专利名称：水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrx8、重组表达载体和制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特别涉及水稻叶绿体硫氧还蛋白基因还涉及该基因的重组表达载体和制备方法。
背景技术：
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)广泛地存在于生物界中，是一种低分子量 (12KD)、有还原双硫键活力的蛋白质。硫氧还蛋白都含有高度保守的活性位点，其保守的活性位点为Trp-Cys-Gly-Pro-Cys,保守活性位点中存在两个还原性的Cys残基。在还原态， 硫氧还蛋白具有促使目标蛋白中_■硫键打开的作用。植物体中的硫氧还蛋白最初是在叶绿体中发现的，被认为是光合作用中一些关键酶的活化调节蛋白，后来在细胞质和线粒体中也发现了硫氧还蛋白，它们在结构和功能上都有所差异。并且植物中包含很多硫氧还蛋白异构体，并将这些异构体分为不同的亚型，如h型、f■型、m型、c型等。其中，h型硫氧还蛋白被NADPH和NADPH-硫氧还蛋白还原酶所还原；f型和m型为叶绿体硫氧还蛋白，被铁氧还蛋白依赖的系统所还原。叶绿体硫氧还蛋白主要调节光依赖酶，在光照条件下，硫氧还蛋白催化目标蛋白二硫键的打开并激活目标蛋白；在黑暗条件下，硫氧还蛋白处于氧化态不具有活性。经研究发现，水稻基因组中至少含有30个编码硫氧还蛋白的基因，按其在染色体上的顺序统一命名为OsTrxf 30，分为5个亚群分别为m型，h型，x型，f型和pdil型。 有报道称水稻叶绿体硫氧还蛋白0sTrX23，是一种冷胁迫诱导的蛋白，在体外对丝裂原活化蛋白激酶3 (0sMPK3)和丝裂原活化蛋白激酶6 (0sMPK6)具有负调控。水稻叶绿体硫氧还蛋白0sTrx29是一种m型叶绿体硫氧还蛋白，利用RNAi抑制0sTrx29基因表达后，导致叶绿体发育异常，植株生长延迟。水稻叶绿体硫氧还蛋白0sTrx8属于m型硫氧还蛋白，但其相关功能迄今为止尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS的核苷酸序列；目的之二在于提供所述水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS的重组表达载体，目的之三在于提供水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8的重组表达载体的制备方法，为水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS在水稻中的功能研究提供了有力的工具。I、水稻叶绿体硫氧还蛋白基因( Ti-xS,所述水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8 的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。2、含有所述水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS的重组表达载体。进一步，所述重组表达载体为重组干扰表达载体flsT^^-RNAi，所述干扰重组表达载体是在pENTR/D-TOPO载体的克隆位点中插入水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrx8, U IOVO-OsTrxS载体，再将所得TOPO-GsT^rS载体与pANDA载体同源重组而得。3、所述重组表达载体的制备方法，具体步骤如下从水稻中克隆水稻叶绿体硫氧CN 102533810 A
还蛋白基因0sTrx8并连接pENTR/D-T0P0载体，得TOPO-GsT^rS载体，将所得TOPO-GsT^rS 载体与pANDA载体进行同源重组，得重组干扰表达载体ttsT^^-RNAi。本发明的有益效果在于本发明提供了一个水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS, 为研究水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS的功能奠定了基础，还构建了含有水稻叶绿体硫氧还蛋白基因的重组表达载体，并且该载体为干扰重组表达载体，在植物细胞中能够干扰水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8的表达，因此可以通过水稻叶绿体硫氧还蛋白基因功能缺失观察水稻表型的变化，从而得到水稻叶绿体硫氧还蛋白基因
基因在水稻中的功能；还公开了水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS的重组表达载体的制备方法，其制备方法简单，为研究0sTrx8基因在水稻中的功能提供了有力的工具。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图I为水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8电泳图2为水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8的时空差异表达图。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例中使用的材料使用的水稻品种为水稻日本晴(Oryza Sativa L)由重庆市农业科学研究院提供；M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶pfu、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、PMD19-T载体、Trizol试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、入-Hind III DNA Marker 及 DL2 000 DNA Marker 购自 TaKaRa 公司；DNA Marker III购自天根生化科技(北京)有限公司；氨节青霉素(Ampici 11 in, Amp)和卡拉霉素 (Kanamycin, Kan)为Sigma公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；pENTR D-T0P0 克隆试剂盒(货号为K2400_20)购自Invitrogen公司；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌JM109、农杆菌GV3101由本实验室保存。实施例I、水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8的克隆
以水稻日本晴(fl Sativa L)为材料，取叶片少许，迅速放入液氮中研磨成粉末，按照 Trizol试剂盒说明书提取总RNA。所得水稻叶片总RNA的电泳结果显示主带清晰完整，28S 和18S的条带亮度比约为2:1，说明RNA的浓度和纯度符合实验要求，可以用于合成双链 cDNA。以所得水稻叶片总RNA为模板，按照M-MLV逆转录酶说明书，使用Oligo (dT)引物进行逆转录获得第一链cDNA。在水稻基因组注释项目(http://rice.plantbiology.msu.edu/ca/gene_ fams/5_8. shtml)数据库中进行假定功能搜索,搜索到43个与硫氧还蛋白相关的基因，选择座位为L0C_0s09g07570的基因，其描述为编码具有催化能力的铁硫氧还蛋白酶基因， 经预测表明为叶绿体前体。我们把它命名为水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS。根据Genbank中登陆的序列,利用Primer 5. 0和Oligo 6. 0软件设计水稻叶绿体硫氧还蛋白基因 fefnS 特异引物，上游引物 0sTrx8Y :5’ -caccatggcggccttcacctcc-3’ (SEQ ID No. 2), 下划线部分为接头序列；下游引物 flsrnSR :5’- caacctccaaagcactctcaatct-3’(SEQ ID No. 3)。以逆转录获得的第一链cDNA为模板，采用水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS特异引物OsTrxS 和OsTrxl并用高保真DNA聚合酶pfu进行PCR扩增，PCR反应条件为 94°C预变性4分钟；然后94°C变性30秒，60°C复性30秒，72°C延伸2分钟，共32个循环； 最后72°C延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳显示在500-600bp处有单一的特异性条带，即水稻叶绿体硫氧还蛋白基因，结果如图I所示。检测后，按 DNA凝胶回收试剂盒说明书进行切胶回收纯化；纯化的DNA片段与pMD19-T载体在T4 DNA 连接酶作用下于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小后测序，得重组载体PMD19T-OsTrxS,菌液送上海英骏生物技术有限公司，测序验证片段准确性。测序结果显示，获得的水稻硫氧还蛋白基因0sTrx8为含有507个核苷酸，编码169个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID No. I 所示。实施例2、水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8的时空差异表达
分别取幼苗期根、幼苗期茎、幼苗期叶、分蘖期根、分蘖期茎、分蘖期叶和开花期穗为材料，分别按照上述总RNA提取方法提取不同时期不同部位的总RNA，得幼苗期根RNA、幼苗期茎RNA、幼苗期叶RNA、分蘖期根RNA、分蘖期茎RNA、分蘖期叶RNA和开花期穗RNA。分别以提取的总RNA为模，按照M-MLV逆转录酶说明书，使用Oligo (dT)引物进行逆转录获得第一链 cDNA，所得第一链cDNA用于进行半定量RT-PCR分析水稻叶绿体硫氧还蛋白0sTrx8基因的时空差异表达。以水稻肌动蛋白actin为内参，上游引物为5’-aggaaggctggaagaggacc_3’ (SEQ ID No. 4),下游引物为 5，-cgggaattgtgagggacat-3，(SEQ ID No. 5),分别取等量的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性2分钟，94°C变性35秒，58°C 退火I分钟，72°C延伸2分钟，反应25个循环，再72°C后延伸7分钟。取5 y L PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度调整模板浓度，至各样本在等量模板条件相同扩增所得 actin的PCR产物量一致，此时的模板用于水稻硫氧还蛋白基因OsTrxS的时空差异达分析。 以调整模板浓度后的第一链cDNA为模板，上游引物如SEQ ID No. 2所示，下游引物如SEQ ID No. 3所示，PCR程序如下94°C预变性2分钟，94°C变性45秒，59°C退火45秒，72°C延伸I分钟，反应40个循环，最后72°C后延伸7分钟，4°C保存。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，如图2所示。由图2可知，actin扩增结果显示初始模板的拷贝数基本保持一致，水稻硫氧还蛋白基因OsTrxS扩增结果显示水稻硫氧还蛋白基因OsTrxS主要在幼苗期叶和分蘖期叶中表达，在幼苗期根、幼苗期茎、分蘖期根、分蘖期茎和开花期穗组织基本不表达，这就表明0sTrx8基因在叶绿体功能上的发挥作用。实施例3、0sTrx8基因重组干扰载体的构建
利用实施例I中PCR扩增所得水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8与pENTR/D-T0P0 载体连接，得重组载体，命名为TOPO-Gs将所得重组载体TOPO-GsT^rS转化大肠杆菌 DH5 a感受态细胞，挑取阳性克隆，经液体培养基培养后提取质粒，即TOPO-GsT^rS质粒，用分光光度计测定OD■和OD■的吸光值，计算重组质粒TOPO-的拷贝数。取10 nglQ Q-0sTrx8 质粒加入 10 y L Gateway 系统的 pANDA 载体，TOPO-fe质粒与 pANDA 载体利用同源重组原理获得重组表达载体，命名为&财i，获得的重组表达载体为干扰重组表达载体。随后将重组干扰载体0sTrx8-RNAi采用冻融法转化根癌农杆菌GV3103感受态细胞，得含重组干扰载体0sTrx8-RNAi的农杆菌GV3103，命名为GV3103_tts， 然后于-80 °C保存备用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.水稻叶绿体硫氧还蛋白基因( 其特征在于所述水稻叶绿体硫氧还蛋白基因 OsTrxS的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.含有权利要求I所述水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrxS的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为重组干扰表达载体AsT^rS-RNAi，所述重组干扰表达载体是在pENTR/D_T0P0载体的多克隆位点中插入水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8，得TOPO-GsT^rS载体，再将所得TOPO-GsT^rS载体与 pANDA载体同源重组而得。
4.权利要求2或3所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下从水稻中克隆水稻叶绿体硫氧还蛋白基因0sTrx8并连接pENTR/D-T0P0载体，得TOPO-GsT^rS载体，将所得TOPO-Gs载体与pANDA载体进行同源重组，得重组表达载体ttsT^rS-RNAi。
全文摘要
本发明公开了水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrx8，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，还公开了水稻叶绿体硫氧还蛋白OsTrx8基因的重组表达载体及其重组表达载体的制备方法，其制备方法简单，为研究水稻叶绿体硫氧还蛋白基因OsTrx8在水稻中的功能提供了有力的工具。
文档编号C12N15/66GK102533810SQ20121004946
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者康振辉, 张筱娟, 王贵学, 黄俊丽 申请人:重庆大学