专利名称：用于转化栅藻和杜氏藻叶绿体基因组的系统的制作方法
用于转化栅藻和杜氏藻 叶绿体基因组的系统相关申请的交叉引用本申请要求于2009年9月15日提交的美国临时申请的号61/242，735的权益，出于所有目的通过引用将其全部内容结合在此。通过引用进行的结合本申请中引用的所有公开文件、专利、专利申请、公开数据库、公开数据库路径、以及其他参考文件都通过引用以其全部内容结合在此，其程度如同每个单独的公开文件、专利、专利申请、公开数据库、公开数据库路径、或其他参考文件被具体地并且单独地指明通过引用结合在此。
背景技术：
藻类是单细胞生物，通过光合作用生产氧气。一组微藻用于生物技术应用是出于许多原因，包括它们的高生长速率和对变化的环境条件的耐受性。微藻类在针对商业上重要的产物的许多工业过程中的用途是已知的和/或已经被提出。例如，微藻类在生产营养补充物、药物、天然染料、鱼类和甲壳动物的食物来源、农业害虫的生物防治、污水处理中产生氧气以及去除氮气、磷和毒性物质，以及污染控制(如塑料的生物降解或二氧化碳的吸收)中具有用途。类似于其他生物，微藻类包含作为膜组分的脂质和脂肪酸、储存产物、代谢物以及能源。已经发现一些藻类株、硅藻、以及蓝细菌包含成比例地高水平的脂质(超过30%)。具有高油或脂含量的微藻株在生产生物燃料的可持续性原料的寻找方面令人具有很大的兴趣。一些野生型藻类适合用于不同工业应用中。然而，人们认识到的是，通过修饰藻类来提高对于上述应用有用的具体特征，有关过程更可能地是商业上可行的。为此，可以开发出比野生型株具有改善特征的藻类株。通过传统的筛选和突变以及选择技术已经进行了这类开发。此外，已经广泛建议了针对藻类的重组DNA技术。这类方法可以增加商业上有价值的产品的生产的经济有效性。藻类受到日益增加的注意的一个领域是燃料产物的生产。对燃料产物，如油、石油化学产品、以及用于生产石油化学产品的其他物质的需求日益增加。多数现今的燃料产物是从化石燃料产生的，由于它们是由数百万年过程中逐层沉积物覆盖的有机物质的结果，它们被认为是不可再生的能源。还存在着日益增长的减轻对进口原油的依赖性的期望。关于污染和环境危害的公众意识也已经增加。其结果是，对于生产燃料产物的替代方法已经存在日益增加的兴趣和需要。因此，对于开发可再生的、可持续的、并对环境较少有害的燃料产物的替代方法存在急切的需要。替代生产燃料和燃料前体的一种潜在来源是基因修饰的生物，例如细菌和植物，包括藻类。迄今为止，藻类还没有作为可商业化的平台成功地开发用于生物燃料生产(主要是由于针对生物燃料回收的藻类的收获和加工的高成本)。因此，存在着为降低这些成本的开发宿主生物如藻类(例如栅藻、衣藻、以及杜氏藻)和细菌的需要。基因修饰生物的一种方式是用编码蛋白质的核酸转化生物，其中蛋白质的表达导致例如产物生产的增加,或导致该生物通常不能制造的产物的生产。
发明概述
I. 一种分离的栅藻，包括已经用一个外源核苷酸序列转化的一个叶绿体基因组，其中该外源核苷酸序列包括编码至少一种蛋白质的一个核酸序列。2.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该蛋白质涉及类异戊二烯生物合成途径。3.如权利要求2所述的分离的栅藻，其中该蛋白质是一种合成酶。4.如权利要求3所述的分离的栅藻，其中该合成酶是一种法尼基二磷酸(FPP)合成酶。5.如权利要求4所述的分离的栅藻，其中该FPP合成酶是来自原鸡。6.如权利要求3所述的分离的栅藻，其中该合成酶是一种壳梭孢菌素二烯合成酶(fusicoccadiene synthase)。7.如权利要求6所述的分离的栅藻,其中该壳梭孢菌素二烯合成酶是来自扁桃假单胞菌。8.如权利要求3所述的分离的栅藻，其中该合成酶是一种没药烯合成酶。9.如权利要求8所述的分离的栅藻，其中该没药烯合成酶是来自大冷杉。10.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该外源核苷酸序列是至少O. 5kb、至少l.Okb、至少2kb、至少3kb、至少5kb、至少8kb、至少llkb、或至少19kb。11.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该核酸序列编码两种蛋白质、三种蛋白质、或四种蛋白质。12.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该外源核苷酸进一步包括编码一种选择标记的一个第二核酸序列。13.如权利要求12所述的分离的栅藻，其中该标记是氯霉素乙酰转移酶(CAT)、红霉素酯酶、或胞嘧啶脱氨酶。14.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该栅藻是二形栅藻。15.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该栅藻是斜生栅藻。16.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该核酸序列编码一种生物质降解酶。17.如权利要求16所述的分离的栅藻，其中该生物质降解酶是一种半乳聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶、糖酶、脂肪酶、还原酶、氧化酶、转谷氨酰胺酶、或植酸酶。18.如权利要求16所述的分离的栅藻，其中该生物质降解酶是一种木聚糖内切酶、外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、木聚糖内切酶、或木质酶。19.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该核酸序列编码一种酯酶。20.如权利要求19所述的分离的栅藻，其中该酯酶是一种红霉素酯酶。21.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该核酸序列编码一种脱氨酶。22.如权利要求I所述的分离的栅藻，其中该核酸序列编码一种甜菜碱醛脱氢酶。23.如权利要求I至22的任一项所述的分离的栅藻，其中该核酸序列被密码子优化用于在该栅藻的叶绿体基因组中表达。24. 一种分离的栅藻，包括用一种外源核苷酸序列转化的一个叶绿体基因组，其中所转化的栅藻具有的类异戊二烯含量不同于与这种分离的栅藻相同种类的一种未转化的栅藻，并且其中该外源核苷酸序列包括编码一种涉及类异戊二烯生物合成的酶的一种核酸。25.如权利要求24所述的分离的栅藻，其中该核酸不编码一种对映贝壳杉烯合成酶。26.如权利要求24所述的分离的栅藻，其中该核酸被密码子优化用于在该栅藻的叶绿体基因组中表达。27. 一种分离的栅藻，包括用一种外源核苷酸序列转化的一个叶绿体基因组，其中与该分离的栅藻相同种类的一种未转化的栅藻相比，所转化的栅藻具有基于脂肪酸的脂质的积累增加和/或脂质类型的改变，并且其中该外源核苷酸包括编码一种涉及脂肪酸合成的酶的一种核酸序列。28.如权利要求27所述的分离的栅藻，其中该核酸被密码子优化用于在该栅藻的叶绿体基因组中表达。29. 一种用载体转化栅藻的叶绿体基因组的方法，其中该载体包括i) 一个栅藻叶绿体基因组的一个第一核苷酸序列；ii) 一个栅藻叶绿体基因组的一个第二核苷酸序列；iii) 一个第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列包括一个外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列包括编码一种感兴趣的蛋白质的一种核酸，其中该第三核苷酸序列位于该第一与第二核苷酸序列之间，并且其中该载体被用来转化栅藻的叶绿体基因组；以及iv) —种被配置成表达感兴趣的蛋白质的启动子。30.如权利要求29所述的方法，其中该第三核苷酸序列进一步包括编码一种感兴趣的第二蛋白质的一个第二核酸序列。31.如权利要求29所述的方法，其中该启动子是一种PsbD或tufA启动子。32.如权利要求29所述的方法，其中该栅藻是二形栅藻。33.如权利要求29所述的方法，其中该栅藻是斜生栅藻。34.如权利要求29所述的方法,其中该第一核苷酸序列在长度上是至少500bp、至少lOOObp、或至少1，500bp，并且该第一核苷酸序列与该栅藻的基因组的一个第一部分是同源的，并且该第二核苷酸序列在长度上是至少500bp、至少lOOObp、或至少1，500bp,并且该第二核苷酸序列与该栅藻基因组的一个第二部分是同源的。35.如权利要求29所述的方法，其中该第三核苷酸序列在大小上是至少O. 5kb、至少I. Okb、至少2kb、至少3kb、至少5kb、至少8kb、至少llkb、或至少19kb。36.如权利要求29所述的方法，其中该核酸被密码子优化用于在该栅藻的叶绿体基因组中表达。37. —种转化的栅藻叶绿体基因组，它是通过权利要求29所述的方法转化的。38. 一种用至少一种外源核苷酸序列来转化栅藻的叶绿体基因组的方法，该方法包括i)获得该外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列包括编码一种蛋白质的一个核酸序列；ii)使该外源核苷酸序列结合到一种粒子上；并且iii)通过粒子轰击将该外源核苷酸序列射入该栅藻中，其中该叶绿体基因组是用该外源核苷酸序列来转化的。39.如权利要求38所述的方法,其中该外源核苷酸序列在大小上是至少O. 5kb、至少I. Okb、至少2kb、至少3kb、至少5kb、至少8kb、至少llkb、或至少19kb。40.如权利要求38所述的方法,其中该核酸被密码子优化用于在该栅藻的叶绿体基因组中表达。41.如权利要求38所述的方法，其中该粒子是一种金粒子或一种钨粒子。42.如权利要求41所述的方法，其中该金粒子在直径上是大约550nm至大约lOOOnm。43.如权利要求38所述的方法,其中该粒子轰击是通过一种生物射弹装置来进行的。44.如权利要求43所述的方法，其中该生物射弹装置具有大约300psi至大约500psi的氦压力。45.如权利要求43所述的方法，其中该生物射弹装置具有至少300psi、至少350psi、至少400psi、至少425psi、至少450psi、至少500psi、或至少500psi的氦压力。46.如权利要求38所述的方法，其中结合到该粒子上的外源核苷酸序列是在距该栅藻大约2至大约4cm的距离处射击的。47.如权利要求43所述的方法，其中该生物射弹装置是一种Helicos基因枪或一种Accell基因枪。48.如权利要求38所述的方法，其中该核酸编码一种涉及类异戊二烯生物合成的蛋白质。49.如权利要求38所述的方法，其中该核酸编码涉及脂肪酸生物合成的一种蛋白质。50.如权利要求38所述的方法，其中该栅藻是二形栅藻。51.如权利要求38所述的方法，其中该栅藻是斜生栅藻。52. 一种转化的栅藻的叶绿体基因组，它是通过权利要求38所述的方法转化的。53. 一种用于获得绿藻的叶绿体基因组的一个区域的方法，其中该区域在转化该绿藻中是有用的，该方法包括1)获得该绿藻的基因组DNA ;2)获得一种简并正向引物，其 中该正向引物是针对该绿藻的一个PsbB基因；3)获得一种简并反向引物，其中该反向引物是针对该绿藻的一个PsbH基因；并且4)使用步骤2)和步骤3)的这些引物来扩增该绿藻的叶绿体基因组的区域，其中获得了该扩增区的核苷酸序列。54.如权利要求53所述的方法，其中该扩增区是通过PCR来扩增的。55.如权利要求53所述的方法，其中该测序的区域被克隆到一种载体中。56.如权利要求53所述的方法，其中该简并正向引物是引物4099 (SEQID NO :129)或正向引物4100 (SEQ ID NO :130)，并且其中简并反向引物是引物4101 (SEQ IDNO 131)或反向引物4102(SEQ ID NO 132) 0 57.如权利要求53所述的方法，其中该正向引物是引物4099 (SEQ ID NO :129)并且该反向引物是引物4102 (SEQ ID NO :132)。58.如权利要求53所述的方法，其中该扩增区的序列的至少一部分是已知的。59.如权利要求53所述的方法，其中该叶绿体基因组的扩增区来自菜茵衣藻、普通小球藻、斜生栅藻、或紫红紫菜。60.如权利要求53所述的方法，其中该扩增区的序列是未知的。61.如权利要求53所述的方法，其中该叶绿体基因组的扩增区是来自杜氏盐藻(D. tertiolecta)并且包括SEQ ID NO :133的核酸序列；来自未知种类的杜氏藻，包括SEQ ID NO :134的核酸序列；来自N. abudans并且包括SEQ ID NO :135的核酸序列；来自普通小球藻并且包括SEQ ID NO 136的核酸序列；或来自四鞭片藻并且包括SEQ ID NO :137的核酸序列。62.如权利要求53所述的方法，其中该叶绿体基因组的扩增区包括编码基因簇PsbB-psbT-psbN-psbH的一个核苷酸序列。63.如权利要求53所述的方法，其中该叶绿体基因组的扩增区包括编码基因簇psbB-psbT的一个核苷酸序列。64.如权利要求63所述的方法，其中将编码一种基因的一个核酸插入编码PsbB和psbT的核苷酸序列之间。65.如权利要求53所述的方法,其中该叶绿体基因组的扩增区包括编码基因簇psbT-psbN的一个核苷酸序列。66.如权利要求65所述的方法,其中将编码一种基因的一个核酸插入编码psbT和psbN的核苷酸序列之间。67.如权利要求53所述的方法，其中该叶绿体基因组的扩增区包括编码基因簇psbN-psbH的一个核苷酸序列。68.如权利要求67所述的方法,其中将编码一种基因的一个核酸插入编码psbN和psbH的核苷酸序列之间。69.如权利要求53所述的方法，其中该叶绿体基因组的扩增区包括编码基因簇psbH-psbK的一个核苷酸序列。70.如权利要求69所述的方法，其中将编码一种基因的一个核酸插入编码psbH和psbK的核苷酸序列之间。71.如权利要求53所述的方法，其中该叶绿体基因组的扩增区包括编码psbK的3’区的一个核苷酸序列。72.如权利要求53所述的方法，其中该序列是一个核酸序列。73.如权利要求53所述的方法，其中该序列是一个氨基酸序列。74. 一种绿藻的叶绿体基因组的区域，是通过以下方法获得的1)获得该绿藻的基因组DNA ;2)获得一种简并正向引物，其中该正向引物是针对该绿藻的一个psbB基因；3)获得一种简并反向引物，其中该反向引物是针对该绿藻的一个psbH基因；并且4)使用步骤2)和步骤3)的这些引物来扩增该绿藻的叶绿体基因组的这个区域，其中该扩增区被测序并且包括一个核苷酸序列，并且其中该核苷酸序列被修饰以包括编码至少一种蛋白质的一个核酸序列。75. 一种在转化斜生栅藻的叶绿体基因组中有用的载体，该载体包括来自斜生栅藻的叶绿体基因组的一个5. 2kb区域(栅藻叶绿体序列NCBI参考序列NC_008101，057，611-062850bp)，其中该区域包括SEQ ID NO :125的核酸序列，或包括一个与SEQ IDNO : 125的核酸序列的至少一个500bp序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少99%的同源性的核苷酸序列。76. —种分离的核苷酸序列，包括SEQ ID NO :125的核酸，或包括一个与SEQ IDNO : 125的核酸序列的至少一个500bp序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少99%的同源性的核酸序列，其中该分离的核苷酸序列可以用于转化一种栅藻的叶绿、体基因组。77.如权利要求76所述的分离的核苷酸序列，其中SEQ ID NO :125的核酸序列被修饰成包括编码一种蛋白质的一个第二核酸。78. 一种宿主细胞，包括SEQ ID NO :125的核酸序列，或包括一个与SEQ ID NO:125的核酸序列的至少一个500bp序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的同源性的核酸序列。79.如权利要求78所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是来自一种栅藻的宿主细胞。80.如权利要求78所述的宿主细胞，其中SEQ ID NO :125的核酸序列被修饰成包括编码一种蛋白质的一个第二核酸序列。附图简要说明通过以下说明书、随附的权利要求以及附图本披露的这些和其他特征、方面、以及优点将被更好地理解，其中图I显示了用于将DCMUlr工程化到二形栅藻中的突变的psbA片段和3’ UTR载体的图形表示。 图2显示了来自psbA 264A DCMUr转化体(3和4)以及二形栅藻野生型(WT)DNA的扩增和消化。U =未切割的DNA以及C =切割的DNA(用Xbal消化)。图3显示了一个psbA S264转化体，它是DCMUlr以及阿特拉津\图4显不了 p04_38的一个图形表不。图5显不了 p04_21的一个图形表不。图6显示了来自二形栅藻CAMlr转化体DNA的PCR扩增。图7显示了用来转化二形栅藻的载体P04-31的图形表示。图8显示了 BDll克隆的多重筛选。图9显示了表达BDll的SE0070的蛋白质印迹(亲本2和4的亚克隆)。
图10显示了在来自包含木聚糖内切酶基因(亲本2和4)的二形栅藻转化体的澄清溶解产物中的木聚糖内切酶活性。图11显示了 p04-28的一个图形表示。图12显示了在用FPP合成酶工程化的数个二形栅藻系中的同质性(homoplasmicity)的验证。图13显示了在7个转化体中具有法尼基二磷酸(FPP)合成酶蛋白表达的抗flag蛋白质印迹。图14A显示了针对野生型阴性对照(未转化的二形栅藻)、工程化株(用FPP合成酶(禽类)转化的二形栅藻)、以及FPP阳性对照的总离子色谱图(TIC)的叠加。Y轴是丰度。X轴是时间。图14B显示了 FPP阳性对照的TIC。FPP的保留时间是11. 441分钟。Y轴是丰度。X轴是时间。图14C显示了在11. 441分钟时FPP阳性对照的质谱图。Y轴是丰度。X轴是m/z (质荷比)。图14D显示了与IPP和DMAPP —起孵育的工程化株(用FPP合成酶(禽类)转化的二形栅藻)的TIC。该产物(FPP)的保留时间是11. 441分钟。Y轴是丰度。X轴是时间。图14E显示了在11. 441分钟时工程化株(用FPP合酶(禽类)转化的二形栅藻)的质谱图。Y轴是丰度。X轴是m/z(质荷比)。
图14F显示了与IPP和DMAPP —起孵育的未转化的野生型二形栅藻株的TIC。Y轴是丰度。X轴是时间。图14G显示了在11.441分钟时未转化的野生型二形栅藻株的质谱图。Y轴是丰度。X轴是m/z(质荷比)。图15A显示了针对与IPP和DMAPP孵育的野生型阴性对照(未转化的二形栅藻)、与IPP和DMAPP —起孵育的工程化株(用IS09 (FPP合成酶)转化的二形栅藻)、以及FPP阳性对照的总离子色谱图(TIC)的叠加。所有三个酶反应都与紫穗槐二烯合成酶一起孵育从而在偶联酶测定中形成紫穗槐-4，11-二烯。Y轴是丰度。X轴是时间。图15B显示了与紫穗槐二烯合成酶一起孵育的FPP阳性对照的TIC。紫穗槐二烯的保留时间是9. 917分钟。Y轴是丰度。X轴是时间。图15C显示了在9. 917分钟时紫穗槐二烯阳性对照的质谱图。Y轴是丰度。X轴 是m/z(质荷比)。图15D显示了工程化株(用IS09 (FPP合成酶)转化的，与IPP和DMAPP以及紫穗槐二烯合酶一起孵育的二形栅藻)的TIC。该反应产物(紫穗槐二烯)的保留时间是9. 917分钟。Y轴是丰度。X轴是时间。图15E显示了当与IPP、DMAPP、以及紫穗槐二烯合成酶一起孵育时由工程化株(用IS09(FPP合成酶)转化的二形栅藻)产生的产物的质谱图。该产物(紫穗槐二烯)的保留时间是9. 917分钟。Y轴是丰度。X轴是m/z(质荷比)。图15F显示了与IPP和DMAPP以及紫穗槐二烯合成酶一起孵育的未转化的野生型二形栅藻株的TIC。Y轴是丰度。X轴是时间。图15G显示了酶反应的质谱图(在9. 917分钟时)，其中未转化的野生型二形栅藻株与IPP、DMAPP、以及紫穗槐二烯合成酶一起孵育。Y轴是丰度。X轴是m/z(质荷比)。图16显不了 p04_196的一个图形表不。图17A和17B显示了用IS_88(17A)转化的二形栅藻和野生型二形栅藻(17B)SM监测的GC/MS色谱图的比较。使用离子m/z = 229、135、以及122对色谱图进行监测(对于壳梭孢菌素二烯是特征的)。在(17A)中的峰的保留时间(7. 617min)与纯化的壳梭孢素二烯的保留时间匹配。图18A和18B显示了针对二形栅藻-IS88(A)和野生型二形栅藻(B)在壳梭孢素二烯峰的保留时间(t = 7. 617min)时的质谱图。二形栅藻-IS88的质谱图与壳梭孢素二烯已知谱图良好匹配。野生型的质谱图仅显示本底离子。图18C显示纯化的壳梭孢素二烯的质谱图。图19显示了 p04-118的一个图形表示。图20显示了用编码植酸酶(FD6)的基因工程化的二形栅藻的抗-flag蛋白质印迹。图21显不了 p04_162的一个图形表不。图22显示了 EreB基因(SEQ ID NO 25)是从由数种潜在转化体衍生的DNA但不是从由野生型二形栅藻衍生的DNA来扩增的。对照W =无DNA ；+ =质粒DNA ;并且D和O是二形栅藻DNA。图23显不了 p04_161的一个图形表不。
图24显示了 codA平板。图25显不了 p04_267的一个图形表不。图26显示了用FPP合成酶(Is09)和没药烯合成酶(Isll)基因工程化的二形栅藻抗-flag蛋白质印迹,显示了两种蛋白质的表达。图27显不了 p04_116的一个图形表不。图28显示了木聚糖内切酶作为一种单肽(不是与CAT的融合物)产生于工程化的二形栅藻细胞中。图29显示了在工程化的二形栅藻中的木聚糖内切酶活性(操纵子1_1、2_1、2_2、2_3)。+是用psbD驱动木聚糖酶的工程化的二形栅藻，并且“wt”是野生型。图30A和图30B显示了木聚糖内切酶和CAT被转录成一个单个转录本。图30A显示了引物设计并且图30B是一个琼脂糖凝胶，显示了来自相应于木聚糖内切酶-CAT转录本的5个转化体中的4个的cDNA的扩增。图31显示了用不同RBS序列转化的DNA的一个图形表示。在两种情况下，使用来自二形栅藻的PsbD启动子和psbA3’ UTR来调节CAT-RBS-BD11的表达。BDll编码来自里氏木霉的木聚糖内切酶基因。这些盒被亚克隆到载体P04-166中的同源区A与同源区B之间。图32A显示了来自TAP平板的p04_231的木聚糖酶活性。图32B显示了来自TAP平板的P04-232的木聚糖酶活性。检测在用连接CAT和木聚糖内切酶(p04-231)的RBSl工程化的细胞中的木聚糖内切酶活性，但是没有用RBS2 (p04-232)。图33显不了 p04_142的一个图形表不。图34显示了在克隆52 (在psbT和psbN之间的区域中包含CAT盒的工程化的二形栅藻系)中的同质性的验证。图35显示在完全相同的D2 (psbD)启动子区段处从重组获得的转化的DNA(A)和环出产物(B)的图形表示。图36显示在二形栅藻的多重PCR中未能扩增CAT片段。图37显示了 p04-291和p04_294的一个图形表示。BADl和BAD4对应地是来自菠
菜和甜菜的甜菜碱醛脱氢酶基因。图38显示了抗HA蛋白质印迹，显示了在二形栅藻中来自菠菜(291克隆，1、2、3、BADI)或来自甜菜(294 4-l、5-l、6-l、7-l、BAD4)的甜菜碱醛脱氢酶的表达。图39显不了 p45_5和p45_6的一个图形表不。图40在泳道4、5、6中显示了来自杜氏盐藻转化体的EreB扩增的琼脂糖凝胶。图41显不了 p45_12的一个图形表不。图42显示了来自杜氏盐藻转化体12-3的EreB扩增的琼脂糖凝胶。图43显示了通过抗flag蛋白质印迹检测在杜氏盐藻转化体12_3中的木聚糖酶蛋白(BDll)。
图44显示了检测在杜氏盐藻转化体12-3中的木聚糖酶活性。阳性对照是用木聚糖内切酶工程化的二形栅藻。图45显不了无病毒载体pUC(2, 436bp)。图46 显示了 载体 p04-35 (4，304bp)。
图47 显示了载体 pSS_007(6, 132bp)。图48 显示了载体 pSS_013(7, 970bp)。图49 显示了载体 pSS_023(10. 322kb)。图50显示了基因载体I (5，774bp)。图51显示了基因载体2(10. 198kb)。图52显示基因载体3(7，Illbp)。图53 显示了载体 pRS414(4, 784bp)。图54 显示了载体 pBeloBACll (7，507bp)。
图55 显示了载体 pLWOOl (10. 049kb)。图56 显示了载体 pLW092(13. 737kb)。图57 显示了载体 pBeloBAC-TRP(10. 524kb)。图58 显示了载体 pLW100(18. 847kb)。图59 显示了 载体 p04-198。图60 显示了载体 pSS-035 (6，49 lbp)。图61 显示了载体 pSS-023CC93CC94(15. 083kb)。图62 显示了载体 pSS-023CC93CC97(15. 077kb)。图63 显示了载体 pLW100CC90CC91CC92(26. 319kb)。图64显示了载体pLWlOO四基因组装(34. 509kb)。图65 显示了用 NdeI、PacI、PstI、Seal、SnaBI、以及 SpeI 进行的 pSS-023 限制酶切作图。图66 显示了用 EcoRV、NotI、PmlI、PvuUP SnaBI 进行的 pLWOOl 限制酶切作图。图67A-E 显示了用 PacI (c)、PstI (e)、Seal (b)、和 XhoI (d)、以及未切割(a)进行PLW092限制酶切作图。图 68 显示了用 EcoRV、NdeI、NotI、PacI、PstI、Seal 以及 XhoI 进行的 pLfflOO 限制酶切作图。图69 显示了用 EcoRI、EcoRV、KpnI、NotI、PvuIUP Seal 进行的 pSS-035 限制酶切作图。图70显示了包括用NdeI消化的四个双基因重叠群的质粒DNA。图71显示了包括用NdeI消化的两个三基因重叠群的质粒DNA。图72显示了包括用NdeI消化的四个四基因重叠群的质粒DNA。图73显示了来自二形栅藻的保守型psbB-psbT-psbH-psbN基因簇的PCR扩增。图74显不了来自杜氏藻属未知种类的一个株的保守型psbB-psbT-psbH-psbN基因簇的PCR扩增。图75显不了来自N. abudans的保守型psbB-psbT-psbH-psbN基因族的PCR扩增。图76 显示了载体 p04-128。图77 显示了载体 p04-129。图78 显示了载体 p04-130。图79 显示了载体 p04-131。图80 显示了载体 p04_142。
图81 显示了载体 p04_143。
图82 显示了载体 p04_144。图83 显示了载体 p04_145。图84显示了针对来自二形栅藻的克隆的同质性PCR筛选，该二形栅藻在psbT与psbN(p04-142)之间或者在psbN与psbH(p04-143)之间具有一个抗性盒。图85显示了针对来自二形栅藻的克隆进行同质性PCR筛选，该二形栅藻在psbH和psbK(p04-144)之间亦或psbK的3’(p04_145)具有一个抗性盒。图86是来自四种不同藻类种类的psbB基因的核苷酸比对。图87是来自四种不同藻类种类的psbH区域的核苷酸比对。图88是四种不同藻类种类的从psbB基因至psbH基因的基因组区域的比对。图89 是载体 p04-151。图90A-D显示了限制酶作图结果。图91 显示了载体 pLW106。图92A和B描绘了 4种克隆，这些克隆针对BDll和IS99两者进行PCR阳性筛选。图93A-C描绘了 4种克隆，这些克隆针对CC90、CC91、和CC92进行PCR阳性筛选。图94A和B描绘了 2种克隆，这些克隆针对IS61、IS62、IS57以及IS116进行PCR阳性筛选。详细说明提供以下详细说明以帮助本领域的技术人员实践本披露。即使这样，本详细说明不应当解释为不适当地限制本披露，因为本领域普通技术人员可以在在此讨论的实施方案中做出多种修改和变化，而不偏离本披露的精神或范围。如在本说明书以及随附的权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/ 一种”(“a”)、“一个/ 一种”(“an”)、以及“该”包括复数指代。内源的如在此所述的一种内源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是根据与宿主生物的关系而定义的。一种内源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是天然发生在宿主生物中的那些。外源的如在此所述的一种外源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是根据与宿主生物的关系而定义的。一种外源核酸、核苷酸、多肽、或蛋白质是并非天然发生在宿主生物中或处于宿主生物中的不同位置的那些。可以用于在此披露的实施方案中的基因、核酸、蛋白质、以及多肽的实例包括但不限于SEQ ID NO : I 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO :2 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO 3 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO :4 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO 5 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO :6 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO 7 是一个 PCR 引物。
SEQ ID NO :8 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO :9 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO : 10 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO : 11 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO : 12 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO : 13 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO : 14 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO 15 是一个 PCR 引物(#4682)。 SEQ ID NO : 16 是一个 PCR 弓 I 物(#4982)。SEQ ID NO : 17 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO : 18 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO : 19 是一个 PCR 引物。SEQ ID NO 20是通过TEV蛋白酶位点连接到MAT表位标签上的一个人工FLAG表位标签的核苷酸序列。SEQ ID NO :21是针对在莱茵衣藻中的叶绿体表达进行密码子优化的编码来自里氏木霉木聚糖内切酶的基因。SEQ ID NO 22是连接到FLAG表位标签上的人工TEV蛋白酶位点的核苷酸序列。SEQ ID NO :23是针对在莱茵衣藻中的叶绿体表达进行密码子优化的编码来自原鸡的FPP合成酶的基因。SEQ ID NO :24是人工链霉亲和素表位标签的核苷酸序列。SEQ ID NO :25是根据莱茵衣藻叶绿体中最频繁的密码子进行密码子优化的编码来自扁桃假单胞菌的壳梭孢菌素二烯合成酶的基因。SEQ ID NO :26是针对在莱茵衣藻中的叶绿体表达进行密码子优化的编码来自大肠杆菌的植酸酶的基因。SEQ ID NO 27是通过TEV蛋白酶位点连接到MAT表位标签上的一个人工FLAG表位标签的核苷酸序列。SEQ ID NO :28是来自大肠杆菌的修饰的氯霉素乙酰转移酶基因，其中位置64处的核苷酸从A变成G，位置436、437、和438处的核苷酸从TCA变成AGC，并且位置516处的核苷酸从C变成T。SEQ ID NO :29是来自大肠杆菌的修饰的红霉素酯酶基因，其中位置153处的核苷酸从C变成T，位置195处的核苷酸从T变成C，位置198处的核苷酸从A变成C，位置603处的核苷酸从T变成A，位置1194处的核苷酸从C变成T，以及位置1203处的核苷酸从T变成A。 SEQ ID NO :30是来自二形栅藻基因组DNA的片段，它编码包含psbA基因3’端的一部分和某个非翻译区的一个区域，其中对于S264A突变而言该片段的核苷酸1913从T突变成G，并且核苷酸1928至1930从CGT突变成AGA，从而产生一个沉默的XbaI限制酶切位点。SEQ ID NO :31是针对在莱茵衣藻叶绿体中的表达进行密码子优化的编码来自大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶的基因。
SEQ ID NO :32是根据莱茵衣藻叶绿体中tRNA的使用进行密码子优化的编码来自菠菜的甜菜碱醛脱氢酶的基因。SEQ ID NO 33是通过TEV蛋白酶位点连接到6xHIS标签上的人工3xHA标签的核苷酸序列。SEQ ID NO :34是针对在莱茵衣藻叶绿体中的表达进行密码子优化的编码甜菜的甜菜碱醛脱氢酶的基因。SEQ ID NO :35是针对在莱茵衣藻叶绿体中的表达进行密码子优化的编码来自大冷杉的E- α -没药烯合成酶的基因。SEQ ID NO 36是一种修饰的核苷酸序列，该序列是在5’和3’端上具有额外核苷酸的SEQ ID NO 37的反向互补物；核苷酸1_43是在3’端上的额外核苷酸，并且核苷酸532-541是在5’端上的额外核苷酸。 SEQ ID NO :37是来自二形栅藻psbA基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :38是一种修饰的核苷酸序列，该序列是具有在5’端上的额外核苷酸和一个核苷酸插入的SEQ ID NO :39的反向互补物；核苷酸535-716是额外的5’序列，并且核苷酸176-188是该插入。SEQ ID NO :39是针对二形栅藻psbB基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :40是针对二形栅藻psbD基因的内源启动子的一个序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO 41是一种修饰的核苷酸序列，该序列是在5’端上具有额外序列的SEQID NO 42的反向互补物；核苷酸537-464是5’端上的额外序列，核苷酸308从C变成T，核苷酸310从C变成T，并且核苷酸259从A变成G。SEQ ID NO :42是针对二形栅藻tufA基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO 43是一种修饰的核苷酸序列，该序列是在5’端上具有额外序列的SEQID NO :44的反向物；核苷酸550-557是5’端上的额外序列。SEQ ID NO :44是针对二形栅藻rpoA的内源启动子的核苷酸序列。SEQ ID NO :45是针对二形栅藻中的cemA基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID N0:46是一种修饰的核苷酸序列，该序列是在核苷酸233-266处具有插入物的SEQ ID NO 47的反向互补物。SEQ ID NO :47是针对在二形栅藻中的ftsH基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO 48是在5’端上具有额外序列的SEQ ID NO 49的一种修饰的核苷酸序列，核苷酸1-19是额外序列，核苷酸404已经从A变成T。SEQ ID NO :49是针对在二形栅藻中的rbcL基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO 50是在5’端上截短了 24个核苷酸的SEQ ID NO 51的修饰的核苷酸序列；在位置2处的核苷酸从G变成C，位置5从A变成G，在位置199和200处插入两个T，并且在位置472处它从A变成G。SEQ ID NO :51是针对来自二形栅藻的chlB基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。 SEQ ID NO :52是SEQ ID NO :53的一种修饰的核苷酸序列，其中核苷酸1_3是额外序列，在位置442处的核苷酸是一个G插入，并且位置482处的R是较差测序的结果。SEQ ID NO :53是针对二形栅藻中的petA基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :54是一种修饰的核苷酸序列，该序列是SEQ ID NO :55的反向互补物；其中核苷酸3、8、18、21、49、57、和82是插入物，核苷酸484-503是5’端上的额外核苷酸，核苷酸26从C变成T，并且核苷酸30从A变成C。SEQ ID NO :55是针对来自二形栅藻的petB基因的内源启动子的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO 56是在5’端上截短了 3个核苷酸的SEQ ID NO 57的修饰的核苷酸序列。SEQ ID NO :57是针对来自二形栅藻的rbcL基因的内源终止子区的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :58是针对来自二形栅藻的psbA基因的内源终止子区的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :59是针对来自二形栅藻的psaB基因的内源终止子区的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO 60是一个核酸接头序列(RBSl)。SEQ ID NO 61是一个核酸接头序列(RBS2)。SEQ ID NO :62是针对来自杜氏盐藻的psbD基因的内源启动子区的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :63是针对来自杜氏盐藻的tufA基因的内源启动子区的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :64是针对来自杜氏盐藻的rbcL基因的内源终止子区的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。。SEQ ID NO :65是针对来自未知种类杜氏藻分离物的psbA基因的内源终止子区的核苷酸序列，它被克隆到整合载体中。SEQ ID NO :66 是 PCR 引物 I。SEQ ID NO :67 是 PCR 引物 2。SEQ ID NO :68 是 PCR 引物 3。SEQ ID NO :69 是 PCR 引物 4。SEQ ID NO :70 是 PCR 引物 5。SEQ ID NO :71 是 PCR 引物 6。SEQ ID NO : 72 是 PCR 引物 7。SEQ ID NO :73 是 PCR 引物 8。
SEQID NO :74 是 PCR 引物 9。SEQID NO :75 是 PCR 引物 10。SEQID NO :76 是 PCR 引物 11。SEQID NO :77 是 PCR 引物 12。SEQID NO :78 是 PCR 引物 13。SEQID NO : 79 是 PCR 引物 14。SEQID NO :80 是 PCR 引物 15。SEQID NO :81 是 PCR 引物 16。SEQID NO :82 是 PCR 引物 17。SEQID NO :83 是 PCR 引物 18。SEQID NO :84 是 PCR 引物 19。SEQID NO :85 是 PCR 引物 20。SEQID NO :86 是 PCR 引物 21。SEQID NO :87 是 PCR 引物 22。SEQID NO :88 是 PCR 引物 23。SEQID NO :89 是 PCR 引物 24。SEQID NO :90 是 PCR 引物 25。SEQID NO :91 是 PCR 引物 26。SEQID NO :92 是 PCR 引物 27。SEQID NO :93 是 PCR 引物 28。SEQID NO :94 是 PCR 引物 29。SEQID NO :95 是 PCR 引物 30。SEQID NO :96 是 PCR 引物 31。SEQID NO :97 是 PCR 引物 32。SEQID NO :98 是 PCR 引物 33。SEQID NO :99 是 PCR 引物 34。SEQID NO : 100 是 PCR 引物 35。SEQID NO : 101 是 PCR 引物 36。SEQID NO : 102 是 PCR 引物 37。SEQID NO :103包括编码URA3的核酸序列。SEQID NO :104包括编码ADE2的核酸序列。SEQID NO :105包括编码URA3-ADE2的核酸序列。 SEQID NO :106是具有工程化限制酶切位点的核酸接头序列。SEQID NO 107 包括编码 TRP1-ARS1-CEN4 (来自 pYAC4)的核酸序列。SEQID NO :108包括编码LEU2的核酸序列。SEQID NO :109包括编码CC-93的核酸序列。SEQID NO :110包括编码CC-94的核酸序列。SEQID NO :111包括插入到pSS-023中的重叠群序列(CC93-CC94)。SEQID NO :112包括插入到pSS-023中的重叠群序列(CC93-CC97)。
SEQID NO :113包括编码CC-97的核酸序列。SEQID NO :114 包括插入到 pLWlOO 中的重叠群序列(CC90-CC91-CC92)。SEQID NO :115包括编码CC-90的核酸序列。SEQID NO :116包括编码CC-91的核酸序列。SEQID NO :117包括编码CC-92的核酸序列。SEQID NO :118包括编码HIS3的核酸序列。SEQID NO :119包括编码LYS2的核酸序列。SEQID NO :120 包括插入到 pLWlOO 中的重叠群序列(IS57-IS116-IS62-IS61)。SEQID NO :121包括编码IS57的核酸序列。SEQID NO :122包括编码ISl 16的核酸序列。SEQID NO : 123包括对IS62进行编码的核酸序列。SEQID NO :124包括编码IS61的核酸序列。SEQID NO :125是来自斜生栅藻的一个5，240碱基对序列。SEQID NO :126 是 A3 同源区。SEQID NO :127 是 B3 同源区。SEQID NO :128 包括编码 rblcL-CAT-psbE 的序列。SEQID NO : 129 是一个简并 PCR 引物。SEQID NO : 130 是一个简并 PCR 引物。SEQID NO : 131 是一个简并 PCR 引物。SEQID NO : 132 是一个简并 PCR 引物。SEQID NO :133是编码来自杜氏盐藻的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的区域的基因组序列。SEQID NO : 134是编码来自未知种类杜氏藻的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的区域的基因组序列。SEQID NO 135 是编码来自 N. abudans 的 psbB、psbT、psbN、和 psbH 基因的区域的部分基因组序列；N’的一段距离(stretch)表示序列中的空位。SEQID NO : 136是编码来自普通小球藻分离物的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的区域的基因组序列。SEQID NO : 137是编码来自四鞭片藻的psbB、psbT、psbN、以及psbH基因的区域的基因组序列。SEQID NO :138 是 PCR 引物(#4682)。SEQID NO :139 是 PCR 引物(#4982)。SEQID NO : 140 是 PCR 引物 4684。SEQID NO : 141 是 PCR 引物 4685。SEQID NO : 142 是 PCR 引物 4686。、
SEQID NO : 143 是 PCR 引物 4687。SEQID NO : 144 是 PCR 引物 4688。SEQID NO : 145 是 PCR 弓丨物 4689。SEQID NO :146包括编码BDll的核苷酸序列。
SEQ ID NO :147包括编码IS99的核苷酸序列。SEQ ID NO :148包括编码CAT的核苷酸序列。SEQ ID NO :149 至 SEQ ID NO :170 是 PCR 引物。
本披露涉及转化不同藻类种类，例如来自栅藻属和来自杜氏藻属的藻类的方法，用于进行这类转化的载体和核酸构建体，以及使用在此披露的载体和方法生产的重组栅藻和杜氏藻生物。在一个实施方案中，所使用的栅藻是二形栅藻。栅藻是绿藻的成员，是绿藻的不同集合。栅藻是由单细胞或2、4、8或16个线性排列的细胞的扁平菌落集落(coenobialcolony)组成的一个属。这些细胞包含具有淀粉核和单核的单个质体。栅藻是淡水和半咸水浮游生物的普通栖居者，并且不时地形成密集群体。在一个实施方案中，所使用的生物来自杜氏藻属。在另一个实施方案中，该杜氏藻是杜氏盐藻。—个实施方案，本披露提供了用于转化栅藻例如二形栅藻或斜生栅藻的载体。在另一个实施方案中，本披露提供了用于转化杜氏藻例如杜氏盐藻的载体。可以将表达盒构建到适当载体中。在某些情况下，该盒被设计成在宿主细胞中表达一种或多种蛋白质编码序列。可以使用本领域已知的标准技术来构建这类载体。在典型的表达盒中，启动子或调节元件位于其表达是所希望的编码序列的5'或上游侧上。在其他盒中，编码序列侧翼可以是当插入到靶基因组中(例如核或质体)允许进行表达的序列。例如，编码涉及合成感兴趣化合物(例如类异戊二烯)的酶的核酸，从而该酶的表达被天然发生的调节元件控制。可以使用在适当条件下提供表达从而使mRNA或蛋白产物表达到足以生产有用数量的希望化合物水平的任何调节元件。可以将一个或多个额外蛋白编码序列可操作地融合到启动子下游或3'上。可以使用针对单一的蛋白质的编码序列、以及针对两种或更多种蛋白质的融合的编码序列。编码序列还可以包含另外的元件，这些另外的元件允许表达的蛋白质靶向到细胞表面上以及锚定到细胞表面上或者分泌到环境中。选择标记还用于设计载体以便有效地选择被该载体转化的藻类。可以将选择标记和人们希望引入的另一种序列两者引入融合到单个启动子上并且在它的下游。可替代地，可以引入两种蛋白质编码序列，每一个都在启动子控制下。一种构建栅藻或杜氏藻的基因操作株(genetically manipulated strain)的方法涉及用编码感兴趣的基因的核酸的转化，典型地是能够将前体转化成燃料产物或燃料产物前体(例如类异戊二烯或脂肪酸)的酶、生物质降解酶、或用于改善饲料特征的酶。在一些实施方案中，转化可以将核酸引入到宿主藻细胞的任何质体(例如，叶绿体)中。在其他实施方案中，转化可以将核酸引入到宿主细胞的核基因组中。仍然在其他实施方案中，转化将核酸引入到核基因组以及质体两者中。在一些情况下，编码感兴趣的蛋白质(例如转运蛋白或酶)的核酸针对预期插入位点而被密码子偏倚(例如针对插入细胞核中而被核密码子偏倚，针对插入叶绿体中而被叶绿体密码子偏倚)。为了构建载体，在适当启动子控制下表达的基因的上游DNA序列可以被限制性作图，并且对蛋白质表达重要的区域被表征。确定了基因起始密码子的确切位置并且，使用这个信息和限制性图谱，可以设计一种载体，用于通过去除负责编码基因的蛋白质的区域但是留下发现包含负责控制基因的表达的遗传物质的上游区域来表达内源或外源蛋白。典型地将合成寡核苷酸插入到该蛋白质序列曾经所处的位置中，使得可以使用在该合成寡核苷酸中的限制性内切核酸酶位点(即多克隆位点)将任何另外的基因克隆到其中。然后插入在该位点处的不相关基因(或编码序列)可以被控制在现存起始密码子以及上游调节区之下，该上游调节区将驱动由该基因编码的外源(即不是正常存在的)蛋白质的表达。一旦该外源蛋白质的基因进入克隆载体中，可以使用数种方法中的任何一种将它引入到宿主生物中，这些方法中的一些对于宿主生物可以是特定的。关于这些方法的变化充分描述于一般文献中。术语“外源”在此是在比较意义上使用的，是指所提及的核苷酸序列(或多肽)是来自与参考来源不同的一个来源并且与该参考序列不同，或连接到它通常不与之结合的一个第二核苷酸序列上(或多肽)上，或被修饰使得它处于通常不与参考物质结合的一种形式。例如，相对于叶绿体的核苷酸序列，编码一种酶的多核苷酸是外源的，其中该多核苷酸在通常情况下未发现于叶绿体中(例如，编码叶绿体序列或核序列的突变的多核苷酸)。作为另一个实例，相对于宿主生物，编码一种酶的多核苷酸是外源的，其中该多核苷酸包含一种可操作地连接的序列(例如，启动子、同源重组位点、选择标记、和/或终止序列)，这些序列通常未发现于参考生物中。可以通过本领域已知的任何方式分离和/或合成编码酶以及在本披露中有用的 其他蛋白质的多核苷酸，包括但不限于克隆、亚克隆、以及PCR。在此所述的载体可以编码在甲羟戊酸途径中起作用的一种或多种多肽，例如像硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、以及甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶。在其他实施方案中，该多肽是在非甲羟戊酸途径中的酶类，如DOXP合成酶、DOXP还原酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶、4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4，-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、HMB-PP还原酶、或DOXP还原异构酶。一个实施方案是针对包含编码能够调节壳梭孢菌素二烯生物合成途径的酶的核酸的载体。这种载体可以进一步包括用于在藻类中表达核酸的启动子。包括在这类载体中的一种或多种核酸可以含有针对在选择的宿主生物中表达而被优化的密码子偏倚的基因形式。在一个实施方案中，所产生的壳梭孢菌素二烯是壳梭孢菌素_2，10 (14)-二烯。本披露的另一个方面是针对包含编码一种酶的核酸的载体，当将该载体整合到一种生物例如光合藻类的基因组中时其产生壳梭孢菌素二烯，其中在无该载体的情况下该生物不产生壳梭孢菌素二烯并且其中在该生物中壳梭孢菌素二烯是没有代谢活性的。在此进一步提供了生产燃料产物的方法，包括a)转化栅藻或杜氏藻，其中该转化导致壳梭孢菌素二烯的产生或产生增加；b)从该生物中收集壳梭孢菌素二烯；以及c)使用该壳梭孢菌素二烯来生产燃料产物。本披露还考虑了通过用编码一种或多种不同转运蛋白的核酸来转化宿主细胞(例如藻类细胞)和/或包含宿主细胞的生物来制造有助于脂肪酸、脂质或油类的分泌的多肽的宿主细胞。在一些实施方案中，还用有助于脂肪酸类、脂质、或油类的产生的一种或多种酶来转化这些宿主细胞或生物，这些酶是合成代谢酶类。有助于合成脂肪酸的合成代谢酶类的一些实例包括但不限于乙酰辅酶A羧化酶、酮还原酶、硫酯酶、丙二酰转移酶、脱水酶、脂酰辅酶A连接酶、酮脂酰合成酶、烯酰还原酶、以及脱饱和酶。在一些实施方案中，这些酶是分解代谢或生物降解酶类。在一些实施方案中，生产了一种单酶。可以用编码一种或多种酶的多个基因转化一些宿主细胞。例如，单个转化的细胞可以含有编码多种酶的外源核酸，这些酶构成整个合成途径。一个途径实例可能包括编码乙酰辅酶A羧化酶、丙二酰转移酶、酮脂酰合成酶、以及硫酯酶的基因。用整个路径转化的细胞和/或从这些细胞中提取的酶，可以合成脂肪酸合成途径的完整脂肪酸或中间体。这些构建体可以包括同一基因的多个拷贝、编码来自不同生物的相同酶的多基因、和/或在一个或多个编码序列中具有一个或多个突变的多基因。在一些情况下，宿主细胞可以自然产生感兴趣的脂肪酸、脂质、甘油三酯、或油。因此，用编码转运蛋白的多核苷酸转化宿主细胞可以允许从细胞中分泌或增加分泌感兴趣的分子。在其他情况下，用编码对于产生感兴趣分子必需的一种或多种酶的多肽来转化宿主细胞。由这些修饰的细胞产生的酶导致可以从细胞和/或周围环境(例如，生物反应器，生长培养基)中收集的脂肪酸、脂质、甘油三酯、或油类的产生。在一些实施方案中，在通过细胞膜转运蛋白从细胞中分泌产物之后进行脂肪酸、脂质、甘油三酯、或油类的收集。脂肪酸类、脂质或油类的合成还可以通过工程化细胞以表达辅助分子或调节分子来实现。在某些实施方案中，该辅助分子是一种酶，该酶产生一种被脂肪酸合成酶利用的底物。在一些实施方案中，该辅助或调节分子有助于生物质的生长或滋养。 本披露一个另外的方面提供了一种载体，该载体包括编码生物质降解酶的核酸以及配置成在非维管光合生物例如栅藻并且更具体地二形栅藻或杜氏藻中表达核酸的一个启动子。本披露的载体可以包含编码一种以上的生物质降解酶的核酸，并且在其他情况下，可以包括编码共价连接生物质降解酶的多肽的核酸。生物质降解酶类可以包括纤维素分解酶类、半纤维素分解酶类以及木质素分解酶类。更具体地，这些生物质降解酶类可以是外切-@ -葡聚糖酶、内切-@ -葡聚糖酶、& -葡糖苷酶、木聚糖内切酶、或木质酶。编码生物质降解酶类的核酸可以是从真菌或细菌来源获得的，例如编码绿色木霉中的外切-￠-葡聚糖酶、里氏木霉中的外切-P -葡聚糖酶、棘孢曲霉中的外切-P -葡聚糖酶、里氏木霉中的内切-葡聚糖酶、黑曲霉中的内切-￠-葡聚糖酶、里氏木霉中的3 -葡糖苷酶、黑曲霉中的￠-葡糖苷酶、以及黑曲霉中的木聚糖内切酶的那些核酸。编码生物质降解酶类的其他核酸对于这些生物可以是内源的。还提供了一种包括多种载体和一种启动子的组合物，这些载体各自编码一种不同的生物质降解酶，该启动子用于在叶绿体中表达所述生物质降解酶类。这些组合物可以含有编码特定酶的特定载体的多个拷贝。在一些情况下，这些载体可以包含编码纤维素分解酶类、半纤维素分解酶类和/或木质素分解酶类的核酸。更具体地，多个载体可以包含能够表达内切-P -葡聚糖酶、内切-葡聚糖酶、& -葡糖苷酶、木聚糖内切酶、和/或木质酶的载体。该实施方案的一些载体能够插入到叶绿体基因组中并且这样的插入可以导致转化叶绿体的光合作用能力的破坏。将其他载体插入到叶绿体基因组中不破坏转化叶绿体的光合作用能力。一些载体提供了隔离在转化叶绿体中的生物质降解酶类的表达。另一种载体编码了多种不同的生物质降解酶类以及用于在非维管光合生物中表达生物质降解酶类的启动子。该生物质降解酶类可以是一种或多种纤维素分解酶类、半纤维素分解酶类以及木质素分解酶类。在一些载体中，多种不同的生物质降解酶类是外切-￠-葡聚糖酶、内切-葡聚糖酶、3 -葡糖苷酶、木质酶以及木聚糖内切酶。在一些实施方案中，多种酶类是可操作地连接的。在其他实施方案中，多种酶类被表达为一种功能性蛋白质复合体。将一些载体插入到宿主细胞基因组中不破坏该生物的光合能力。编码多种不同酶类的载体可以导致隔离在转化生物的叶绿体中的酶类的产生。本披露还提供了一种藻类细胞，并且具体地是用编码多种不同酶类的载体来转化的栅藻或杜氏藻。对于ー些实施方案而言，可以使生物在缺乏光照和/或存在有机碳源下生长。
仍然在另ー个方面提供了产生ー种或多种生物质降解酶的栅藻或杜氏藻的基因修饰的叶绿体。这些酶类可以是纤维素分解酶类、半纤维素分解酶类或木质素分解酶类，并且更具体地可以是外切-β -葡聚糖酶、内切-β -葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、木聚糖内切酶、木质酶和/或它们的组合。在一些实施方案中，该ー种或多种酶可以隔离在叶绿体中。本披露还提供了包含本披露的基因修饰叶绿体的光合生物。仍然在另ー个方面提供了ー种用于制备生物质降解酶的方法。该方法包括以下步骤(I)转化光合的、非维管生物并且具体地是栅藻或杜氏藻，以产生所述生物质降解酶或使其产生增加，以及(2)从所述转化生物中收集该生物质降解酶。可以用包含多种不同的编码不同生物质降解酶类的载体的组合物来进行转化。还可以用编码多种不同的生物质降解酶类的载体来进行转化。这些酶类的任何ー种或全部能够可操作地彼此连接。在ー些情况下，转化了一种叶绿体。该方法可以具有ー个或多个另外的步骤，包括(a)收获转化的生物；(b)将转化的生物干燥；(C)从细胞培养基中收获酶类；(d)机械破碎转化的生物；或(e)化学破碎转化的生物。该方法还可以包括通过高效液相色谱进ー步纯化酶。本披露的又另ー种方法允许制备ー种生物燃料。这种方法的一个步骤包括用从光合非维管生物获得的ー种或多种生物质降解酶来处理生物质持续足够的时间量，以降解所述生物质的至少一部分。所产生的生物燃料可以是こ醇。这种方法的酶类可以包含从中获得它们的至少痕量的所述光合非维管生物。另外地，在本方法一些实施方案中有用的酶类包括纤维素分解酶、半纤维素分解酶以及木质素分解酶。在本方法ー些方面中有用的具体酶类包括外切-葡聚糖酶、内切-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖内切酶、和/或木质酶。可以用本披露的这种方法来处理多种类型的生物质，包括农业废物、造纸厂废物、玉米秸杆、小麦秸杆、大豆秸杆、柳枝稷、浮萍、白杨树、木屑、锯屑、湿酒糟、干酒糟、人类废物、报纸、再循环纸产物、或人类垃圾。还可以从高纤维素含量的生物(例如柳枝稷或浮萍)中获得生物质。可以从生物中释放本方法中使用的一种或多种酶并且这种释放可以涉及化学或机械破碎该生物的细胞。在一个替代实施方案中，ー种或多种酶是从生物中选择的并且然后从培养基中收集的。处理生物质可以涉及ー种发酵过程，该过程可以使用与产生该一种或多种酶的生物不同的ー种微生物。在一些实例中，可以将非维管光合生物加入糖化罐中。本实施方案还可以包括收集生物燃料的步骤。可以通过蒸馏进行收集。在一些实例中，将该生物燃料与另ー种燃料混合。ー种另外的方法提供为通过转化叶绿体来制造至少ー种生物质降解酶，从而制造了ー种生物质降解酶。该生物质降解酶可以是ー种纤维素分解酶、半纤维素分解酶、或木质素分解酶，并且更具体地可以是外切-葡聚糖酶、内切-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖内切酶、或木质酶。在一些情况下，该生物质降解酶被隔离在转化的叶绿体中。该方法可以进一歩包括通过化学或机械手段破碎转化的叶绿体来释放ー种或多种生物质降解酶。在一些情况下，将通过转化叶绿体来产生多种酶。这些生物质降解酶可以真菌或细菌起源的，例如外切-β -葡聚糖酶、内切-β -葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、木聚糖内切酶、木质酶、或它们的组合。
可以用编码ー种或多种酶的多个基因转化ー些宿主细胞。例如，单个转化细胞可以含有编码整个生物降解途径的外源核酸。ー个途径的实例可以包括编码外切-β -葡聚糖酶(作用于纤维素末端链上)、内切-β -葡聚糖酶(作用于纤维素链内部部分上)、β -葡糖苷酶(通过/降解纤维ニ糖避免反应抑制剂)、以及木聚糖内切酶(作用于半纤维素交联上)的基因。用整个途径转化的这些细胞和/或从它们中提取的酶可以降解生物质的某些组分。构建体可以包括同一基因的多个拷贝、和/或编码来自不同生物的相同酶的多基因、和/或具有在编码序列的ー个或多个部分中的突变的多基因。可替代 地，可以通过用该途径的単独的酶转化宿主细胞并且然后结合产生这些单独的酶的细胞来产生生物质降解途径。这种方法允许通过改变多个转化菌株的相对比率来结合这些酶从而更特定地匹配感兴趣的生物质。例如，可以将两倍的表达ー个途径的第一酶的细胞添加到混合物中，其中该反应途径的第一步骤是限制步骤。在用编码酶的构建体转化之后，使宿主细胞和/或生物生长。可以从这些生物/细胞中收集生物质降解酶。收集可以是通过本领域已知的任何手段，包括但不限于浓缩细胞、机械或化学破碎细胞、以及从细胞培养物中和/或细胞溶解产物中纯化这些酶。可以使细胞和/或生物生长并且然后通过任何手段来收集ー种或多种酶。提取酶的ー种方法是通过收集该宿主细胞或ー个宿主细胞群并且然后将该ー个或多个宿主细胞干燥。然后通过破碎细胞以暴露出酶，从干燥的ー个或多个宿主细胞中收获该一种或多种酶。然后使用压碎细胞的全部产物来降解生物质。从完整细胞中提取蛋白质的许多方法是本领域熟知的，并且也被考虑在此(例如，引入外源核酸构建体，其中酶编码序列可操作地连接到编码分泌信号的序列上-从生长培养基中分离分泌的酶)。还可以通过在宿主细胞中表达包含编码生物质产生-调节分子的核酸的载体来实现提取和使用生物质降解酶。在这个实施方案中，该宿主细胞产生生物质，并且还产生生物质降解酶。然后该生物质降解酶可以降解由该宿主细胞产生的生物质。在一些情况下，用于产生生物质降解酶的载体可以不是持续活性的。这些载体可以包括一种或多种诱导型启动子以及ー种或多种生物质降解酶类。这些启动子激活了生物质降解酶类的产生，例如在生物质已经生长到足够密度或达到一定的成熟度之后。还可以通过将重组核酸分子引入到叶绿体中来实现本发明的方法，其中该重组核酸分子包括ー个第一多核苷酸，该多核苷酸编码至少一种多肽(即，1、2、3、4、或更多种)。在一些实施方案中，多肽可操作地连接到ー个第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或随后的多肽上。例如，可以直接地或者间接地连接生物降解途径中的数种酶，这样使得通过该途径中的一种酶产生的产物一旦产生，就紧密接近该途径中的下ー个酶。另ー个方面提供了在此披露的已经被基因修饰或改性的(例如通过在此披露的方法)用作原料的宿主生物或细胞(例如栅藻或杜氏藻)。在此披露的基因修饰藻类的组合物可以直接地用作原料或可以添加到原料中用来产生修饰的或改进的原料。例如，组合物可以包含原料和转基因的藻类。藻类的基因修饰可以包括将藻类工程化以表达一种或多种酶。在ー些方面，该酶可以是生物质降解酶并且在ー些方面该酶可以是ー种生物合成酶。基因修饰的藻类还可以表达两种类型的酶(例如，生物质降解酶和生物合成酶)。所表达的酶可以是在藻类中天然表达的或在藻类中非天然表达的ー种。在ー些方面，所产生的酶不是该藻类中天然表达的。例如，ー种酶(例如生物质降解酶)可以是ー种外源酶。在另ー个实例中，组合物可以包括ー种原料和ー种基因修饰的藻类，其中该藻类被修饰以増加天然发生酶(例如生物质降解酶)的表达。在ー些方面，ー种酶可以从基因修饰的藻类中分泌或作为独立成分添加到原料中。生物质降解酶类可以通过将原料的复杂组分(例如不消化的组分)分解成可以被动物吸收和使用的组分来改善现有原料的营养价值。生物质降解酶可以在藻类中表达和保留或从藻类中分泌或排出(即离体产生的)。对于藻类的内在营养价值而言，提供生物质降解酶类的基因修饰的藻类还可以被动物利用。例如，组合物可以包含ー种原料、ー种基因修饰的藻类、以及对于该基因修饰的藻类而言是离体的ー种生物质降解酶。在另一个实例中，ー种基因修饰的转基因藻类被修饰，以增加天然发生的生物质降解酶的表达。藻类中的某些外源生物合成酶类的表达可以允许富含营养物的脂质、脂肪酸类以及碳水化合物类的生物合成。可以将表达这类富含营养物的组分的基因修饰的藻类添加到现有的原料中，以补充该原料的营养价值。在ー些方面，这类基因修饰的藻类可以包括多达100%的原料。藻类可以通过基因修饰来产生ー种或多种脂肪酸、脂质或碳氢化合物或使其产生增加。在一个实例中，基因修饰的藻类包括编码类异戊ニ烯生物合成途径中的ー种酶的外源核酸。在ー些方面，与相同种类的未修饰的藻类相比较，基因修饰的藻类可以具有较高含量、或改变含量、或不同含量的例如脂肪酸、脂质或碳氢化合物(例如类异戊ニ烯)。例如，修饰的藻类可以产生更多所希望的类异戊ニ烯，和/或产生该藻类通常不产生的类异戊ニ烯，和/或产生通常产生但是以与未修饰的藻类中产生的不同量的类异戊ニ烯。因此，一方面，组合物可以包括ー种原料和ー种基因修饰的藻类，其中相对于相同种类的未修饰的藻类，该藻类具有较高的脂质、脂肪酸、或类异戊ニ烯含量。生物合成酶类还可以是在甲羟戊酸途径中发现的那些。例如，该酶可以是法尼基焦磷酸合成酶、物牛儿基栊牛儿基磷酸合成酶、角鲨烯合成酶、硫酯酶、或脂肪酰CoA脱饱和酶。一种改进的原料可以完全地或部分地由ー种基因修饰的藻类组成。在ー些方面，可以将基因修饰的藻类添加到组合物中来产生改进的原料。直到添加基因修饰的藻类之后，该组合物才可以被认为是适合于被动物消费的原料。在ー些方面，可以将基因修饰的藻类添加到现有原料中来产生改进的原料。在ー些方面，可以将基因修饰的藻类以至少比率I 20(藻类重量/原料重量)添加到现有原料中。在ー些方面，改进的原料可以包括高达10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^ 100%的基因修饰的藻类。在ー些方面，可以将有活力的基因修饰的藻类以小于原料5% (w/w)的浓度添加到原料中(例如，作为种子培养)，其中基因修饰的藻类繁殖到变成高达10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%的原料(w/w)。原料或改进的原料还可以包括另外的营养物、成分或补充物(例如维生素)。包含基因修饰的藻类的改进原料还可以包含动物饲料的任何常规成分，包括但不限于任何蔬菜、任何植物的果实、种子、根、花、叶、茎、杆、或植物 产物。包括基因修饰的藻类的改进原料还可以包括任何动物部分或产物(例如，肉、骨、乳、排泄物、皮肤)。包括基因修饰的NVPO的改进原料还可以包括制造过程的任何产物或副产物(例如锯屑或啤酒厂废物)。如在此披露的原料或改进原料成分的另外的非限制性实例包括苜蓿、大麦、血粉、草、豆类、青贮饲料、甜菜、骨粉、啤酒糟、啤酒酵母、金雀花草(tooomgrass)、胡萝卜、牛粪、三叶苜蓿、咖啡、玉米、玉米蛋白粉、酒糟、禽脂、葡萄、玉米糁渣、啤酒花叶、废啤酒花、糖蜜、燕麦、藻类、花生、马铃薯、家禽废物、家禽粪便、菜籽柏、黒麦、红花、高梁、大豆、黄豆、向日葵粉、提摩西草、或小黒麦。因此，一方面一种组合物可以包括ー种原料和ー种基因修饰的NVPO，其中该原料包括苜蓿、大麦、血粉、草、豆类、青贮饲料、甜菜、骨粉、啤酒糟、啤酒酵母、金雀花草、胡萝卜、牛粪、三叶苜蓿、咖啡、玉米、玉米蛋白粉、酒糟、禽月旨、葡萄、玉米糁渣、啤酒花叶、废啤酒花、糖蜜、燕麦、藻类、花生、马铃薯、家禽废物、家禽粪便、菜籽柏、黒麦、红花、高梁、大豆、黄豆、向日葵粉、提摩西草、或小黒麦中的ー种或多种。在ー些方面，基因修饰的藻类可以用于ー个目的(例如生产重组产物或生物燃料中)并且它的剰余部分可以用于改进的原料。因此ー种改进的原料可以包括基因修饰的藻类的一部分。例如，动物饲料成分的组合物可以包括整个和/或脱脂藻类(例如，在去除脂肪酸、脂质或碳氢化合物之后，例如在己烷提取之后)或整个和脱脂藻类的混合物，它提供了饲料酶和藻类的内在营养价值两者。在另ー个实例中，基因修饰的藻类可以被洗涤、脱水、离心、过滤、脱脂、溶解、干燥、加工(例如萃取)、或研磨。其剰余部分可以用作原料，用作改进的原料或用作改进原料的补充物。例如，一种组合物可以包含ー种原料和ー种基因修饰的藻类的一部分，其中该基因修饰的藻类至少部分地去除了脂质、脂肪酸、类异戊ニ烯、类胡萝卜素、碳水化合物、或选择的蛋白质。该基因修饰的藻类还可以被基因修饰以产生如在此披露的生物质降解酶。 在此还披露了产生、修饰、补充或改进原料组合物的方法。这些方法可以包括将ー种基因修饰的藻类或其一部分与ー种原料结合来产生改进的原料。在一个实例中，该方法包括从基因修饰的藻类中去除脂质、脂肪酸、类异戊ニ烯、或碳水化合物。可以将剩余的基因修饰的藻类或其一部分与ー种原料结合来产生改进的原料组合物。在本方法的ー个实例中，该修饰的藻类不表达外源植酸酶。该基因修饰的藻类或其一部分可以包括ー种核酸(例如一种外源核酸)。该核酸可以是ー种载体。在本方法的一个实例中，该核酸编码ー种生物质降解酶。该生物质降解酶可以是ー种半乳聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶、糖酶、脂肪酶、还原酶、氧化酶、转谷氨酰胺酶、或植酸酶。该生物质降解酶可以是ー种糖酶，其中该糖酶是ー种α-淀粉酶、β_淀粉酶、内切-β_葡聚糖酶、木聚糖内切酶、β_甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、或支链淀粉酶。该生物质降解酶可以是ー种蛋白酶，其中该蛋白酶是ー种枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、或真菌酸稳定蛋白酶。该生物质降解酶可以是ー种植酸酶。在本方法的另ー个实例中，基因修饰的NVPO进ー步包括编码类异戊ニ烯生物合成途径中的ー种酶的外源核酸。在类异戊ニ烯生物合成途径中的酶可以是法尼基焦磷酸合成酶、物牛儿基栊牛儿基磷酯酸合成酶、角鲨烯合成酶、硫酯酶、或脂肪酰CoA脱饱和酶。类异戊ニ烯生物合成途径中的酶可以是处于甲羟戊酸途径中。在本方法的另ー个实例中，该方法可以进ー步包括在与原料结合之前从基因修饰的NVPO中去除脂质、脂肪酸、或类异戊ニ烯以产生改进的原料。可以从许多生物(包括真核生物、原核生物、或病毒)获得用于动物饲料中的用于指导这些蛋白质(例如酶)在基因修饰的藻类中表达的候选基因。在一些情况下，表达的酶是代谢途径(例如类异戊ニ烯生物合成途径)的ー个成员。可以将数种酶引入到藻类中来产生增加水平的所希望的代谢产物，或可以将数种酶引入以产生包含多种有用饲料酶活性的藻类(例如同时产生木聚糖酶、内切-β -葡聚糖酶、以及植酸酶活性)。饲料酶类可以被表达于宿主生物中(例如栅藻)并且纯化到有用的水平。能够以类似于当前实践的方式将纯化的酶类加入动物饲料中。饲料酶类还可以表达于宿主生物中(例如藻类)并且生成的宿主生物可以作为饲料成分加入,对动物饲料产物同时添加营养价值和所希望的酶活性。在本申请中，可以将基因修饰的宿主生物以活的、整个的并且不能成活的或作为溶解产物添加到原料中，其中该宿主生物通过任何适合的手段而被溶解(例如，物理、化学或热的手段)。许多动物饲料可以含有植物种子，除了别的之外包括大豆、玉米、小麦、以及大麦。植物种子可以含有高水平的肌醇多磷酸酯(植酸)。这种植酸对于非反刍动物是不可消化的，因此具有高水平植酸的饲料可以具有低水平的生物可利用的磷。植酸还可以螯合多种重要的营养矿物质，如钙和镁。将植酸酶结合到饲料中(它可以在动物上部肠中起作用)可以释放螯合的矿质营养素以及显著水平的生物可利用的磷两者。净结果是需要将较少的游离磷加入到动物饲料产物中。此外，可以降低排泄物中的磷水平，从而可能降低下游磷污染。可以将表达植酸酶或类似酶的基因修饰的藻类添加到原料中，以改进饲料营养特性或可消化特性。考虑在此使用的植酸酶可以来自任何生物(例如从细菌或真菌衍生的)。 考虑在此使用的植酸酶类型的非限制性实例包括3-植酸酶(又名I-植酸酶；一种肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3. I. 3. 8)、4_植酸酶(又名6-植酸酶，基于IL-编号系统并且不是基于ID-编号命名，EC3. 1.3. 26)、以及5-植酸酶(EC 3.1.3.72)。另外的植酸酶的非限制性实例包括微生物植酸酶，如真菌、酵母或细菌植酸酶，如EP 684313、US 6139902、EP 420358、WO 97/35017、WO 98/28408、WO 98/28409、JP 11000164、W098/13480、AU724094、WO 97/33976、US 6110719、WO 2006/038062、WO 2006/038128、WO 2004/085638、WO 2006/037328、WO 2006/037327、WO 2006/043178、US 5830732 以及在 UniProt 指定下的 P34753、P34752、P34755、000093、031097、P42094,066037 和 P34754(UniProt, (2008)http://www. uniprot. ovr/)中披露的。与上述任何一种植酸酶的氨基酸序列(包括活性位点)具有至少75%—致性的氨基酸序列的多肽也被考虑在此使用。在一个实例中，组合物可以包含ー种原料和ー种基因修饰的藻类。该基因修饰的藻类可以进行基因修饰，以产生生物质降解酶，如植酸酶。一方面，该植酸酶是ー种细菌或真菌起源的植酸酶。一方面，该生物质降解酶是ー种与植酸酶不同的酶。来自植物(例如像大豆、小麦、以及大麦)的许多植物部分(例如，种子、果实、莖、根、叶和花)包含某些动物(例如非反刍动物)不能消化的多糖。这类碳水化合物的非限制性实例包括木聚糖、棉子糖、水苏糖、以及葡聚糖。动物饲料中不可消化的碳水化合物的存在可能降低营养物的利用率。在禽饲料中的不可消化的碳水化合物可能导致粘性粪便(可能增加疾病水平)。在动物饲料中的一种或多种碳水化合物降解酶(例如α-淀粉酶)的存在可能帮助降解多糖，増加了营养物利用率，増加了动物饲料的生物可利用能含量，以及降低健康风险。考虑在此使用的碳水化合物降解酶类的非限制实例包括淀粉酶类(例如，α -淀粉酶和β -淀粉酶)、β -甘露聚糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶、β -葡聚糖酶、内切-β -葡聚糖酶、葡萄糖异构酶、木聚糖内切酶、α -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、支链淀粉酶、转化酶以及细菌、真菌、植物或动物起源的任何碳水化合物消化酶。在一个实例中，组合物可以包含ー种原料和ー种基因修饰的藻类。该基因修饰的藻类可以进行基因修饰，以产生生物质降解酶，如糖酶。一方面，该糖酶可以是ー种α -淀粉酶、β-淀粉酶、内切-β-葡聚糖酶、木聚糖内切酶、β_甘露聚糖酶、α -半乳糖苷酶、或支链淀粉酶。许多原料包含具有減少动物饲料中营养物利用率的抗营养蛋白(例如，蛋白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂以及其他物质)的植物部分(例如种子)。添加广谱蛋白酶(例如菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、或真菌酸稳定的蛋白酶)可以分解这些抗营养蛋白并且增加动物饲料中的营养物的利用率。考虑在此使用的蛋白酶的非限制性实例包括内肽酶和外肽酶。考虑在此使用的蛋白酶的非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶类(例如枯草杆菌蛋白酶、糜蛋白酶、谷氨酰转肽酶、ニ肽基肽酶、羧肽酶、ニ肽酶、以及氨基肽酶)、半胱氨酸蛋白酶类(例如，木瓜蛋白酶、钙蛋白酶_2、以及木瓜蛋白酶样肽酶和菠萝蛋白酶)、天冬氨酸肽酶类(例如，胃蛋白酶和胃蛋白酶Α)、谷氨酸蛋白酶类、苏氨酸蛋白酶类、真菌酸性蛋白酶类以及酸稳定蛋白酶类，如(US 6855548)中披露的那些。在一个实例中，组合物可以包含ー种原料和ー种基因修饰的藻类。该基因修饰的藻类可以进行基因修饰，以产生生物质降解酶，如蛋白酶。一方面，该蛋白酶可以是ー种枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、或真菌酸稳定性蛋白酶。考虑在此使用的脂肪酶的非限制性实例包括胰脂肪酶、溶酶体脂肪酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性胆固醇酯水解酶、肝酯酶、脂蛋白脂肪酶、胃脂肪酶、内皮脂肪酶、胰脂肪酶相关蛋白2、胰脂肪酶相关蛋白I、舌脂肪酶和磷脂酶(例如磷脂酶Al (EC 3. I. I. 32)、磷脂酶Α2、磷脂酶B (溶血磷脂酶)、磷脂酶C和磷脂酶D)。可以通过使ー种原料与ー种藻类结合来产生改进的原料，该藻类被基因改变以产生ー种酶(例如，糖酶、蛋白酶或脂肪酶)。在ー些方面，该酶是针对该生物离体地产生的。在ー些方面，该酶被分泌。在被动物摄食之前，相对于生物离体产生的酶可以分解原料的组分。因此，可以通过使ー种原料与一种藻类结合并且使该混合物经历保持时间来产生改进的原料，该藻类被基因改变以产生ー种酶(例如，糖酶、蛋白酶或脂肪酶)。保持时间可以允许该基因改变的藻类繁殖并且将更多的酶分泌到原料中。保持时间可以是从数小时一直到数天。在ー些方面，保持时间是持续一直到1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在ー些方面，保存使其是持续一直到数天至数周。在ー些方面，保持时间是无定期的。无定期的保持时间允许间歇地去除和使用改进的原料并且间歇地添加基础原料。宿主细胞或宿主牛物可以从宿主细胞或宿主生物中获得在在此所述的方法和系统中有用的生物质。宿主细胞可以含有编码本披露的多肽的ー种多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞是多细胞生物的一部分。在其他实施方案中，宿主细胞作为单细胞生物培养。宿主生物可以包括任何适当的宿主，例如ー种微生物。用于在此所述方法的微生物包括例如光合细菌(例如，蓝细菌)、非光合细菌(例如，大肠杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母)、以及藻类(例如，微藻，如莱茵衣藻)。 可以用感兴趣的多核苷酸(例如，编码涉及类异戊ニ烯生物合成路径的蛋白质的多核苷酸)转化的宿主生物的实例包括维管和非维管生物。该生物可以是原核的或真核的。该生物可以是单细胞的或多细胞的。宿主生物是包括宿主细胞的ー种生物。在其他实施方案中，该宿主生物是光合性的。光合生物是天然地光合成的生物(例如藻类)或被基因工程化或以别的方式被修饰成光合性的生物。在一些情况下，可以用使光合生物机构(photosynthetic apparatus)的全部或部分不可操作的本披露的构建体或载体来转化光合生 物。作为举例，可以将非维管光合微藻种类(例如莱茵衣藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、緑色杜氏藻、小球藻、以及杜氏盐藻)基因工程化，以生产感兴趣的多肽，例如ー种壳梭孢菌素ニ烯合成酶或ー种FPP合成酶。通过将这些微藻工程化以在藻类叶绿体或细胞核中表达壳梭孢菌素ニ烯合成酶或FPP合成酶，可以实现在这些微藻中产生壳梭孢菌素ニ烯合成酶或FPP合成酶。在其他实施方案中，该宿主生物是ー种维管植物。这类植物的非限制性实例包括多种单子叶植物和双子叶植物，包括高油种子植物例如高油种子芸苔属(例如，黑芥、欧洲油菜、白芥、芜青、白菜型油菜、埃塞俄比亚芥、以及芥菜型油菜)、黄豆(Glycine max)、盧淋+ (Ricinus communisノ、ネ吊花、红花(Carthamus tinctorius)、向日葵(Helianthusannuus)、亚评木(Linum usitatissimum)、玉米(Zea mays)、挪子(Cocos nuciferaノ、ネ示榈(Elaeis guineensis),油坚果树如橄榄(Olea europaea)、芝麻、和花生(Arachishypogaea)，以及拟南芥属、烟草、小麦、大麦、燕麦、苋菜、马铃薯、水稻、番茄、以及豆类(例如豌豆、菜豆、小扁豆、苜蓿等)。该宿主细胞可以是原核的。本披露的一些原核生物的实例包括但不限于蓝细菌(例如，聚球藻、集胞藻、旋藻、粘球藻、颤藻以及假鱼腥藻)。适当的原核细胞包括但不限于任何以下多种实验室菌株大肠杆菌、乳酸菌、沙门菌、以及志贺菌。(例如，如Carrier等人(1992)《免疫学期刊》(J. Immunol.) 148 :1176-1181 ;美国专利号 6，447，784 ;以及 Sizemore等人(1995)《科学》(Science)270 :299-302中说明的)。可以用于本披露中的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。适合的志贺菌株包括但不限于弗氏志贺菌、索氏志贺菌、以及痢疾志贺菌。典型地，该实验室菌株是非致病性菌株。其他适合的细菌的非限制性实例包括但不限于恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、mevalonii假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、类球红细菌、荚膜红细菌、深红红螺菌、以及红球菌属。在一些实施方案中，该宿主生物是真核的(例如，绿藻、红藻、褐藻)。在一些实施方案中，该藻类是ー种绿藻类，例如一种绿藻(Chlorophycean)。该藻类可以是单细胞的或多细胞的。适合的真核宿主细胞包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、以及藻类细胞。适合的真核宿主细胞包括但不限干巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母、柳毕赤酵母、松栎毕赤酵母(Pichia guercuum)、皮杰普毕赤酵母、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、斯巴达克毕赤酵母、酿酒酵母、酵母菌属、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属、乳酸克鲁维酵母、白色念珠菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、铼孢霉属、禾谷铼孢菌、镶片铼孢菌(Fusarium venenatum)、粗糙脉孢菌、以及莱茵衣藻。在其他实施方案中,宿主细胞是微藻类(例如莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、二形栅藻、小球藻、緑色杜氏藻、或杜氏盐藻)。在一些情况下，该生物是红藻、绿藻、不等长鞭毛藻(heterokontophyte)、黄绿藻(tribophyte)、灰藻(,glaucophyte)、chloraracnniophyte> 眼虫藻(euglenoid)、定鞭藻(haptophyte)、隐藻(cryptomonad)、双鞭藻(dinof Iagellum)、或浮游微藻(pnytopiankton)。在一些情况下，宿主生物是维管和光合性的。维管植物的实例包括但不限于被子植物、裸子植物、红藻门植物、或其他维管植物。在一些情况下，宿主生物是非维管性和光合性的。如在此所使用，术语“非维管光合生物”是指任何宏观或微观生物，其包括但不限于藻类、蓝细菌和光合细菌，其不具有如在维管植物中发现的维管系统。非维管光合生物的实例包括苔藓，例如地钱门植物(marchantiophyte)或角苔门植物(anthocerotophyte)。在一些情况下，该生物是一种蓝细菌。在一些情况下，该生物是藻类(例如巨藻或微藻)。该藻类可以是单细胞或多细胞藻类。例如，可以用一种载体或它的一个线性部分转化微藻莱茵衣藻，从而编码一种或多种感兴趣的蛋白质(例如一种涉及类异戊二烯生物合成途径的蛋白质)。藻类转化的方法在美国临时专利申请号60/142，091中进行了说明。本披露的方法可以使用藻类例如微藻莱茵衣藻来进行。根据本披露的方法使用微藻来表达肽或蛋白复合物提供的优点是，可以使大量微藻生长(包括商业上的(Cyanotech公司；Kailua_KonaHI))，因此允许生产并且如果希望的话分离大量的所希望的产物。 本披露的载体也许能够稳定地或瞬时地转化多种光合生物，包括但不限于光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻门、原绿藻门、红藻门、绿藻门、不等鞭毛门、黄绿藻植物门(tribophyta)、灰色藻门(glaucophyta)、chlorarachniophytes、裸藻门、眼虫藻、定鞭藻门、金藻门、隐藻门、隐藻、甲藻门、双鞭藻门、定鞭金藻门(pyrmnesiophyta)、硅藻门、黄藻门、黄绿藻门(eustigmatophyta)、针胞藻门(raphidophyta)、褐藻门、以及浮游植物。本披露的其他载体能够稳定地或瞬时地转化例如莱茵衣藻、海洋微绿球藻、盐生微绿球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、二形栅藻、绿色杜氏藻、或杜氏盐藻。适当宿主的实例包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9 ;动物细胞，如CH0、C0S或Bowes黑色素瘤；腺病毒类；以及植物细胞类。适当宿主的选择被认为是在本领域的技术人员的了解范围内。将如在此说明的选择和分离的多核苷酸引入到适合的宿主细胞内。适合的宿主细胞是能够促进重组和/或还原性再分布(reductive reassortment)的任何细胞。选择的多核苷酸可以是例如在包括适当控制序列的载体中。宿主细胞可以是例如一种高等真核细胞，如一种哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞，或该宿主细胞可以是一种原核细胞如一种细菌细胞。可以通过例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔来进行将构建体(载体)引入宿主细胞中。重组多肽(包括蛋白复合物)可以表达于植物中，允许生产这类植物作物并且因此能够方便地生产大量的所希望的产物。因此，可以使用任何植物来实践本披露的方法，包括例如微藻和巨藻(例如海藻和海草)以及在土壤中生长的植物。在一个实施方案中，该宿主细胞是一种植物。术语“植物”在此广泛地用来指含有质体(如叶绿体)的一种真核生物，并且包括处于发育任何阶段的任何这类生物、或指植物的一部分，包括植物插条、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、植物种子、以及小植株。植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单细胞或培养的细胞的形式，或可以是高等组织单位的一部分，例如植物组织、植物器官、或植物。因此，植物细胞可以是一种原生质体、配子产生细胞、或再生成全植物的一个细胞或细胞集合。像这样，包括多个植物细胞并且能够再生成全植物的种子被认为是用于本披露目的的植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、或组织成结构或功能单位的任何其他植物细胞群。特别有用的植物部分包括可收获部分以及用于繁殖子代植物的部分。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，例如花、花粉、幼苗、块茎、叶、茎、果实、种子、以及根。用于繁殖的植物的一个部分包括例如种子、果实、插条、幼苗、块茎、以及根茎。本披露的方法可以产生含有基因组DNA(例如，核和/或质体基因组DNA)的植物，该植物被基因修饰以含有稳定整合的多核苷酸(例如，Hager和Bock，《应用微生物生物技术》(Appl. Microbiol. Biotechnol.) 54 :302-310, 2000 中所说明的)。因此，本披露进一步提供了含有一个或多个叶绿体的一种转基因植物例如莱茵衣藻，这个或这些叶绿体含有编码一个或多个外源或内源多肽(包括可以允许分泌燃料产物和/或燃料产物前体(例如，类异戊二烯、脂肪酸、脂质、甘油三酯)的多肽)的多核苷酸。本披露的光合生物包括被修饰成产生例如一种燃料产物或一种燃料产物前体的至少一种宿主细胞。
用于所披露的实施方案中的一些宿主生物是，例如极端微生物，如超嗜热菌、嗜冷性细菌、低溫菌、嗜盐微生物、嗜压微生物以及嗜酸菌。可以用于实践本披露的一些宿主生物是嗜盐的(例如,盐生杜氏藻、绿色杜氏藻、或杜氏盐藻)。例如,盐生杜氏藻可以生长在海水和盐湖(例如盐度从千分之30至千分之300)以及高盐度培养基(例如人工海水培养基、海水营养琼脂、半咸水培养基、以及海水培养基)中。在本披露的一些实施方案中，表达本披露蛋白的宿主细胞可以生长于液体环境中，该液体环境是例如0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3. 0、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4. 0、4. 1、4. 2、4. 3 摩尔或更高浓度的氯化钠。本领域普通技术人员应当理解的是其他盐(钠盐、钙盐、钾盐、或其他盐)也可以存在于这些液体环境中。当嗜盐生物用于本披露中时，可以用在此所述的任何载体将其转化。例如，可以用能够插入叶绿体或核基因组中的并且含有编码一种蛋白质(例如，一种FPP合成酶或一种壳梭孢菌素二烯合成酶)的核酸的载体转化盐生杜氏藻。然后可以使转化的嗜盐生物生长于高盐环境中(例如盐湖、盐池、以及高盐培养基)以产生感兴趣的产物(例如，脂质)。产物的分离可以涉及在从该生物中提取产物之前从高盐环境中移出转化的生物。在产物分泌到周围环境中的情况下，在对产物进行任何进一步处理之前，使该液体环境脱盐可能是必需的。本披露进一步提供了包括遗传修饰的宿主细胞的组合物。组合物包括一种遗传修饰的宿主细胞，并且在一些实施方案中可以包括一个或多个另外的组分，这些组分是部分基于预期使用遗传修饰的宿主细胞而选择的。适合的组分包括但不限于盐类、缓冲剂、稳定齐U、蛋白酶抑制剂、细胞膜-和/或细胞壁-保护性化合物，例如甘油和二甲基亚砜、以及适合于该细胞的营养培养基。为了生产蛋白质，例如一种类异戊二烯或类异戊二烯前体化合物，宿主细胞可以是例如产生或已经被基因修饰用来产生在异戊二烯基转移酶途径和/或甲羟戊酸酯途径和/或类异戊二烯生物合成途径中的一种或多种酶的一种细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是产生异戊二烯基转移酶、类异戊二烯合成酶或甲羟戊酸酯途径酶的底物的一种细胞。
在一些实施方案中，基因修饰宿主细胞是包括内源甲羟戊酸酯途径和/或类异戊二烯生物合成途径和/或异戊二烯基转移酶途径的一种宿主细胞。在其他实施方案中，基因修饰宿主细胞是这样一种宿主细胞，该宿主细胞在通常不经由甲羟戊酸途径产生甲羟戊酸酯，或经由异戊二烯基转移酶途径产生FPP、GPP或GGPP，但是已经用包括编码一个或多个甲羟戊酸途径、类异戊二烯合成酶途径或异戊二烯基转移酶途径的酶的核苷酸序列的一个或多个多核苷酸基因修饰(例如，如美国专利
发明者A·卡兰, B·奥奈尔, K·博施, M·门德斯, S·塞卡, W·莱文 申请人:蓝宝石能源公司