专利名称：：一种筛选以神经酰胺糖脂为作用靶标的抗真菌物质的方法
技术领域：
：本发明涉及一种筛选以神经酰胺糖脂为作用靶标的抗真菌物质的方法。
背景技术：
：植物防御素(plantdefensin)是一类植物中普遍存在的广谱抗真菌短肽,对植物抵御病原真菌入侵起着关键作用。其中来自红萝卜的植物防御素RsAFP2机制目前相对比较清楚，RsAFP2抑菌作用是通过与真菌细胞膜中神经酰胺糖脂(glucosylceramide)的结合而实现的。RsAFP2对人和植物没有毒性，这是由于RsAFP2不能与人和植物的神经酰胺糖脂结合。因此，研发作用机制类似于植物防御素RsAFP2的农药是实现植物真菌病害绿色防控的理想途径。利用微生物大量表达植物防御素是实现其规模化应用的理想模式，然而，由于植物防御素的合成方式特殊，大量表达很难实现，严重地限制了其在农业上的应用。因此，筛选微生物等其它来源的靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质将是更为有效和可行的途径，而目前尚无特异性筛选方法的报道。目前抗真菌物质的筛选方法主要是平板法。常规平板法虽然是一种活体筛选方法，但其工作量大、筛选到的抗真菌物质的靶标与毒性均不清楚，需要进一步通过大量实验进行阐明。
发明内容本发明的目的是提供一种筛选以神经酰胺糖脂为作用靶标的抗真菌物质的方法本发明提供的筛选靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的方法，包括如下步骤A:将野生真菌菌株和突变菌株分别在含有待测物质的固体平板上进行培养，如果突变菌株在平板上的生长情况优于野生真菌菌株在平板上的生长情况，所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂；所述突变菌株为将所述野生真菌菌株的神经酰胺糖脂代谢途径相关基因进行功能缺失得到的菌株。所述筛选靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的方法还可包括如下步骤B和/或步骤C:步骤B:将所述野生真菌菌株的孢子分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支，所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质；步骤C:将所述野生真菌菌株的菌丝分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支，所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质。所述步骤A中，所述神经酰胺糖脂代谢途径相关基因为序列表的序列I所示的神经酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神经酰胺糖苷转移酶基因。所述步骤A中，所述野生真菌菌株为构巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28。所述步骤A中,所述突变菌株为构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-I或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1已于2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCNo.5806。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1又称构巢曲霉barA基因突变体。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13已于2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCNo.5807。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13又称构巢曲霉gcsl基因突变体。所述步骤A中，所述培养条件可为28°C培养3d。以上步骤A中，所述固体平板具体可为MAG固体平板。所述步骤B中，所述培养条件可为28°C培养8-12h。所述步骤C中，所述培养条件可为28°C培养3-6h。所述步骤B和/或所述步骤C中，所述液体培养基具体可为MAG液体培养基。所述待测物质可为微生物提取物、植物提取物或中药提取物等，也可为化合物。本发明还提供了一种鉴定待测物质是否是靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的方法，包括如下步骤D:将野生真菌菌株和突变菌株分别在含有待测物质的固体平板上进行培养，如果突变菌株在平板上的生长情况优于野生真菌菌株在平板上的生长情况、所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质，如果突变菌株在平板上的生长情况与野生真菌菌株在平板上的生长情况没有显著差异、所述待测物质为候选的非抗真菌物质或候选的不含抗真菌物质的物质；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂；所述突变菌株为将所述野生真菌菌株的神经酰胺糖脂代谢途径相关基因进行功能缺失得到的菌株。所述鉴定待测物质是否是靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的方法还可包括如下步骤E和/或步骤F步骤E:将所述野生真菌菌株的孢子分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支、所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支与在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支没有显著差异、所述待测物质为候选的非抗真菌物质或候选的不含抗真菌物质的物质；步骤F:将所述野生真菌菌株的菌丝分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支、所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支与在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支没有显著差异、所述待测物质为候选的非抗真菌物质或候选的不含抗真菌物质的物质。所述步骤D中，所述神经酰胺糖脂代谢途径相关基因为序列表的序列I所示的神经酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神经酰胺糖苷转移酶基因。所述步骤D中，所述野生真菌菌株为构巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28。所述步骤D中,所述突变菌株为构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-I或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13ο所述步骤D中，所述培养条件可为28°C培养3d。所述步骤D中，所述固体平板具体可为MAG固体平板。所述步骤E中，所述培养条件可为28°C培养8-12h。所述步骤F中，所述培养条件可为28°C培养3-6h。所述步骤E和/或所述步骤F中，所述液体培养基具体可为MAG液体培养基所述待测物质可为微生物提取物、植物提取物或中药提取物等，也可为化合物。本发明还保护构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1,它的保藏编号为CGMCCNo.5806。本发明还保护构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13,它的保藏编号为CGMCCNo.5807。本发明还保护构巢曲霉UV-I和/或构巢曲霉UV-13在筛选抗真菌物质中的应用；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂。本发明还保护真菌的神经酰胺合成酶编码基因和/或神经酰胺糖苷转移酶基因在筛选抗真菌物质中的应用；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂。所述神经酰胺糖脂代谢途径相关基因具体可为序列表的序列I所示的神经酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神经酰胺糖苷转移酶基因。所述真菌具体可为构巢曲霉野生菌株A28。本发明所依据的原理如下植物防御素RsAFP2等靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的作用机制是通过与真菌细胞膜中神经酰胺糖脂(glucosylceramide)的结合而实现的。真菌存在两种参与神经酰胺糖脂合成的酶神经酰胺合成酶和神经酰胺糖苷转移酶。因此，真菌中的上述两种酶任一或全部功能的缺失都会致使突变体细胞膜中神经酰胺糖脂含量降低或丧失，从而对这类抗真菌物质的敏感性降低或丧失。此外，靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质还具有引起真菌菌丝过度分叉的特点，可以作为进一步验证的方法。本发明建立的方法不仅靶标明确，而且将活体筛选与活性检测集于一体，仅根据突变菌株和野生菌株对抗真菌物质的敏感性差异就可以判断是否是靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质，筛选过程更加简单、省时省力，结果更加准确可靠。本发明对于真菌病害的绿色防控药物的筛选与研发具有巨大的应用前景。图I为HSAF对构巢曲霉野生菌株A28以及构巢曲霉barA基因突变体的抑制作用。图2为HSAF对构巢曲霉野生菌株A28以及构巢曲霉gcsl基因突变体的抑制作用。图3为构巢曲霉野生菌株A28的孢子在HSAF胁迫后镜检的形态特征。图4为活性物质HB-2和HB_3对构巢曲霉野生型菌株A28和构巢曲霉barA基因突变体的生长影响。图5为活性物质HB-2和HB-3对构巢曲霉野生型菌株A28和构巢曲霉gcsl基因突变体的生长影响具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28,购自美国真菌遗传学保藏中心(FungalGeneticsStockCenter,简称FGSC,网址www.fgsc.net),保藏号为FGSC#A28(GenotypepabaA6,biAl)。MAG液体培养基取20g麦芽抽提物、20g葡萄糖、2g蛋白胨、Iml微量元素混合液和2ml维生素混合液，用蒸馏水溶解并定容至1L。微量元素混合液的制备方法依次将2.2gZnSO4·7Η20、1·IgH3BO3>O.5gMnCl2·4Η20、0·5gFeSO4·7Η20、0·17gCoCl2·6Η20、0·16gCuSO4·5Η20、0·15gNa2MoO4·2Η20和05gNa4-EDTA用蒸馏水溶解并定容至IOOml(用KOH调pH至6.5)。维生素混合液的制备方法取IOOmg生物素(维生素H)、IOOmg维生素BI、IOOmg维生素B2、IOOmg维生素B6、IOOmg烟酸和IOOmg对氨基苯甲酸,用蒸懼水溶解并定容至100ml。注维生素混合液需避光保存。MAG固体平板在MAG液体培养基的基础上每升添加15g琼脂。实施例I、两个突变体菌株的构建一、构巢曲霉野生菌株A28的紫外诱变将构巢曲霉野生菌株A28的孢子涂布到含有50μg/mlHSAF的MAG固体平板上，在紫外灯下(100J/m2，致死率为90%)进行诱变处理。二、构巢曲霉barA基因突变体与gcsl基因突变体的筛选与鉴定I、将诱变处理后的平板置于28°C培养3天，然后挑取大的菌落于含有50μg/mlHSAF的MAG固体平板上进一步确认。2、以突变体基因组DNA为模板，PCR扩增barA基因(神经酰胺合成酶基因)并进行测序分析。以突变体基因组DNA为模板，PCR扩增gcsl基因(神经酰胺糖苷转移酶基因)并进行测序分析。如果barA基因发生突变、gcsl基因发生突变或barA基因和gcsl基因均发生突变，从而导致神经酰胺糖脂合成丧失或明显降低，且能通过相应野生基因进行功能互补，该突变体即为barA基因功能缺失突变体、gcsl基因功能缺失突变体或barA基因和gcsl基因功能缺失双突变体。PCR扩增barA基因所用引物对如下barAFI:5’-ATCTCCGAGCTTTTATCCCAC-3’；barARl:5’-ATTTTCAGAACACGACATTTAGG-3’。该引物对的退火温度为56°C，靶序列为1639bp。PCR扩增gcsl基因所用的引物对如下gcslFl:5’-GTCTCCTCGTCTTCTCTCTTCTC-3’；gcslRl:5’-TATTCTTTTTTTGCTTGGTTTGT-3’。该引物对的退火温度为56°C，靶序列为1930bp。获得了两个突变体。通过测序分析发现一个突变体的barA基因发生了缺失突变，导致BarA蛋白中间212个氨基酸残基的缺失而丧失功能；另一个突变体的gcsl基因发生了无义突变，导致产生长度仅为170氨基酸残基的功能丧失的截短的蛋白。三、构巢曲霉barA突变体与gcsl突变体的保藏构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1已于2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCNo.5806。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1又称构巢曲霉barA基因突变体。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13已于2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCNo.5807。构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13又称构巢曲霉gcsl基因突变体。实施例2、抗真菌因子(HSAF)的制备抗真菌因子(HSAF)一种来自产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)C3的抗真菌物质，祀标为神经酰胺糖脂(Rittenour,ff.R.,Chen,M.,Cahoon,E.B.,andHarris,S.D.(2011).ControlofglucosylceramideproductionandmorphogenesisbytheBarlceramidesynthaseinFusariumgraminearum.PLoSOne6,el9385.doi:10.1371/journal,pone.0019385)。按照文献中的方法制备HSAF(YuF,Zaleta-RiveraK,ZhuX,HuffmanJ,MilletJC,etal.(2007)Structureandbiosynthesisofheat-stableantifungalfactor(HSAF),abroad-spectrumantimycoticwithanovelmodeofaction.AntimicrAgentsChemoth51:64-72.)。实施例3、HSAF对野生菌株以及突变菌株的抑制作用一、HSAF处理与形态观察将构巢曲霉barA基因突变体分别于两个固体平板中间(第一种固体平板为MAG固体平板，第二种固体平板为含50μg/mlHSAF的MAG固体平板)，28°C培养3天。将构巢曲霉gcsl基因突变体分别于两个固体平板中间(第一种固体平板为MAG固体平板，第二种固体平板为含50μg/mlHSAF的MAG固体平板)，28°C培养3天。将构巢曲霉野生菌株A28分别于两个固体平板中间(第一种固体平板为MAG固体平板，第二种固体平板为含50μg/mlHSAF的MAG固体平板)，28°C培养3天。结果见图I和图2。在第一种固体平板上，三种菌株的生长情况没有显著差异。在第二种固体平板上，构巢曲霉野生菌株A28的生长受到显著抑制(只能观察到很小的菌落)，barA基因突变体和gcsl基因突变体的菌落显著大于构巢曲霉野生菌株A28，也就是受抑制的程度较小。结果表明，HSAF中含有靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质。二、结果验证将构巢曲霉野生菌株A28的孢子分别接种于两种液体培养基中(第一种液体培养基为液体MAG培养基，第二种液体培养基为含50μg/mlHSAF的液体MAG培养基)，28°C培养8-12h，然后在显微镜下观察孢子的萌发和菌丝的生长特征。结果见图3。在第一种液体培养基中，孢子形态正常。在第二种液体培养基中，真菌菌丝过度分叉。该结果可以进一步确认HSAF中含有靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质。也可按如下方法进行验证，将构巢曲霉野生菌株A28的孢菌丝接种于两种液体培养基中(第一种液体培养基为液体MAG培养基，第二种液体培养基为含50μg/mlHSAF的液体MAG培养基)，28°C培养3-6h，然后在显微镜下观察孢子的萌发和菌丝的生长特征，若真菌菌丝过度分叉，则可以进一步确认所筛选的待检物中含有靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质。实施例4、来源于微生物的靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的筛选方法一、具体的筛选方法I、将微生物来源的待检物质进行粗提，获得待检物质粗提物(即将微生物发酵收集发酵上清)。2、分组处理将构巢曲霉barA基因突变体分别于两个固体平板中间(第一种固体平板为MAG固体平板，第二种固体平板为含粗提物的MAG固体平板)，28°C培养3天。将构巢曲霉gcsl基因突变体分别于两个固体平板中间(第一种固体平板为MAG固体平板，第二种固体平板为含粗提物的MAG固体平板)，28°C培养3天。将构巢曲霉野生菌株A28分别于两个固体平板中间(第一种固体平板为MAG固体平板，第二种固体平板为含粗提物的MAG固体平板)，28°C培养3天。在含有粗提物的MAG固体平板上，若突变体菌落较大、其生长不受此待检物质粗提物的影响或影响较少，而野生菌株菌落较小、生长受到抑制，则可以基本判断此粗提物中含有靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质。二、筛选结果依据上述方法，本发明人对900多株土壤微生物次级代谢产物的分析，新筛选3株微生物其次级代谢产物的靶标为神经酰胺糖脂。其中有代表性的两株链霉菌所产生的活性物质HB-2和HB-3对野生型菌株A28和构巢曲霉barA基因突变体的生长影响见图4，活性物质HB-2和HB-3对野生型菌株A28和构巢曲霉gcsl基因突变体的生长影响见图5。三、筛选结果的进一步验证为了进一步对所筛选出的微生物次级代谢产物进行验证，首先将构巢曲霉野生菌株A28的孢子或菌丝接种于含有待检物质粗提物的液体MAG培养基中分别于28°C培养8-12h或3-6h，然后在显微镜下观察孢子的萌发和菌丝的生长特征。镜检结果显示所筛选到的3株微生物其次级代谢产物均能导致构巢曲霉菌丝过度分叉。这进一步确认了所筛选到的3株微生物的次级代谢产物含有靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质。以Hela细胞、小鼠、小麦种子和幼苗等为材料进行生物测定分析，证明这3株微生物次级代谢产物的对动植物均无毒性。权利要求1.一种筛选靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的方法，包括如下步骤A:将野生真菌菌株和突变菌株分别在含有待测物质的固体平板上进行培养，如果突变菌株在平板上的生长情况优于野生真菌菌株在平板上的生长情况，所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂；所述突变菌株为将所述野生真菌菌株的神经酰胺糖脂代谢途径相关基因进行功能缺失得到的菌株。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤B和/或步骤C步骤B:将所述野生真菌菌株的孢子分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支，所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质；步骤C:将所述野生真菌菌株的菌丝分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支，所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质。3.一种鉴定待测物质是否是靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质的方法，包括如下步骤D:将野生真菌菌株和突变菌株分别在含有待测物质的固体平板上进行培养，如果突变菌株在平板上的生长情况优于野生真菌菌株在平板上的生长情况、所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质，如果突变菌株在平板上的生长情况与野生真菌菌株在平板上的生长情况没有显著差异、所述待测物质为候选的非抗真菌物质或候选的不含抗真菌物质的物质；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂；所述突变菌株为将所述野生真菌菌株的神经酰胺糖脂代谢途径相关基因进行功能缺失得到的菌株。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤E和/或步骤F步骤E:将所述野生真菌菌株的孢子分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支、所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支与在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支数量没有显著差异、所述待测物质为候选的非抗真菌物质或候选的不含抗真菌物质的物质；步骤F:将所述野生真菌菌株的菌丝分别在含所述待测物质的液体培养基或不含所述待测物质的液体培养基中进行培养，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支多于在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支、所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质，如果在含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支与在不含所述待测物质的液体培养基中的菌丝分支数量没有显著差异、所述待测物质为候选的非抗真菌物质或候选的不含抗真菌物质的物质。5.如权利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述神经酰胺糖脂代谢途径相关基因为序列表的序列I所示的神经酰胺合成酶基因和/或序列表的序列2所示的神经酰胺糖苷转移酶基因。6.如权利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述野生真菌菌株为构巢曲霉(Aspergillusnidulans)野生菌株A28;所述突变菌株为保藏编号为CGMCCNo.5806的构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV_l或保藏编号为CGMCCNo.5807的构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13。7.构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1，它的保藏编号为CGMCCNo.5806。8.构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13，它的保藏编号为CGMCCNo.5807。9.保藏编号为CGMCCNo.5806的构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-1和/或保藏编号为CGMCCNo.5807的构巢曲霉(Aspergillusnidulans)UV-13在筛选抗真菌物质中的应用；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂。10.真菌神经酰胺合成酶编码基因和/或神经酰胺糖苷转移酶基因在筛选抗真菌物质中的应用；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂。全文摘要本发明公开了一种筛选以神经酰胺糖脂为作用靶标的抗真菌物质的方法。本发明提供的方法包括如下步骤将野生真菌菌株和突变菌株分别在含有待测物质的固体平板上进行培养，如果突变菌株在平板上的生长情况优于野生真菌菌株在平板上的生长情况，所述待测物质为候选的抗真菌物质或候选的含抗真菌物质的物质；所述抗真菌物质的靶标为神经酰胺糖脂。本发明建立的方法不仅靶标明确，而且将活体筛选与活性检测集于一体，仅根据突变菌株和野生菌株对抗真菌物质的敏感性差异就可以判断是否是靶标为神经酰胺糖脂的抗真菌物质，筛选过程更加简单、省时省力，结果更加准确可靠。本发明对于真菌病害的绿色防控药物的筛选与研发具有巨大的应用前景。文档编号C12Q1/18GK102586394SQ20121004826公开日2012年7月18日申请日期2012年2月28日优先权日2012年2月28日发明者孙宪昀,张振颖,张晗星,李少杰申请人:中国科学院微生物研究所