针式打印平台。
4.根据权利要求3所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平台打印的图形为任何形状的图形，及任意排布的阵列结构。
5.根据权利要求1所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中所述的液滴为数字PCR反应试剂。
6.一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤 步骤1:取一平板基片； 步骤2 :将平板基片进行表面处理； 步骤3 :将平板基片置于3D打印平台； 步骤4 :利用3D打印平台上的多个喷头，对平板基片进行油滴和液滴交替的定量喷射打印，使平板基片表面上形成油包液滴阵列结构； 步骤5 :在平板基片的四周固定挡墙，使平板基片形成一凹槽； 步骤6 :在平板基片上的凹槽中加满过量的油； 步骤7 :取一透明盖片； 步骤8 :将透明盖片固定盖合于平板基片上，完成制备。
7.根据权利要求6所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中该基片的材料为石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板或有机薄片的材料。
8.根据权利要求6所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平台包括喷墨式打印平台、接触式打印平台或针式打印平台。
9.根据权利要求8所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中3D打印平台打印的图形为任何形状的图形，及任意排布的阵列结构。
10.根据权利要求6所述的基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，其中所述的液滴为数字PCR反应试剂。
全文摘要
一种基于3D打印平台的数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤步骤1取一带有微孔阵列结构的基片；步骤2将基片进行表面处理；步骤3将基片置于3D打印平台平台；步骤4利用3D打印平台上的多个喷头，对基片进行油滴和液滴交替的定量喷射打印，使基片表面的微孔中形成油包液滴阵列结构；步骤5在基片上的微孔阵列结构中注满过量的油；步骤6取一透明盖片；步骤7将透明盖片固定盖合于基片上，完成制备。本发明使用3D打印技术构建皮升量级的反应体系，实现体系内的扩增反应。不仅效率高，而且成本低，为数字PCR的产品化提供了最大的可能性。
文档编号C12M1/00GK103013813SQ20121055184
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者孙英男, 魏清泉, 俞育德, 周晓光, 韩伟静 申请人:中国科学院半导体研究所