水稻籽粒产量相关基因及其用途的制作方法

本发明涉及水稻籽粒产量相关基因及其应用，属于作物分子遗传育种领域。

背景技术：

水稻是重要的粮食作物，高产育种是确保我国粮食安全和农业可持续发展的有效保障。水稻的产量与籽粒的粒重密切相关。粒重是指每粒种子的重量，很大程度上粒重由种子的大小和灌浆程度所决定。因此，在水稻中发掘能够提高水稻粒重的基因，对水稻高产育种有很大的应用价值。

水稻品种日本晴(英文名：nipponbare)第1染色体上含有1个序列已知、但功能未知的基因，在水稻rap-db数据库(http://rapdb.dna.affrc.go.jp)的accession为os01g0837600，在水稻tigr数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu)中的loc_os01g62060，具体如seqidno：1所示。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供水稻籽粒产量相关基因及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种促进水稻籽粒产量的基因及其突变体基因，该基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，该突变体基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。

本发明还同时提供了上述基因及其突变体基因的用途：促进水稻籽粒产量增加。

本发明的技术方案具体如下：

采用crispr/cas9基因定点突变技术，在该基因的编码区设计突变靶位点，在野生型日本晴基因组中对该基因进行突变，在从起始子atg开始的第112个碱基处插入了1个碱基t，导致从编码第38个氨基酸的密码子开始全部移码，突变位点的测序分析见图1。

水稻(野生型日本晴)中os01g0837600基因的核苷酸序列如seqidno:1所述，os01g0837600突变体基因的核苷酸序列如seqidno:2所述。

本发明通过对该突变体的农艺性状统计分析，与野生型对照日本晴相比，结果表明突变体的植株大小等性状没有显性差异，但是粒重却显著性增加(图2)。因此，该突变基因可增加水稻的籽粒产量，具有水稻高产育种应用的潜力，将该突变基因转育到常规栽培稻或超级杂交稻品种中，将能提高水稻的产量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为os01g0837600基因突变靶位点的测序分析；

野生型：水稻日本晴；突变体：水稻os01g0837600基因突变体。

图2是水稻os01g0837600基因突变体与日本晴的千粒重比较；

1：野生型对照日本晴；1～3：来自3个不同转基因株系的os01g0837600基因突变体；**表示t检验存在极显著性(p<0.01)差异。

具体实施方式

实施例1、os01g0837600基因的crispr/cas9载体构建

根据os01g0837600基因(seqidno:1所述)的第2个外显子编码区，设计crispr/cas9编辑的靶点序列sg:5’-ctgctacaacatgaacaagg-3’，其中为添加的pam识别序列，并在生物技术公司(如上海invitrogen)合成该sg序列的dna。按照文献《rna-guidedgenomeeditinginplantsusingacrispr-cassystem》(引自：molplant,2013,6(6):1975-1983)的方法，构建os01g0837600基因的crispr/cas9载体，该载体在转基因水稻中，对os01g0837600基因靶点序列sg进行编辑，可能导致碱基丢失或增加，引起os01g0837600基因移码突变。

实施例2、crispr/cas9载体的水稻遗传转化

水稻的组织培养与载体转基因，根据文献《aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice》(引自：natprotoc.2006,1(6):2796-2802.)的方法，将实施例1中构建的载体遗传转化到野生型水稻品种日本晴(英文名：nipponbare)中，获得os01g0837600基因突变的转基因水稻。

实施例3、os01g0837600基因突变株的测序分析

采用sds法提取转基因水稻的基因组dna：取水稻叶片0.1g，用液氮研磨后，加600μl提取液(0.1mol/ltris-clph8.0，500mmol/lnacl，1.25g/lsds)，65℃温育30min。加200μl5mol/lkac，混匀后，冰浴30min。再加500μl氯仿，混匀，10000r/min离心5min，取上清，加2/3上清体积的异丙醇，混匀，12000r/min离心5min。弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，倒置晾干，加100μlte溶解dna。

用pcr扩增os01g0837600基因的引物序列f:5’-gagctgcaaggctctctcgc-3’和r:5’-catgcatgcacctagtcgtcgt-3’，在生物技术公司(如上海invitrogen)合成引物的dna。pcr扩增用20μl体系，含25～50ng模板dna、100μmol/leachdntp、2μl10×buffer、 0.2μmol/l引物f与r、1uinttaqdna聚合酶。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min。pcr产物在含溴化乙锭(eb)的1％琼脂糖凝胶中电泳30min。

pcr产物在生物技术公司(如上海invitrogen)进行测序分析，获得转基因水稻的os01g0837600基因序列，用seqman软件进行比对分析，鉴定os01g0837600基因突变体，该突变体基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。

实施例4、转基因水稻的农艺性状鉴定

在相同的实验条件下(水稻生长最适宜的季节)，将os01g0837600基因突变体与野生型对照日本晴种植在实验田中，成熟后每个品种随机取30株，按照文献《中国稻种资源》(引自：中国农业科技出版社，1993)评价标准，测量水稻的产量等性状，进行3次生物学重复。采用t-test对突变体与野生型的测量数据进行显著性差异的分析。结果表明，野生型对照日本晴的株高为83.5±3.0cm、剑叶长为30.4±3.6cm、剑叶宽为1.29±0.13，os01g0837600基因突变体的株高为83.9±3.3cm、剑叶长为29.7±3.5cm、剑叶宽为1.29±0.12，两者在这些性状上都没有显著性差异，表明os01g0837600基因突变并没有显著性影响水稻植株的大小。但是，野生型对照日本晴的千粒重为23.7±0.21g，而os01g0837600基因突变体的千粒重为25.2±0.34g，极显著性(p<0.01)高于野生型对照日本晴。图2所示为3个不同转基因株系的os01g0837600基因突变体与野生型对照日本晴的千粒重比较。因此，得知：os01g0837600基因突变能促进水稻籽粒的产量。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。