专利名称：一种ebv病毒豚鼠动物模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种动物模型的建立方法，特别涉及一种豚鼠EB病毒动物模型的建立方法，属于医学生物学技术领域。
背景技术：
EBV病毒的全称为Epstein-Barr virus,是由epstein和barr于1964年首次成功地使用burkitt非洲儿童的淋巴瘤细胞，通过体外悬浮培养而建立的病毒株。EBV在人群中具有普遍感染性，在全球范围内，有90%以上的人被EBV感染过。EBV主要通过唾液传播，也可经血液传染。感染多发生在幼儿时期，一般不伴随或只伴随较弱的临床症状。EBV的感染能够诱导多种恶性肿瘤的产生，包括伯基特淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤等， 并常与其他病毒感染相关联，如HIV。目前还没有有效治疗EBV感染的药物，对因EBV感染而引起的致癌，目前还得不到有效地防治或治疗。而为了治疗EBV相关疾病，必须更深入地研究EBV，这就需要建立一种便于研究EBV的动物模型。自EBV被发现至今，在已公开的EBV动物模型中，只有少数的几种灵长类动物对EBV最为易感，但随着灵长类动物数量的急剧减少，以及灵长类动物价格的不断飙升，昂贵的灵长类动物模型实验已不能再继续，严重制约着人们对EBV的进一步深入研究。因此，有必要研发新的、实用的、有效的动物实验模型，以对EBV进行更加深入的研究，最终获得能够治疗EBV感染的药物，防治因EBV感染而引起的各种癌症。豚鼠是一种常见的实验动物，已广泛应用于传染病研究，且对多种病毒易感，同时容易饲养、性格温顺、体积小巧，很适合实验操作。
发明内容
针对现有EBV病毒动物模型只对少数几种灵长类动物易感，而灵长类动物又因数量少、价格昂贵以及维系生态平衡等诸多因素，不再继续使用，从而制约着人们对EBV的深入研究，进而难于获得治疗EBV感染的药物，不能防治由EBV感染而引起的各种癌症，等诸多问题，本发明提供一种对EBV最为易感，并能用豚鼠取代灵长类动物的EBV病毒动物模型及其建立方法。本发明通过下列技术方案完成一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于经过下列步骤
A、将O.Iml病毒滴度为I. OX IO6 I. OX IO7的EBV病毒液经豚鼠鼻腔滴鼻，进行EBV病毒接种；
B、接种后I周，取5ml豚鼠血液与5mlRPMI 1640培养基混匀，加于IOml豚鼠淋巴细胞分离液之上，2000r/min离心20min,使细胞分为四层；
C、收集第二层细胞并放入5ml含RPMI1640培养基中，混匀，1500r/min离心20min，分离出的沉淀用RPMI 1640培养基反复重悬洗2次后收集；
D、在步骤C收集的淋巴细胞上加入ImlTRIZOL，常温静置lh，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色无分相，室温静置5min,4°C 13500r/min离心15min,取上层液并加入等体积异丙醇，混勻，静置IOmin, 4°C 13500r/min离心IOmin,去上清，向沉淀物中加入Iml -201^ 冷的质量浓度为75%的乙醇，清洗，4°C，13500r/min离心5min，去上清，室温放置干燥后用RNase free dH20 溶解，得到总 RNA ;
E、采用20μ L反应体系对步骤D得到的总RNA进行RT逆转录成cDNA ；
F、以cDNA为模板用Nested-PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片；
G、回收步骤F的目的DNA片段，经纯化后，将目的DNA片段连接在pGEM_T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型。所述步骤E 的反应体系包括MgCl2, 4 μ I ;Reverse Transcription IOX Buffer,2 μ I ；dNTP Mixture,2 μ I ；Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor,0. 5 μ I ；AMV Reverse Transcriptase, 15u ；01igo (dT) 15 Primer, 0. 5 μ g ；total RNA ,lug；Nuclease-Free Water 补至 20 μ I ;反应条件为42。C 15 minutes, 95。C 5 minutes,,4° C 5 minutes ;使用β-Actin基因做内参用于评价提取的RNA质量。所述步骤F的Nested-PCR扩增为取2 μ L cDNA加入到48 μ L PCR反应体系中。EBNAl第一轮PCR程序94°C预变性2min，94°C热变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸lmin，35个循环，72°C延伸5min。第二轮PCR程序94°C预变性2min，94°C热变性30s，53°C退火30s，72 °C延伸30s，35个循环，72 °C延伸5min ；BcLFl第一轮PCR程序94°C预变性 2min，94°C 热变性 lmin，64°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min，40 个循环，72°C 延伸 5min。第二轮PCR程序94°C预变性Imin，94°C热变性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，35个循环，72°C延伸5min。经Nested-PCR扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片。所述步骤F的Nested-PCR扩增中的引物核酸序列为
目的基因为EBNAl的引物序列
Fl :5’ -TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，
Rl :5’ -CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’ ；
F2 :5， -ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3，，
R2 :5’ -GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’ ； 目的基因为BcLFl的引物序列
Fl :5’ -TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，
Rl :5’ -TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’
F2 :5， -ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3，，
R2 :5’ -TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’
目的基因为β-Actin的引物序列
F :5’ -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’
R :5’ -GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’。本发明对于现有技术具有如下技术效果豚鼠在接种EBV病毒后，其抗EBV病毒IgG抗体水平明显增高，并能在数月内维持较高水平；经RT-PCR、NeSted-PCR检测到豚鼠体内有EB病毒相关抗原表达。此模型的建立能在病毒学及免疫学基础上，对EBV病毒包括病原学、免疫学、发病机理进行研究，以在相关药物的筛选、疫苗评价等应用方面起到重要作用。
图I为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析，图中上部为BcLFl的检测结果，目的片段长度为181 bp ;图中下部为EBNAl的检测结果，目的片段长度为178 bp ;1 Γ 0#为10只实验组豚鼠，10只对照组豚鼠检测结果全为阴性未在图上列出；Μ代表DL2000 Marker.图2、图3为肺病理分析结果，图2 (A)为实验组1#豚鼠肺，出现肺间质充血水肿，炎症细胞侵润，肺泡壁增厚，支气管见少量分泌物；图3 (B)为对照组肺，正常。图4、图5为脾脏病理分析结果，图2 (A)为实验组2#豚鼠脾，出现脾小体增生；图5 (B)为对照组脾，正常。 图6、图7为腮腺病理分析结果，图6 (A)为实验组6#豚鼠的腮腺，出现大面积细胞坏死，炎症细胞侵润；图7 (B)为对照组腮腺，正常。图8、图9、图10、图11、图12为肝脏病理分析结果，图8 (A)为实验组2#豚鼠肝脏，图9 (B)为实验组4#豚鼠肝脏，图10 (C)为实验组6#豚鼠肝脏，图11 (D)为实验组7#豚鼠肝脏，出现炎症细胞侵润；图12 (E)为对照组肝脏，正常。
具体实施例方式下面结合实施对本发明做进一步描述。I动物选择
选择4周龄，雄性，体重16(Γ 200 g的Hartley SPF级豚鼠20只，接种前经血清学检测EBV抗体呈阴性。2毒种制备
毒种由B95-8细胞制得，B95-8细胞为中国科学医学院医学生物学研究所疫苗研究室保存。3病毒接种
20只豚鼠，分两组，实验组和对照组。实验组豚鼠由鼻腔滴鼻接种O. Iml EBV病毒液，病毒滴度为I. OX IO6 I. OX IO7 ;对照组豚鼠鼻腔滴鼻O. Iml PBS。4豚鼠一般特征观察
每天观察精神状态、活动力、饮食、体重、毛顺滑度。5特异性指标检测
5.I豚鼠外周血淋巴细胞分离采用心脏采血方式，采取豚鼠5ml血液于肝素钠采血管中，与5ml RPMI 1640培养基混匀，加于IOml豚鼠淋巴细胞分离液之上，2000r/min离心分离20min，此时离心管中由上至下细胞分四层，收集第二层细胞放入含RPMI 1640培养基5ml的试管中，充分混匀后1500r/min离心分离20min，分离出的沉淀用RPMI 1640培养基反复重悬洗2次后收集。5.2 RNA提取向分离制得的淋巴细胞加入Iml TRIZOL常温静置lh。加入O. 2ml氯仿，上下颠倒至乳白色无分相现象。室温静置5min,4°C 13500r/min离心15min,取出离心管，取上层于新管中加等体积异丙醇，颠倒混勻，静置lOmin。4°C 13500r/min离心lOmin。去上清，向含有沉淀的离心管加入Iml -20°C预冷的75%乙醇，轻轻颠倒清洗。4°C,13500r/min离心5min。去上清,打开离心管盖,室温放置干燥后用RNase free dH20溶解。5. 3 RT-PCR :采用20 μ L反应体系进行RT-PCR逆转录成cDNA，体系包 MgCl2, 4 μ I ；Reverse Transcription IOX Buffer, 2 μ I ; dNTP Mixture,2 μ I; Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor, 0. 5 μ I;AMV ReverseTranscriptase, 15u;Oligo(dT) 15 Primer, 0. 5 μ g; total RNA , I μ g;Nuclease-FreeWater 补至 20 μ I。反应条件42。C 15 minutes, 95。C 5 minutes, 4。C 5 minutes。使用β -Actin基因做内参用于评价提取的RNA质量。5.4 Nested-PCR :以 cDNA 为模板采用 Nested-PCR 扩增，取2 μ L cDNA 加入到 48yLPCR反应体系中。EBNAl第一轮PCR程序94°C预变性2min，94°C热变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸 lmin, 35 个循环，72°C延伸 5min。第二轮 PCR 程序94°C预变性 2min，94°C热变性30s，53。。退火30s，72。。延伸30s，35个循环，72°C延伸5min ；BcLFl第一轮PCR程序941预变性21^11，941热变性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸2min，40个循环，72 °C延 伸5min。第二轮PCR程序94°C预变性lmin，94°C热变性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸
I.5min，35个循环，72°C延伸5min。经Nested-PCR扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片。PCR结束后EBNAl目的片段大小应为178 bp，BcLFl目的片段大小应为181 bp。Nested-PCR扩增中的引物核酸序列为
目的基因为EBNAl的引物序列
Fl :5’ -TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，
Rl :5’ -CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’ ；
F2 :5， -ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3，，
R2 :5’ -GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’ ；
目的基因为BcLFl的引物序列
Fl :5’ -TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，
Rl :5’ -TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’
F2 :5， -ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3，，
R2 :5’ -TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’
目的基因为β-Actin的引物序列
F :5’ -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’
R :5’ -GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’
5.5目的片段测序鉴定目的片段与DNA marker DL2000作比较确认大小正确后对目的DNA片段进行回收，纯化后的DNA连接在pGEM-T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定确认无误后送至测序公司测序。5. 6抗EBV IgG抗体水平检测每只豚鼠在接种病毒后，分别于1、2、3、4、6、8、10、12、14、18、22、26、30周对豚鼠心脏采血，取0. 5ml血样于I. 5ml离心管中。37°C放置Ih,4°C过夜后分离血清。应用ELISA试剂盒检测特异性VCA-IgG与EBNA-IgG的水平。每孔包被抗原IOOng，血清稀释200倍。将IOug加入IOml包被液中混匀，向酶标板中每孔加入lOOul，置于封闭湿盒4°C过夜。回收包被液，拍干酶标板，加入BSA稀释液每孔200ul，置于封闭湿盒，37°C封闭2h。弃废液，拍干酶标板。取5ul血清样品加入995ulBSA稀释液混匀，混匀后取IOOul加入酶标板，每个样加三个孔。置于封闭湿盒，37°C孵育lh。弃废液，拍干酶标板，加洗液润洗，共4次，每次7min，拍干酶标板。取25ul羊抗豚鼠二抗于IOmlBSA稀释液中混匀，混匀后每孔加入lOOul，置于封闭湿盒，37°C孵育lh。弃废液，拍干酶标板，加洗液润洗，共4次，每次7min，拍干酶标板。每孔加入IOOul显色液，显色l(T20min，每孔加入IOOul加终止液。显色结果使用酶标仪在450nm和655nm双波长下读取OD值。5. 7病理检测将实验动物处死后取淋巴结、脾脏、肺、肝脏、腮腺组织用10%福尔马林固定，制作组织切片，染色，在显微镜下观察。6检测结果
6.I PCR结果PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果显示10只实验组豚鼠中有6只检测到BcLFl的表达1#、2#、3#、4#、5#、6#为阳性，其中4只检测到了 EBNAl的表达1#、3#、 5#、6#为阳性，对照组的10只豚鼠PCR检测均为阴性，参见图I。6. 2 ELISA检测结果实验组豚鼠在接种EBV后30周内VCA-IgG、EBNA-IgG抗体水平均有所升高，明显高对照组，其中VCA-IgG抗体水平变化比较明显。6. 3病理分析结果病理切片分析结果显示10只实验组豚鼠中有5只豚鼠的腮腺，肺，脾脏，肝脏等器官组织发生不同程度的病变。其中1#豚鼠出现肺间质充血水肿，炎症细胞侵润，肺泡壁增厚，参见图2 ；2#豚鼠出现脾小体增生，参见图3 ；6#豚鼠腮腺发生炎症细胞侵润、大面积细胞坏死，参见图4 ；2#豚鼠、4#豚鼠、6#豚鼠、7#豚鼠的肝脏出现炎症细胞侵润，参见图5 ；10只对照组豚鼠的器官均为正常未发生病变。实施例I
20只豚鼠，分两组，实验组和对照组。实验组豚鼠由鼻腔滴鼻接种0. Iml EB病毒液，病毒滴度为I. OX IO6 ;对照组豚鼠鼻腔滴鼻0. Iml PBS0应用特异性检测指标检测。实施例2
20只豚鼠，分两组，实验组和对照组。实验组豚鼠由鼻腔滴鼻接种0. Iml EB病毒液，病毒滴度为5. OX IO6 ;对照组豚鼠鼻腔滴鼻0. Iml PBS0应用特异性检测指标检测。实施例3
20只豚鼠，分两组，实验组和对照组。实验组豚鼠由鼻腔滴鼻接种0. Iml EB病毒液，病毒滴度为I. OX IO7 ;对照组豚鼠鼻腔滴鼻0. Iml PBS0应用特异性检测指标检测。表I为接种病毒后30周内豚鼠血浆中VCA-IgG、EBNA_IgG水平变化，数值为OD值，以X ± s表不。表I
权利要求
1.一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于经过下列步骤 A、将O.Iml病毒滴度为I. OX IO6 I. OX IO7的EBV病毒液经豚鼠鼻腔滴鼻，进行EBV病毒接种； B、接种后I周，取5ml豚鼠血液与5mlRPMI 1640培养基混匀，加于IOml豚鼠淋巴细胞分离液之上，2000r/min离心20min,使细胞分为四层； C、收集第二层细胞并放入5ml含RPMI1640培养基中，混匀，1500r/min离心20min，分离出的沉淀用RPMI 1640培养基反复重悬洗2次后收集； D、在步骤C收集的淋巴细胞上加入ImlTRIZOL，常温静置lh，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色无分相，室温静置5min,4°C 13500r/min离心15min,取上层液并加入等体积异丙醇，混勻，静置IOmin, 4°C 13500r/min离心IOmin,去上清，向沉淀物中加入Iml -201^ 冷的质量浓度为75%的乙醇，清洗，4°C，13500r/min离心5min，去上清，室温放置干燥后用RNase free dH20 溶解，得到总 RNA ; E、采用20μ L反应体系对步骤D得到的总RNA进行RT逆转录成cDNA ； F、以cDNA为模板用Nested-PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片； G、回收步骤F的目的DNA片段，经纯化后，将目的DNA片段连接在pGEM_T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型。
2.如权利要求I所述的EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤 E 的反应体系包括MgCl2, 4 μ I ；Reverse Transcription IOX Buffer, 2 μ I ；dNTPMixture,2 μ I ；Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor,0.5 μ I ；AMV ReverseTranscriptase,15u ；01igo(dT) 15 Primer,0. 5 μ g ；total RNA , I μg;Nuclease-FreeWater 补至 20 μ I ;反应条件为42。C 15 minutes, 95。C 5 minutes, ,4。C 5 minutes ；使用β -Actin基因做内参用于评价提取的RNA质量。
3.如权利要求I所述的EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤F的Nested-PCR扩增为取2 μ L cDNA加入到48 μ L PCR反应体系中，EBNAl第一轮PCR程序94°C预变性2min，94°C热变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸Imin, 35个循环，72 °C延伸5min ;第二轮 PCR 程序94°C预变性 2min，94°C热变性 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 30s，35个循环，72°C延伸5min ;BcLFl第一轮PCR程序94°C预变性2min，94°C热变性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸2min，40个循环，72°C延伸5min ;第二轮PCR程序94°C预变性lmin，94°C热变性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 I. 5min, 35 个循环，72°C延伸 5min，经 Nested-PCR扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片。
4.如权利要求I所述的EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤F的Nested-PCR扩增中的引物核酸序列为 目的基因为EBNAl的引物序列Fl :5’ -TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，Rl :5’ -CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’ ；F2 :5， -ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3，，R2 :5’ -GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’ ； 目的基因为BcLFl的引物序列Fl :5’ -TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，Rl :5’ -TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’F2 :5， -ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3，，R2 :5’ -TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’目的基因为β-Actin的引物序列F :5’ -TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’R :5’ -GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’。
全文摘要
本发明提供一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，经过对豚鼠进行EBV病毒接种；豚鼠外周血淋巴细胞分离；RNA提取；RT-PCR逆转录；Nested-PCR扩增；对目的DNA片段进行回收、纯化后，将DNA连接在pGEM-T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，送至测序公司测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型，以便对EBV病毒包括病原学、免疫学、发病机理等进行研究，以在相关药物的筛选、疫苗评价等应用方面起到重要作用。
文档编号C12Q1/70GK102812924SQ201210047649
公开日2012年12月12日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者刘国超, 胡云章, 胡凝珠, 王海漩 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所