一种小菜蛾抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种小菜蛾抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新的抗菌肽，本发明还涉及所述抗菌肽的制备方法和应用。此外，本发明还涉及表达小菜蛾抗菌肽的基因工程菌。
背景技术：
长期以来，无论人类还是动植物的细菌性疾病的防治都是难以彻底解决的难题。 自上世纪30年代发现青霉素后，各种天然、合成、半合成的抗生素被广泛应用于抵抗各种微生物的感染。然而大量使用抗生素又带来了一系列新问题，其中最主要的一点是耐药性菌株的产生。细菌对抗菌药物的耐药，使得曾一度广泛使用、疗效佳的药物在临床治疗中失去抗菌活性。畜牧业生产中大量耐药性菌株的产生，造成抗感染治疗难度增加、治疗周期延长、新药的使用周期变短；此外多重耐药菌株的增加和扩散，还给人类疾病的防治乃至环境带来了威胁。细菌耐药性的问题推动了人们探求新型抗菌药物的决心。随着人类对脊椎动物免疫反应的认识，抗菌肽逐渐走入人们的视野，近年来更成为药物研究方面的重点。昆虫是世界上较大的生物种群，据估计其种类多于106种，除海洋外，其他生态环境都有昆虫的分布。但昆虫并不具有高等生物类似的免疫体系，即昆虫缺乏B和T淋巴细胞系统，也无免疫球蛋白及补体存在.然而昆虫能在自然界占据极大的物种优势，说明其具有独特的免疫能力及防御系统。在这一体系中起着重要作用的就是抗菌肽。抗菌肽(antimicrobial peptides)是在诱导条件下，昆虫产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽类物质的总称，具有“传统抗生素”无法比拟的优越性不会诱导抗药菌株的产生，有希望成为新一代抗囷剂。1975 年瑞典科学家 G. Boman 等人(Steinerhd et al. Nature, 1981，292:246-248) 从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名为 cecropin。此后，许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代，有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来，在继续对大型经济昆虫进行研究的同时，又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物， 抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点，其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重视。 目前已发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生物界，包括细菌、动植物和人类。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成，在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用，更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有广谱杀菌作用，大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用，有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。对某些真菌、原生动物，尤其对耐药性细菌有杀灭作用，并能选择杀伤肿瘤细胞，抑制乙型肝炎病毒的复制。并且大多数抗菌肽的抑菌机制不同于抗生素，不是通过作用于细菌某些特定位点来阻断其生物大分子的合成，因此不易受细菌耐药性产生机制的影响。同时抗菌肽符合抗感染药物抗菌谱广、作用明显，不良反应小等优点，所以将抗菌肽作为新的抗菌药物来开发，前景相当广阔。
昆虫抗菌肽多为30—45个氨基酸残基组成，分子量小，4kD左右，没有免疫原性， 通常等电点在10左右，耐热，不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解。根据抗菌肽氨基酸组成和结构特征，可以将昆虫抗菌肽分为以下几类
(I)具有两亲α -螺旋结构的抗菌肽此类抗菌肽分子不含半胱氨酸，不形成二硫键， 有两亲性α-螺旋结构，属于阳离子型抗菌肽，在昆虫抗菌肽中发现较早、数量较多。如 Cecropins，最初发现于惜古比天蚕体内，目前已经从鳞翅目和双翅目昆虫中分离出20多种cecropin类似物。其共有的特点是通常由30-40个氨基酸残基组成，在肽链的两端都形成α-螺旋结构，N端通常呈碱性，带正电荷，亲水；C端通常为酰胺化。中性，不带电荷或带少量负电荷，疏水。此类抗菌肽的抗菌谱广泛，对细菌、真菌及病毒的感染甚至癌细胞都有作用，通过在细胞膜上形成电势依赖通道(voltage-dependent channel),改变细胞膜的通透性，使细胞内容物泄漏而杀菌。(2)分子内含有二硫键的抗菌肽这类抗菌肽的分子中也形成两亲α-螺旋结构，但由于含有半胱氮酸残基，所以分子内还形成二硫键。如Insect defensins,首先从肉蝇(Phormia terranovae)中分离得到，与哺乳动物防御素高度同源。除双翅目昆虫外，在半翅目、鞘翅目、膜翅目、毛翅目和蜻蜒目中均发现了此类昆虫防御素。(3)富含 Pro 或 Arg 的抗菌妝(Proline—rich or arginine-rich peptides) 这类抗菌肽一般含有12 — 35个氨基酸残基，又可分为两类一类为不含取代基结构，如来自于蜜蜂的apidaecin等；另一类含糖基化位点结构,如来自于果蝇的Drosocin有一个与 Thr残基相连的N-乙酰半乳糖胺-半乳糖结构，而Pyrrhocoricin则在相应位置上连有 N-乙酰半乳糖胺。一旦去除分子中的糖基。抗菌活性也随之消失.这类抗菌肽多数只对革兰氏阴性菌有效。(4)富含Gly的抗菌肽此类抗菌肽分子量相对较大些，如Attacins(20kD)、 Sarcotoxins (30kD)、Diptericins (9kD)等.后两者还有以下共同特点C端富含甘氨酸,而 N端脯氨酸则较多，对部分革兰氏阴性菌有效。20多年来，人们对抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究，其作用及机理如下
抗菌肽的抗菌作用及其机理抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道，造成细菌细胞膜结构破坏，引起胞内水溶性物质大量渗出，而最终导致细菌死亡。抗菌肽分子首先结合在质膜上，接着其分子中的疏水段和两亲性α-螺旋也插入到质膜中， 最终通过膜内分子间的相互位移，抗菌肽分子聚集形成离子性通道，使细菌失去膜势而死亡。但是 Gazit 等(Gazit E et al. Biochem is try, 1994，33 (35) : 10681-10692)得出的实验结果表明，抗菌肽只是结合到了单位膜的表面上，并未插入膜中，更未形成通道。 然而，抗菌肽的作用靶部位是细菌细胞质膜，以及抗菌肽的作用结果是导致细菌细胞质膜通透性增大等基本内容是确切无疑的，这也正是抗菌肽与青霉素等传统抗生素对细菌作用机制不同的本质所在。抗菌肽的抗病毒作用及其机理研究发现烟芽夜蛾幼虾
的血淋巴对6种DNA、RNA病毒有明显的抑制作用，使病毒感染力迅速降低，而且这种抗病毒活性具有广谱性° Mariam (Mariam E et al. International J of Antimicrobial Agents, 1999, 13:57-60)试验表明来源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins类抗菌肽具有抗疱疹病毒-HSV的作用，还发现人的嗜中性粒细胞防御素(HNP-I)对一种疱疹病毒有抑制作用。此外，蜂毒素和天蚕素也可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒HIV-I的基因表达，从而抑制减少HIV-I的增殖。这表明抗菌肽对于当今人类的顽症——艾滋病也有抑制作用。 抗菌肽的抗寄生虫作用及其机理抗菌肽可以有效地杀灭产生人类及动物寄生虫病的寄生虫，如疟疾、Chagas氏病、莱什曼病等。目前发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤作用，起作用的靶目标是细胞质膜，它可以快速降低 H- OH+的通透性，破坏膜电势，质膜形态也受到损坏。Shahabuddin(Shahabuddin M et al. Experimental Parasitogy, 1998, 89 (I) : 103-112)研究发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显的损伤。 抗菌肽对肿瘤细胞作用及其机理国内外已对抗菌肽杀伤肿瘤细胞的作用进行了广泛研究，发现抗菌肽对体外培养的癌细胞的作用主要是使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体出现空泡化，嵴脱落。核膜界限模糊不清，有的核膜破损，核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成，细胞骨架也受到一定程度的损伤(王芳等.生物化学与生物物理进展，1998，25 (I) : 64-67;贾红武等·蚕业科学，1996，22 (4) : 62)。通过对荷瘤小鼠的研究证明，抗菌肽能显著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的积累；对S180肉瘤和M14宫颈癌的抑瘤率亦达30%-50%(许玉澄等·动物学研究，1998，19(4) :263-268)。抗菌肽还可以调动机体的免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌瘤的入侵。抗菌肽和干扰素、补体一样是机体非特异性天然防御系统的重要组成部分。机体受损伤或病原微生物入侵时，能迅速产生抗菌肽来杀伤入侵者，它对正常真核细胞几乎没有作用，而且许多抗菌肽在100°c加热IOmin条件下仍能保持一定活力，且对较大的离子强度和较低或较高的P H都有较强的抗性。另外，因为抗菌肽的合成速度非常快(假定核糖体上肽键合成速率不变，抗菌肽的产生比I gM要快100多倍)，而且小肽的扩散比大的蛋白质和免疫细胞更加迅速，作用更显灵活，所以Boman曾指出，抗菌肽是机体的一种理想的一线防御物。与普通抗生素相比，抗菌肽的“抗菌谱”更广，除了抗细菌外， 有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、有包膜的病毒及癌细胞(对癌细胞的选择性作用可能与其细胞骨架的改变有关)，同时能加速免疫和伤口愈合过程。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒、抗感染等方面具有良好的应用前景。更为重要的是，由于抗生素的滥用导致菌株产生了抗性，人们需要寻找新的抗菌药剂。抗菌肽这种从生物体中获得的物质恰巧具有独特的抗菌机理，不是像一般的抗生素那样通过阻断生物大分子的生物合成来发挥作用，因而极有希望开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。 抗菌肽的天然产量低，合成或从机体中提取步骤复杂、产率低、价格相当昂贵，利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。抗菌肽所携带的碱性氨基酸使其对蛋白酶非常敏感，必须采用融合表达策略以抵消其碱性并降低其对宿主细胞的毒性。谢维等合成了家蚕抗菌肽CMIV基因，并将其克隆到金黄色葡萄球菌A蛋白和IgG亲合的结构域ZZ的融合表达载体中，得到Pezz318-CMIVV质粒，以此质粒转化E. coliHBlOl,得到ZZ-CMIV融合表达的蛋白，用 CNBr切割后，得到CMIV肽。李秀兰等(李秀兰等.中国生物化学与分子生物学报，1999， 15 (3) : 387-391)对天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了 50%的改动，根据E. coli偏爱的密码子人工合成了肽基因片断，重组到测序载体，再将此片断重组到表达载体Pet-28上进行表达，融合蛋白经CNBr裂解后，具有与天然抗菌肽相同的生物活性。吴映雅等将柞蚕抗菌肽D基因连接在牛成纤维细胞生长因子cDNA的上游，在酵母中成功地得到了表达，表达产物具有抗菌活性和牛成纤维细胞生长因子的抗原性。Kevin等(Kevin L P, Melissa H B , Rober E ff. Gene. 1993, 134:7-13)将 HNP(human neutro philpeptide I)和 CEME (synthet iccecropin/meIittinhybrid)分别与GST (glutathione-S-trans ferase)、 ORRF> IgG 结合序列及 SPA (staphylococcal protein A)在 E. coli 或 S. aureus 中融合表达，结果在S. aureus中虽实现了与SPA的融合分泌表达,但表达产量较低；Zhang (Zhang L et al. Biochem Biophys. Res. Commun. 1998，247:674-680)选择RepA蛋白的序列作为抗菌肽的融合表达伴侣，并插入Histag等序列作为纯化亲和位点，实现了在E. coli中的融合表达。Christsnen B等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一个供体抗菌肽的活性都高。然而，由于抗菌肽分子小，分离提纯存在一定的困难，故天然资源有限。化学合成和基因工程法获得抗菌肽是主要手段，但化学合成抗菌肽成本高，而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，则可能对宿主有害而不能获取表达产物。作为一种新的潜在的抗菌药物，随着抗菌肽在抗革兰氏阴性和阳性菌活性方面的研究的深入，抗菌肽正引起越来越多的关注，然而，缺乏低成本的有效的大规模生产抗菌肽的方法，正成为制约抗菌肽作为药物应用的瓶颈。正因为如此，许多生物表达系统被逐步建立以生产抗菌肽，比如原核生物大肠杆菌表达系统，以及真核的酵母表达系统。尽管如此， 在这些表达系统中，仍然要面临许多问题抗菌肽经常是以融合蛋白的形式在原核宿主中进行表达，以消除天然抗菌肽对宿主自身的毒性。由于抗菌肽结构与功能的紧密联系，作为融合伴侣的部分(常常是含有各种酶切位点的亲和标签)，需要在融合蛋白表达纯化后经过酶或者化学因子的切割，来释放出真正有抗菌活性的具天然结构的抗菌肽。可是，融合蛋白纯化后进行酶切(或者化学因子切割)，再经过纯化，得到有活性的抗菌肽的过程是一个费时且成本高的过程。而酵母表达体系中，抗菌肽的表达周期长、目的蛋白的产量低，大规模生产的成本高，都是该系统的缺点。因此，现在急需建立一种新的抗菌肽的表达方法，来满足目前对抗菌肽研究乃至商业化的需要。

发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种来自于小菜蛾的cecropin家族的抗菌肽 pxCECAl以及编码该抗菌肽的基因。本发明的第二个目的在于提供上述抗菌肽的用途。本发明的第三个目的在于提供制备上述抗菌肽的方法。本发明的第四个目的在于提供表达上述抗菌肽的基因工程菌。为实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种小菜蛾抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 7 (其成熟肽序列)所示。本发明抗菌肽具有对不同细菌的抑菌和杀菌活性，并且其对某些抗生素抗性菌的抗菌活性，为取代传统的化学抗生素类药物，开发出具有新靶点抗菌谱广且不易诱导产生抗药性的多肽类抗生素提供了研究基础。进而，本发明提供所述抗菌肽在制备抗菌药物、抗病毒药物或抗肿瘤药物中的用途。所述细菌包括但不限于例如金黄色葡萄球菌atfreiAs)、绿脓杆菌 iPseudomonas aerwgifliosa )、短小芽抱杆菌{Bacillus 應i/iAs)、枯草芽抱杆菌{Bacillus
6subtilis)等等，以及耐药性细菌，如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌。本发明还提供包括所述抗菌肽的药物，包括上述抗菌药物、抗病毒药物及抗肿瘤药物。本发明还提供编码上述抗菌肽的基因，其可以是SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。本发明进一步提供含有上述基因的载体，例如表达载体，其出发载体来自pTWINl ； 含有所述载体的宿主细胞，例如大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明还提供了一种制备上述蛋白的方法，本发明方法是将纯化标签(标签蛋白)、内含肽以及上述抗菌肽融合表达。纯化标签通过内含肽与抗菌肽连接，从而在有效纯化的基础上，通过内含肽的自切作用，得到不含标签的抗菌肽。优选构建 CBD-intein-pxCECAl 融合蛋白。具体地，本发明将pxCECAl插入到质粒pTWINl中得到重组表达载体pTWINl-pxCECAl，并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经筛选得到基因工程菌株 pTWINl-pxCECAl-BL21(DE3)，该基因工程菌已于2012年2月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国湖北省武汉市武汉大学)，分类命名为大肠埃希氏菌{Escherichia co7i)BL21 (DE3)-pTWINl-pxCECAl FompT hsdSB(rBmg) gal dcm (DE3)保藏号为CCTCC NO: 2012013。利用该基因工程菌株E. coli BL21(DE3) (pTWIN- pxCECAl)，可表达基因工程重组小菜蛾抗菌肽融合蛋白CBD-intein-pxCECAl。该基因工程菌对融合蛋白的表达量高，表达稳定，利于产业化生产。本发明还提供所述抗菌肽的基因工程制备方法，包括下列步骤克隆编码上述抗菌肽的基因，将该基因插入pTWINl质粒,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3),筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达得到融合蛋白CBD-intein-pxCECAl，经其自切得到所述的抗菌肽。具体地，可以利用上述基因工程菌来制备所述小菜蛾抗菌肽pxCECAl，包括下列步骤
A.基因工程菌株的发酵及上清制备将所述大肠杆菌接种2X YT培养基中，经O. ImM IPTG在15°C下诱导过夜；发酵菌液离心得到菌体后，超声波破碎菌体，离心后得到细胞粗提物上清；
B.融合蛋白的挂柱分离以及柱上自切将破碎得到的上清，缓慢通过装有几丁质珠的纯化柱，以10倍柱体积的结合缓冲液洗填料；之后将柱内缓冲液pH值调至6. O,放置4°C 36小时；
C.目的蛋白小菜蛾抗菌肽pxCECAl的洗脱收集以及纯化浓缩用洗脱缓冲液缓缓洗脱几丁质柱，收集洗脱液；以30KD的超滤管超滤，取超滤后的穿漏液，再以IOKD的超滤管浓缩即得。上述方法简单易操作，省时并能有效降低生产成本。并首次利用了 MPACT-TWIN 系统来表达纯化抗菌肽，该系统的优点在于利用可诱导的具有自切割活性的蛋白质——内含肽，来分离纯化目的蛋白，省去了费时费钱的酶切过程，而且达到了切割和纯化同步完成的效果，省时省力，纯化后的目的蛋白pxCECAl经鉴定能达到很高的纯度，同时也显示了 pxCECAl对革兰氏阴性菌和阳性菌的较高的抗菌活性。本发明小菜蛾抗菌肽pxCECAl基因的克隆方法步骤如下
I.小菜蛾幼虫用人造饲料养至五龄，将大肠杆菌E. coli JM109培养至对数生长期，用针蘸大肠杆菌菌液后刺小菜蛾幼虫腹部，24小时之后，按照RNA提取试剂盒的方法提取其虫体的总RNA后，通过RT-PCR得到总cDNA。根据GenBank上已经发表的小菜蛾抗菌肽 cecropin家族的同源序列，设计并合成引物，以上述得到的总cDNA为模板，PCR扩增得到 pxCECAl基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到PCR2. I载体中，挑取单克隆用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。2.根据信号肽分析软件的分析，以及参考关于cecropin家族抗菌肽翻译后修饰的文献，去掉信号肽部分以及蛋白质N端的丙氨酸和脯氨酸，重新设计引物，以上述 PCR2. I-pxCECAl为模板，PCR扩增编码成熟肽的pxCECAl基因。将PCR产物组装入pGEM_T 载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含pxCECAl的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。本发明表达基因工程融合蛋白CBD-intein-pxCECAl的大肠杆菌基因工程菌株的构建及诱导表达的具体方法如下
I.融合基因的制备及表达载体的构建
设计引物，两端分别加上PStl以及sapl的酶切位点，以pGEM-T-pxCECAl重组质粒为模板，对pxCECAl进行扩增，扩增后的目的片段回收后，与载体pTWINl —起用以上两种限制性内切酶进行酶切，酶切产物回收后用T4连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌JM109并送测序鉴定，得到含有重组质粒pTWINl-pxCECAl的大肠杆菌克隆。2.大肠杆菌基因工程菌的制备
将质粒pTWINl-pxCECAl转化到感受态BL21 (DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达融合蛋白CBD-intein-pxCECAl的基因工程菌株。3.基因工程融合蛋白的表达
将重组表达质粒pTWINl-pxCECAl的单菌落接种到LB (含100 μ g/mL氨苄青霉素)培养基中，37 °C培养至A9600为O. 6，37 °C过夜，第2天活化菌液以4%接种到新鲜的LB (含 100 μ g/mL氨苄青霉素)培养基中，37 °C培养至A9600为O. 6时(约3小时)加入终浓度为 O. lmmol/L IPTG，15°C诱导过夜后，离心 4000rpm，4°C，25min 收集菌体，用 Buffer BI (20 mM HEPES, pH 8.5，500 mM NaCl, and I mM EDTA)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破碎后， 离心收集上清。本发明小菜蛾抗菌肽pxCECAl的分离纯化具体方法如下
发酵破碎后的上清，以每分钟O. 5-1. O ml的流速穿过装有IOml床体积几丁质珠的柱子，柱子预先以BI平衡。重复一次上柱，以使融合蛋白充分与几丁质珠结合。用300ml的BI 洗柱子，以去除未结合的杂蛋白，之后用Buffer B2(20 mM HEPES, pH 6.0，500 mM NaCl, and I mM EDTA)平衡柱子，并将柱内填料及融合蛋白浸于B2中，将柱子置于4°C两天。两天后，用B2将柱子内释放的目的蛋白洗脱，并用YM-10及YM-30的超滤管对洗脱的目的蛋白进行纯化以及浓缩除盐。纯化后的目的蛋白利用Triicine-SDS法检测表达量及蛋白纯度，用MALDI-T0F-MS检测目的蛋白pxCECAl的分子量。在本发明的一个实施例中提供了几种小菜蛾抗菌肽pxCECAl活性鉴定的方法，证明本发明所涉及的小菜蛾抗菌肽pxCECAl能有效的抑制和杀灭受测的几种革兰氏阳性菌和阴性菌，而且对某些抗生素抗性菌也有很好的抑杀效果。同时该实施例中还证实了，小菜蛾抗菌肽pxCECAl作用于细菌的细胞膜，造成细菌细胞内溶物外泄而导致细菌死亡的作用机制。本发明通过RT-PCR等方法，得到了一种之前未报导过的小菜蛾抗菌肽基因 pxCECAl，在经过序列比对及分析后，得到有活性的成熟肽序列，并通过表达纯化，测定了该抗菌肽对不同细菌的抑菌和杀菌活性，更证实了其对某些抗生素抗性菌的抗菌活性，为取代传统的化学抗生素类药物，开发出具有新靶点抗菌谱广且不易诱导产生抗药性的多肽类抗生素提供了研究基础。本发明还利用内含肽在适当PH和温度下自切的特性，构建了表达载体pTWINl-pxCECAl和基因工程菌株pTWINl_pxCECAl_BL21 (DE3)。这一表达系统的优势在于，表达量大，表达后的分离纯化简单，不需要额外的酶切步骤来处理纯化后的融合蛋白，只用在特定PH和温度下诱导融合蛋白的自切，是的分离纯化与目的蛋白的释放合二为一，省去了大量金钱和时间上的投入，为今后抗菌肽在研究或者商业领域的大量生产提供了一种新颖而简便的方法。与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于本发明抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有不同程度的抑制作用，而且对某些抗生素抗性菌也有很好的抑杀效果，该抗菌肽展示了较强的广谱抗菌活性。此外，本发明表达纯化抗菌肽的方法能保持天然的氨基酸序列，并保证其生物活性，并且该方法简单、成本低。


图I是小菜蛾总RNA得提取和反转录PCR调去小菜蛾抗菌肽基因pxCECAl的电泳图，其中I.小菜蛾免疫前总RNA ;2.小菜蛾免疫后总RNA ;3. Marker D2000 ；4.内参小菜蛾actin基因；5.小菜蛾抗菌肽基因pxCECAl。图2是重组表达质粒pTWINl- pxCECAl的构建流程图。图3是融合蛋白及目的蛋白的SDS-PAGE电泳图，左图基因工程大肠杆菌表达融合蛋白 CBD-intein- pxCECAl,其中 M :Fermentas Protein Marker ； I.未诱导；2.诱导后；3.诱导后上清；4.几丁质柱穿漏液。右图融合蛋白在不同pH下，自切割效率比较， 其中 M Fermentas Protein Marker ;1· pH 5. 5 ；2. pH 6. O ；3. pH 7. O ;4· pH 8. 5。图4四不同温度下融合蛋白自切后洗脱的目的蛋白电泳图，左图融合蛋白在 220C自切后洗脱目的蛋白pxCECAl。M NEB Protein Marker ；1. 12小时后洗脱的pxCECAl ；
2.24小时后洗脱的pxCECAl ;3· 36小时后洗脱的pxCECAl ;4· 48小时后洗脱的pxCECAl。 右图融合蛋白在4°C自切后洗脱目的蛋白pxCECAl。M NEB Protein Marker ；1. 12小时后洗脱的pxCECAl ；2. 24小时后洗脱的pxCECAl ；3. 36小时后洗脱的pxCECAl ；4. 48小时后洗脱的pxCECAl。图5是pxCECAl对大肠杆菌生长抑制曲线。图6.是pxCECAl对MRSA1381生长抑制曲线。图7是pxCECAl对大肠杆菌及MRSA1381杀菌作用曲线。图8是过氧化氢酶释放实验结果。图9是小菜蛾抗菌肽pxCECAl的蛋白质序列。下划线部分为信号肽序列，方框部分为翻译后编辑剪切掉的氨基酸残基。
具体实施例方式下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法若未特别说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。实施例I小菜蛾总RNA的提取 (I)小菜蛾的免疫
小菜蛾幼虫用人造饲料养至五龄，将大肠杆菌E. coli JM109培养至对数生长期，用针蘸大肠杆菌菌液后刺小菜蛾幼虫腹部，24小时之后提取其虫体的总RNA。(2)总RNA得提取
A.10-30mg组织加入Iml TRIzol，用一次性研磨杵充分匀浆，样品加入TRIzoI后，室温放置5min，使样品充分裂解。B.每Iml TRIzol加入200 μ I氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3_5 min使其自然分相。C. 4°C 12，OOOrpm离心10-15min。样品会分成三层黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中。D.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4°C 12,000 rpm离心IOmin,弃上清，RNA沉淀于管底。E. RNA沉淀中加入Iml 75%乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每Iml TRIzol加入Iml 75%乙醇。F. 4°C 5, 000-8, 000 rpm离心l_2min,弃上清；短暂快速离心，用移液器小心
吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2分钟晾干沉淀。G.溶解RNA，沉淀中加入 50-100 μ I RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70°C保存。实施例2小菜蛾抗菌肽pxCECAl基因的克隆
(I)合成pxCECAl cDNA的第一条链
按照Reverse Transcription System试剂盒说明书，以Oligo (dT)2Q为引物合成cDNA 第一链。反应体系如下，依次将以下试剂加入经DEPC水处理并灭菌过的PCR管中
权利要求
1.小菜蛾抗菌肽PXCECA1，其具有SEQID N0:2或SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求I所述抗菌肽的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.权利要求3所述载体转化的基因工程菌。
5.大肠杆菌(万co7i)BL21(DE3)-pTWINl_pxCECAl，其保藏号为 CCTCC NO: M 2012013。
6.权利要求I所述抗菌肽的基因工程制备方法，包括下列步骤克隆权利要求2所述基因，将该基因插入PTWINl质粒，转化大肠杆菌coli BL21 (DE3)，筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达得到融合蛋白CBD-intein-pxCECAl，经其自切得到权利要求I所述的抗菌肽。
7.一种制备权利要求I所述小菜蛾抗菌肽pxCECAl的方法，包括下列步骤A.基因工程菌株的发酵及上清制备将权利要求5所述大肠杆菌接种2XYT培养基中，经O. ImM IPTG在15°C下诱导过夜；发酵菌液离心得到菌体后，超声波破碎菌体，离心后得到细胞粗提物上清；B.融合蛋白的挂柱分离以及柱上自切将破碎得到的上清，缓慢通过装有几丁质珠的纯化柱，以10倍柱体积的结合缓冲液洗填料；之后将柱内缓冲液pH值调至6. O,放置4°C 36小时；C.目的蛋白小菜蛾抗菌肽pxCECAl的洗脱收集以及纯化浓缩用洗脱缓冲液缓缓洗脱几丁质柱，收集洗脱液；以30KD的超滤管超滤，取超滤后的穿漏液，再以IOKD的超滤管浓缩即得。
8.权利要求I所述抗菌肽在制备抗菌药物或抗病毒药物中的应用。
9.权利要求I所述的抗菌肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.含有权利要求I所述的抗菌肽的药物。
全文摘要
本发明公开了一种新的来自小菜蛾的抗菌肽pxCECA1，其氨基酸酸序列如SEQ ID No.2所示，本发明还公开了编码该抗菌肽的基因、含有所述基因的载体以及含有所述载体的基因工程菌。本发明还公开了所述抗菌肽的制备方法，其是利用IMPACT-WIN系统对其进行表达纯化。本发明提供的重组的基因工程菌株在IPTG的诱导下，融合蛋白CBD-intein-pxCECA1以可溶的形式得到高效表达，通过自切得到pxCECA1，其对几种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抗菌活性。
文档编号C12N15/70GK102603884SQ20121004925
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者孟小林, 徐进平, 王健, 王宏 申请人:武汉大学