专利名称：：一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及水产动物遗传育种
技术领域：
，更具体涉及一种鉴定转生长激素(growthhormone,GH,以下同)基因鱼纯合子的方法，还涉及纯合子转基因鱼在转基因鱼纯系建立和新品种培育中的应用。采用常规PCR和定量PCR(real-timePCR，以下同)相结合的技术，通过比较纯合子和半合子转基因鱼中转植基因整合的相对拷贝数，分析转植基因为阳性的转基因鱼的基因型，从而快速准确地鉴定出转基因鱼纯合子，对于建立转基因鱼纯系，加快转基因鱼新品种培育进程具有重要意义。
背景技术：
：从第一批快速生长的转基因鱼诞生迄今，世界范围内已成功研制了30多种转基因鱼，这些转基因鱼包含了世界水产养殖的许多重要品种，如鲤鱼、罗非鱼、鲇类及鲑鳟鱼类等(HuWeiandZhuZuoyan.IntegrationmechanismsoftransgenesandpopulationfitnessofGHtransgenicfish.ScienceinChinaSerC-LifeSci，2010，53:401-408.)。采用转基因技术培育具有优良性状的养殖鱼类新品种，已成为水产养殖业可持续发展的主导性技术之一。在转基因鱼群体中获得具有优良性状的转基因鱼后，通过转基因鱼自交从而产生纯合子转基因鱼，从转基因鱼自交群体中筛选出遗传性状稳定的纯合子转基因鱼后，就可以以纯合子转基因鱼为亲本建立转基因鱼家系，从而培育出性状优良、遗传稳定的养殖新品种。但是，转基因鱼自交群体由纯合子转基因鱼、半合子转基因鱼和同窝非转基因鱼组成，只有纯合子转基因鱼的性状才能在子代中稳定遗传，而不会出现性状分离现象。只有纯合子转基因鱼才可以作为候选的优良养殖新品种。因此，如何快速、准确地鉴定和筛选出纯合子转基因鱼是转基因鱼育种的关键之一。采用Dotblot、Southernblot和半定量PCR分析转植基因整合的拷贝数后，再结合转基因鱼与对照鱼的测交结果分析，是筛选纯合子转基因鱼的常用方法，如在转基因罗非鱼和转基因泥鳅中的相关研究(Rahman，Μ.Α.，Mak,R.，Ayad,H.，Smith,Α.，Maclean,N.,1998.Expressionofanovelpiscinegrowthhormonegeneresultsingrowthenhancementintransgenictilapia(Oreochromisniloticus).TransgenicRes7,357-369；Martinez,R.,Arenal,A.,Estrada,Μ.P.,Herrera,F.,Huerta,V.,Vazquez,J.,Sanchez,T.,delaFuente,J.,1999.Mendeliantransmission,transgenedosageandgrowthphenotypeintransgenictilapia(Oreochromishornorum)showingectopicexpressionofhomologousgrowthhormone.Aquaculture173,271-283；Nam,Y.K.,Cho,Y.S.,Cho,H.J.,Kim,D.S.,2002.Acceleratedgrowthperformanceandstablegerm-linetransmissioninandrogeneticallyderivedhomozygoustransgenicmudloach,Misgurnusmizolepis.Aquaculture209,257-270)。但是这些鉴定纯合子转基因鱼的方法不仅费时费力，而且所鉴定结果的稳定性不高。
发明内容本发明的目的在于提供了ー种鉴定转GH基因鱼纯合子的方法。该方法易行，操作简便，可以对转GH基因鱼自交群体中的纯合子和半合子转基因鱼进行准确、快速和高通量蹄选。本发明的另一目的是在于提供了ー种纯合子转基因鱼在转基因鱼纯系建立和转基因鱼新品种培育中的应用。筛选到转基因鱼纯合子后，可以建立转基因鱼纯系，从而培育出养殖性状优良，遗传性状稳定的养殖鱼类新品种。本发明对于加快遗传性状稳定的转基因鱼新品种的培育进程具有重要意义。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施本发明利用STORGreenreal-timePCR的2-ΔACt方法(Haurogne，K.，Bach,J.Μ.,Lieubeau,B.,2007.EasyandrapidmethodofzygositydeterminationintransgenicmicebySYBRGreenreal-timequantitativePCRwithasimpledataanalysis.TransgenicResearch.16,127—131；Sakurai,Τ.,Kamiyosni,Α.,Watanabe,S.,Sato,Μ.,Shindo,Τ.,2008.RapidzygositydeterminationinmicebySYBRGreenreal-timegenomicPCRofacrudeDNAsolution.TransgenicResearch.17,149-155.),通过分析转基因鱼基因组中整合的转植基因的基因型，在转GH基因鱼自交子代群体中快速、准确地鉴定和筛选到候选的纯合子转GH基因鱼。该方法鉴别转基因鱼纯合子和半合子不仅准确、快速，而且简单、高通量、低廉，特别适合在转基因鱼群体中进行大规模快速筛选纯合子，可以加快遗传性状稳定的转基因鱼新品种的培育进程。ー种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法，其步骤是1.DNA提取剪取约0.5-lcm2的转GH基因鱼尾鳍组织，按“血液/細胞/组织基因组DNA提取试剂盒”操作指南(北京天根生物技术公司产品)，提取转GH基因鱼基因組DNA。2.阳性转GH基因鱼鉴定采用常规PCR技术鉴定阳性转GH基因鱼。PCR体系总体积为25ul，包括20ngDNA,0.5μ1dNTP(lOmM)，2.5ul缓冲液，2.5ulMgCl2,IUnitΤ.AquaticusDNA聚合酶，引物(IOmM)(Invitrogen公司，下同)各1μ1。上下游引物序列分别为GH(F5'-CATTTACAGTTCAGCCATGGCTAGA-3‘)和GH(R5‘-AGCACCACCGACAACAGCACTAATG-3‘)。反应程序94"C预变性5min，扩增30个循环(94°C,30s；58°C,30s；72°C，30s)，最后72°C延伸5min。取反应产物5ul置于1%(g/ml)琼脂糖凝胶电泳，预期扩增的转植基因片段大小为32!3bp。3.纯合子鉴定与筛选转植基因gcGH(草鱼生长激素，下同)在纯合子转基因鱼基因组中的拷贝数是其在半合子转基因鱼基因组中拷贝数的2倍。通过Real-timePCR分析转基因鱼中转植基因gcGH的基因型来鉴别转基因鱼纯合子和半合子以在黄河鲤鱼(遗传资源表见附件)基因组中拷贝数恒定不变的GnRH-III基因为(GonadotropinReleasingHormone,GnRH)内參基因，以转植的gcGH为目标基因，进行实时定量PCR。取20ngDNA，50mMdNTP,IOulSYBRGreenMix(Τ0Υ0Β0，Japan)通过荧光定量PCR对gcGH和GnRH-III基因进行分析。实验采用ABIPRISM7000定量PCR仪(AppliedBiosystems公司)，反应条件为95°C，2min,95V，15s,60V，30s,72V，45s,40个循环。20ul反应体系包括SYBRGreenMixPCR(TOYOBO)10ul，20_50ng纯化DNA，上下游引物(1OmM)各2u1。gcGH基因上下游引物分别为(F5，-TGTCTGGCACATCTGAGG-3，，R5’-GAAAGCATCATATCCATACC-3’)所扩增的片段全长为205bp。GnRHIII基因上下游引物分别为(F:5，-ATGGAGTGGAACGGAAGGT-3，，R:5，-CAGACAAATGAGAACAAGAGGAA-3，)，所扩增的片段全长为169bp。实时定量PCR的数据由ABIPrism7000SDS11软件(AppliedBiosystems公司)编译和收集。采用相对定量2_ΔΔ"方法ACt=Ct(gcGH)-Ct(GnRH-III),ΔΔCt=ΔCt(待检测鱼)-ΔCt(已知的半合子基因型鱼，为经过测交验证的实验鱼)，当2_Δ=2时，则检测的实验鱼为纯合子，当2_Δ=1时，检测的鱼为半合子。4.纯合子验证将步骤3筛选出的纯合子转基因黄河鲤鱼与对照黄河鲤鱼杂交后，按步骤1和2所示方法鉴定杂交子代的阳性率。根据孟德尔遗传定律，纯合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为100%，半合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为50%(图1)。一种纯合子转基因鱼在转基因鱼纯系建立和转基因鱼新品种培育中的应用。其步骤是将鉴定的雄性转基因黄河鲤鱼纯合子与雌性转基因黄河鲤鱼纯合子按常规方法在池塘中养殖，待其发育到性成熟后，按常规方法进行人工催产；将雄性转基因黄河鲤鱼纯合子精液与雌性转基因黄河鲤鱼卵子进行人工授精；自交得到的子代即为遗传性状稳定的转基因鱼纯合子家系，将获得的转基因黄河鲤鱼纯合子家系按常规方法在池塘中养殖和培育，从而培育出优良养殖鱼类新品种。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1.与采用Dotblot,Southernblot和半定量PCR分析转植基因整合的拷贝数后，再结合测交结果鉴定纯合子转基因鱼技术比较，本发明结合STORGreenreal-timePCR和相对定量比较ACT的方法鉴定纯合子，不需要样品浓度一致，也不需要复杂的数据分析，操作简单，快速，准确，而且可以高通量分析待检测转基因鱼样品。2.鉴定出来的纯合子转基因鱼可以作为亲本用于建立转基因鱼纯系，从而培育出养殖性状优良，遗传性状稳定的养殖鱼类新品种，加快遗传性状稳定的转基因鱼新品种的培育进程。图1为一种纯合子和半合子转GH基因鱼测交子代的PCR阳性检测结果示意图。纯合子，半合子转GH基因鱼及对照雄鱼分别与对照雌鱼杂交，提取子代鱼苗基因组DNA，PCR(30循环)后取5ul产物进行琼脂糖凝胶(1%)电泳，片段长度为32!3bp，如图所示，纯合子(Α，η=20)，半合子(B和C，η=20)及对照鱼(Cl，C2，C3，C4，4条/组)，PCR阴性对照采用无菌水做为模板(NTC:notemplatecontrol).根据孟德尔遗传定律，纯合子(A)子代的转植基因阳性率为100%，而半合子(B和C)子代的转植基因阳性率为50%左右ο图2为一种纯合子(n=11)和半合子(n=42)转GH基因黄河鲤STORReal-timePCR定量分析结果示意图。纯合子转GH基因黄河鲤2_ΔΔα=2.02士0.31，半合子转GH基因黄河鲤2_δδ"=1.01士0.16，所扩增的转植基因相差一倍，统计学分析具有显著差异(Student'st-test,ρ<0.001)，以转基因鱼(n=53)的基因组DNA(25-50ng)为模板，分别扩增gcGH和sGnRH基因片段，2_ΔΔα数据分析方法如下ACt=Ct(gcGH)-Ct(sGnRH)，ΔΔCt=ΔCt(待检测)-ΔCt(已知半合子)，上下误差线表示标准差。具体实施例方式实施例1ー种转基因鱼纯合子的鉴定方法，其步骤是1.DNA提取剪取约0.5-lcm2的转GH基因鱼尾鳍组织，按“血液/細胞/组织基因组DNA提取试剂盒”操作指南(北京天根生物技术公司产品)，提取转GH基因鱼基因組DNA。2.转GH基因鱼阳性鉴定采用常规PCR技术进行转GH基因鱼阳性鉴定。PCR体系总体积为25u1，包括20ngDNA,IOOuMdNTP,2.5ulBuffer(25mM)，2.5ulMgCl2(25mM)，IUnitΤ.AquaticusDNA聚合酶(Fermentas，USA),引物(IOmM)(Invitrogen公司，下同)各1μ1。引物序列GHf(5‘-CATTTACAGTTCAGCCATGGCTAGA-3‘)和GHr(5‘-AGCACCACCGACAACAGCACTAATG-3')。反应程序94°C预变性5min，扩增30个循环(94°C,30s；58°C,30s；72°C,30s),最后72°C延伸5min，PCR反应在GeneAmpSystem9600型仪器进行。取反应产物5ul置于1%(g/ml)琼脂糖凝胶电泳。预期扩增的转植基因片段大小为32!3bp(图1)。3.纯合子鉴定与筛选转植基因gcGH在纯合子转基因鱼基因组中的拷贝数是其在半合子转基因鱼基因组中拷贝数的2倍。通过Real-timePCR分析转基因鱼中转植基因gcGH的基因型来鉴别转基因鱼纯合子和半合子以在黄河鲤鱼(遗传资源表见附件)基因组中拷贝数恒定不变的GnRH-III基因为(GonadotropinReleasingHormone,GnRH)内參基因，以转植的gcGH为目标基因，进行实时定量PCR。取20ngDNA，50mMdNTP,IOulSYBRGreenMix(Τ0Υ0Β0，Japan)通过荧光定量PCR对gcGH和GnRH-III基因进行分析。实验采用ABIPRISM7000定量PCR仪(AppliedBiosystems公司)，反应条件为95°C，2min，95"C,15s,60"C,30s,72"C,45s,40个循环。20ul反应体系包括SYBRGreenMixPCR(Τ0Υ0Β0)10ul，20_50ng纯化DNA，上下游引物(IOmM)(Invitrogen公司)各0.5μ1。gcGH基因上下游引物分别为(F:5，-TGTCTGGCACATCTGAGG-3，，R:5，-GAAAGCATCATATCCATACC-3，)所扩增的片段全长为205bp。GnRHIII基因上下游引物分别为(F:5，-ATGGAGTGGAACGGAAGGT-3，，R5，-CAGACAAATGAGAACAAGAGGAA-3，)，所扩增的片段全长为169bp。实时定量PCR的数据由ABIPrism7000SDS1.1软件编译和收集。采用相对定量2-“ct方法Δα=ct(gcGH)-Ct(GnRH-III)，ΔΔCt=ΔCt(待检测鱼)-ΔCt(已知的半合子基因型鱼，为经过测交验证的实验鱼)，当2_ΔΔα=2吋，则检测的转基因鱼为纯合子，当2_δ=1时，检测的转基因鱼为半合子(图2)。4.纯合子验证将步骤3筛选出的纯合子转基因鱼与对照鱼杂交后，按步骤1和2所示方法鉴定杂交子代的阳性率，根据孟德尔遗传定律，纯合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为100%，杂合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为50%(图1)。实施例2:筛选出来的一种纯合子转基因黄河鲤鱼在培育优良养殖鱼类品种中的应用。其具体过程是A、将鉴定的雄性转基因黄河鲤鱼纯合子与雌性转基因黄河鲤鱼纯合子按常规方法在池塘中养殖，待其发育到性成熟后，按常规方法进行人工催产；B、将雄性转基因黄河鲤鱼纯合子精液与雌性转基因黄河鲤鱼卵子进行人工授Ib；C、自交得到的子代即为遗传性状稳定的转基因鱼纯合子家系，将获得的转基因黄河鲤鱼纯合子家系按常规方法在池塘中养殖和培育，从而培育出优良养殖鱼类新品种。权利要求1.ー种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法，其步骤是A、DNA提取剪取0.5-lcm2的转GH基因鱼尾鳍组织，按血液/細胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作指南，提取转GH基因鱼基因組DNA；B、阳性转GH基因鱼鉴定采用常规PCR技术鉴定阳性转GH基因鱼，PCR体系总体积为25ul，包括20ngDNA,0.5μ1dNTP，2.5ul缓冲液，2.5ulMgCl2,IUnitΤ.AquaticusDNA聚合酶，引物各1μ1；上下游引物序列分别为F5‘-CATTTACAGTTCAGCCATGGCTAGA-3‘和R:5‘-AGCACCACCGACAACAGCACTAATG-3‘，反应程序94°C预变性5min，扩增30个循环940C，30s；58°C，30s；72°C，30s，最后72°C延伸5min，取反应产物5ul置于1%g/ml琼脂糖凝胶电泳，预期扩增的转植基因片段大小为32!3bp；C、纯合子鉴定与筛选转植基因gcGH在纯合子转基因鱼基因组中的拷贝数是其在半合子转基因鱼基因组中拷贝数的2倍，通过Real-timePCR分析转基因鱼中转植基因gcGH的基因型来鉴别转基因鱼纯合子和半合子在黄河鲤鱼基因组中拷贝数恒定不变的&1RH-III基因为内參基因，以转植的gcGH为目标基因，进行实时定量PCR；取20ngDNA，50mMdNTP,IOulSYBRGreenMix通过荧光定量PCR对gcGH和GnRH-III基因进行分析，实验采用ABIPRISM7000定量PCR仪，反应条件为95°C，2min，95°C，15s，60°C，30s，72°C，45s，40个循环，20ul反应体系包括SYBRGreenMixPCRlOul，20_50ng纯化DNA，上下游引物各2ul，gcGH基因上下游引物分别为F:5，-TGTCTGGCACATCTGAGG-3，，R5，-GAAAGCATCATATCCATACC-3，所扩增的片段全长为205bp，GnRHIII基因上下游引物分别为F:5，-ATGGAGTGGAACGGAAGGT-3，，R:5，-CAGACAAATGAGAACAAGAGGAA-3，，所扩增的片段全长为169bp；D、纯合子验证将步骤C筛选出的纯合子转基因黄河鲤鱼与对照黄河鲤鱼杂交后，按步骤A和B所示方法鉴定杂交子代的阳性率，根据孟德尔遗传定律，纯合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为100%，半合子转基因鱼与对照鱼杂交子代的阳性率为50%。2.权利要求1所述的ー种纯合子转基因鱼在转基因鱼纯系建立中的应用。3.权利要求1所述的ー种纯合子转基因黄河鲤鱼在培育养殖鱼类品种中的应用。全文摘要本发明公开了一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用，其步骤A剪取约0.5-1cm2的转基因鱼尾鳍组织，提取DNA；B采用常规PCR技术检测转植基因阳性；C采用SYBRGreenreal-timePCR的2△△Ct方法分析转植基因为阳性的转基因鱼的基因型，比较纯合子和半合子转基因鱼中转植基因整合的相对拷贝数，鉴定和筛选出转基因纯合子，并通过测交试验进一步确证。本发明方法易行，快速准确，操作简便。鉴定和筛选的转基因鱼纯合子对于建立转基因鱼纯系，加快转基因鱼新品种培育进程具有重要意义。文档编号C12Q1/68GK102534039SQ20121004780公开日2012年7月4日申请日期2012年2月28日优先权日2012年2月28日发明者宋焱龙,朱作言,汪亚平,胡炜,钟成容申请人:中国科学院水生生物研究所