专利名称：水稻产量基因gy6的克隆及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及到一个位于水稻第6染色体短臂上控制谷粒产量的基因GY6的克隆与应用。
背景技术：
水稻谷粒产量是水稻生产最重要的目标，单株穗数、每穗实粒数和千粒重是水稻谷粒产量的三个主要构成因子。水稻产量及其构成因子是典型的数量性状，由数量性状基因(Quantitative trait Ioci7QTL)控制。随着分子生物学的发展,近年来已有14个控制水稻产量相关性状的QTL应用图位克隆策略获得克隆，分布于除第6、11和12染色体外的10个不同座位上，它们通过调控株型、穗形、每穗实粒数、每穗颖花数、粒重或灌浆速率控制产量。近等基因系(Near-isogenic line, NIL)是QTL精细定位和克隆中最常用的材料，其优点是只在目标区间存在差异，遗传背景高度一致，使得群体只在单个QTL区间发生分离，极大地降低了遗传背景差异对目标QTL作用的干扰和对目标性状測定结果的影响，有效地提高了 QTL检测的灵敏度和可靠性。长期以来，近等基因系的构建一般通过多代回交获得，利用剩余杂合体(Residual heterozygote, RH)或剩余杂合系(Residualheterozygous line,RHL)发展近等基因系是ー种新的策略。所谓RH,指的是目标区间杂合而遗传背景纯合的单株，可从重组自交系群体中通过ー轮标记筛选获得，它相当于ー对近等基因系杂交产生的Fl单株。应用RH自交产生的只在目标区间发生分离的群体，可以有效地实现QTL的精细定位和克隆。这种策略为分离和克隆新基因提供了一种新的途径。
发明内容
本发明的目的是应用图位克隆法从水稻中分离克隆一种控制谷粒产量的基因，并利用该基因提高水稻的谷粒生产能力。申请人将克隆的这个基因命名为GY6，所述片段如序列表SEQ ID No :1-6所示，或者基本相当于SEQ ID No : 1_6所示的高度同源核苷酸序列。具体地，本发明分离克隆的基因或等位基因的核苷酸序列及其氨基酸序列的信息如下—种控制水稻谷粒产量的基因GY6,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:l所不。上述基因GY6的编码序列如序列表SEQ ID No 2所不。上述基因GY6的氨基酸序列如序列表SEQ ID No 3所示。与此同时，申请人得到GY6的ー种等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示。上述等位基因的编码序列如序列表SEQ ID No:5所不。上述等位基因的氣基酸序列如序列表SEQ ID No:6所不。本发明通过以下技术方案实现从珍汕97/密阳46F7重组自交系中筛选获得一个在第6染色体短臂上的、RM190-RM19784约7. 3Mb区域呈杂合而背景基本纯合的剩余杂合体，自交产生分离群体，通过DNA分子标记分析，筛选获得杂合区间更小且相互交叠的RH梯系材料。经连续4次自交构建群体和基因型筛选，最終获得仅在13. 7kb区间呈分离的近等基因系。近等基因系群体产量性状鉴定结果显示，该基因对每穗实粒数、千粒重和单株产量均具显著作用，来源于珍汕97的等位基因提高每穗实粒数、千粒重和单株产量(见本发明下述的表2)。该区间仅含一个候选基因，将之命名为GY6。序列分析表明，珍汕97和密阳46等位基因的基因组DNA分别长为6842bp和4716bp，编码序列长度均为537bp，编码ー个由178个氨基酸组成的含 PEBP结构域的蛋白。与珍汕97等位基因相比，密阳46等位基因在编码区共存在11处单核苷酸多态，导致了 6处氨基酸的置换。将GY6 (ZS97)等位基因转入中花11中，其T2代产量性状鉴定结果显示，该基因对每穗实粒数、千粒重和单株产量均具显著作用，转入GY6 (ZS97)可提高每穗实粒数、千粒重和单株产量(见本发明下述的表3)。本发明的优点在于本发明在水稻中克隆了ー个对粒数、粒重和谷粒产量具有较大正调控效应的基因GY6，为水稻等禾谷类作物的高产育种提供了新的基因资源。
序列表SEQ ID No 1显示的是本发明分离克隆的来源于珍汕97的GY6等位基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID No 2显示的是本发明分离克隆的来源于珍汕97的GY6等位基因的编码序列。序列表SEQ ID No 3显示的是本发明分离克隆的来源于珍汕97的GY6蛋白的氨
基酸序列。序列表SEQ ID No 4显示的是本发明分离克隆的来源于密阳46的GY6等位基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID No 5显示的是本发明分离克隆的来源于密阳46的GY6等位基因的编码序列。序列表SEQ ID No 6显示的是本发明分离克隆的来源于密阳46的GY6蛋白的氨
基酸序列。图I为近等基因系单株和主穗在灌浆期的表现。图I左侧图片中的左边为携带珍汕97GY6等位基因的NIL-GY6 (ZS97)单株，右边为携带密阳46GY6等位基因的NIL-GY6(MY46)单株；图I右侧图片中的左边为NIL-GY6 (ZS97)主穗，右边为 NIL-GY6 (MY46)主穗。图2为本发明的转基因所用的表达载体图谱。图3为本发明的转基因单株和主穗在灌浆后期的表现。图3左侧图片中的左边为中花11阴性单株，右边为转GY6(ZS97)阳性单株；图3右侧图片中的左边为成熟时期的中花11阴性单株主穗，右边为转GY6(ZS97)阳性单株主穗。
具体实施例方式以下结合实施例来进ー步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。实施例1GY6的图位克隆I. NIL 构建根据珍汕97/密阳46衍生群体产量性状的初定位結果，从F7株系中选择到ー个剩余杂合体，该单株在第6染色体短臂上的RM190-RM19784约7. 3Mb区域呈杂合，在其他区域基本呈纯合。利用该单株自交，获得由221个株系组成的F8:9群体。应用位于RM190和RM19784之间的22个SSR(简单序列重复)标记进行基因型检测，从23个F8家系的332个F9单株中筛选获得14个在RM4923-RM6119区域的部分区间呈杂合且相互交叠的RH梯系材料；分别自交获得14套Fltl群体，从其中ー套含288个体的群体中筛选获得I个在 RM3414-RM19417区间约97. Ikb呈杂合的单株，自交后形成由200个个体组成的F11群体；从中选取I个杂合单株自交形成了由680个单株组成的F12群体，应用3个SSR标记和新发展的4个InDel (插入缺失)标记，从后代中挑选出I个在RM19410-RM19417区间约64. 2kb呈杂合的单株，自交后形成由288个个体组成的F13群体；应用包含新发展的2个在内的6个InDel标记进行筛选，挑选到I个仅在Si2925和Si2927_4/5之间、只包含一个预测基因的约I. 7kb区间呈杂合的单株，从其自交群体中挑选出30个母本纯合型和30个父本纯合型的株系，构建了只在第6染色体短臂Si2925和Si2927-4/5区间呈分离的NIL群体。2. DNA微量提取(I)剪取水稻幼苗叶片2 3cm，剪成O. 5cm长的碎片，放入2. OmL离心管中。(2)加入450ul DNA提取液和ー颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。(3)加入450ul氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。(4) 11, OOOrpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400ul,转入新的I. 5ml离心
管中，弃枪头。(5)加入800ul预冷的无水こ醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20°C放置30分钟。(6) 11，OOOrpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。(7)用70%こ醇洗涤沉淀2遍，将I. 5ml离心管倒置于纸上，自然干燥。(8)加入50ul的1/10XTE缓冲液溶解沉淀。(9)取 I μ I 进行 PCR 扩增。3.分子标记开发本发明所用到的SSR标记信息来自于Gramene网站(www. gramene. org)。此外，根据珍汕97和密阳46在第6染色体短臂RM19410-RM19417区间的基因组片段测序結果，挑选具有InDel差异、PCR产物长度大约在100-500bp的片段进行分子标记开发，引物设计软件为Oligo 7. O (Lasergene公司)。应用设计的引物对珍汕97和密阳46检测，检查扩增效果和多态性，最终选用6个在珍汕97和密阳46之间呈多态的InDel标记(表I)。4. PCR 扩增反应体系如下335mMTris-HCL, pH 8. 8 ；80mM(NH4)2SO4 ；0. 9mM MgCl ；0. 05 %TWEEN-20 ；0. 2mM dNTPs ；3. 3ng/μ I 正向引物；3. 3ng/μ I 反向引物；O. 5 单位 TaqDNA 聚合酶/10 μ I ;1μ L DNA/10 μ I。
扩增条件如下94°C 2分钟；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C I分钟，30循环；
权利要求
1.ー种控制水稻谷粒产量的基因GY6，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。
2.如权利要求I所述的基因GY6，它的编码序列如序列表SEQID NO :2所示。
3.如权利要求I所述的基因GY6，它的编码氨基酸序列如序列表SEQID NO :3所示。
4.如权利要求I所述的基因GY6的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO 4所示。
5.如权利要求4所述的等位基因，它的编码序列如序列表SEQID N0:5所示。
6.如权利要求4所述的等位基因，它的编码氨基酸序列如序列表SEQID N0:6所示。
7.权利要求I或2或3所述的基因在作物遗传改良中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域，公开了分离克隆的控制水稻谷粒产量的基因GY6及其等位基因的核苷酸序列。所述序列如SEQ ID NO1(珍汕97)和SEQ ID NO4(密阳46)所示，包含4个外显子；其编码序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO6所示。两者在在编码区共存在11处单核苷酸多态，导致6个氨基酸变化。利用转基因技术获得了转GY6基因的水稻植株，转基因阳性植株表现出实粒数增加、千粒重提高、产量增加的特点。
文档编号C12N15/29GK102643829SQ20121004730
公开日2012年8月22日 申请日期2012年2月28日 优先权日2011年11月25日
发明者付亚萍, 刘文真, 庄杰云, 朱玉君, 樊叶杨, 程式华, 黄得润 申请人:中国水稻研究所