一种基于ZmMIKC2a基因调节水稻籽粒淀粉含量的方法与流程

本发明涉及的是基因工程的技术领域，尤其涉及的是一种基于zmmikc2a基因调节水稻籽粒淀粉含量的方法。

背景技术：

淀粉是植物种子的主要组成部分，作为光合作用的最终产物，是取之不尽用之不竭的天然材料。淀粉不仅可以作为粮食、饲料，而且是重要的工业原材料，广泛用于食品、化工、能源、机械、建筑、制药等行业。水稻中，淀粉为水稻胚乳的主要组成成分，其含量和品质直接影响着水稻种子的品质。

淀粉根据结构不同分为直链淀粉和支链淀粉，淀粉中直链淀粉和支链淀粉的比例以及支链淀粉的分支链结构决定着水稻的品质，同时直链淀粉和直链淀粉之间的比例还决定着淀粉的用途。直链淀粉生产的可再生、可降解膜应用于农用薄膜加工业和包装工业，可以减少工业废气及减弱温室效应气体的释放，高直链淀粉还是生产光解塑料的最佳原料，用于一次性餐具，是解决日益严重的“白色污染”的有效途径；支链淀粉具有更好的薪性，可增加膨化食品的体积，作为食品添加剂具有不同于直链淀粉的效果，在黏合剂领域具有较多应用。

一般来说，结构良好的天然淀粉在胃肠道内能被迅速消化吸收，不会再有多余淀粉进入结肠供细菌发酵而导致疾病的产生。而结构不良的淀粉，要使用各种理化方法对其进行结构修饰后方能投入应用。这会面使生产成本大大增加。此外，食用结构不良淀粉也使人类的营养和健康状况受到严重影响。此外，淀粉食品的风味及贮存性质在不同程度上也受淀粉结构的影响，实践证明，用高直链淀粉作为食品的添加剂口感和效果都比普通淀粉好。在这种需求下，淀粉结构形成机理成为近期研究工作中的热点，由于淀粉在人类生活中的重要作用，对于淀粉品质的改良及淀粉生物合成已成为研究的热点。随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，粮食作物与淀粉合成相关基因的相继克隆，人们期望通过对这些基因进行调控以改良淀粉的含量及直链和支链淀粉的构成，这使得在作物体内直接生产出结构适宜的、能满足人类相应需求的“天然淀粉”已成为可能。

在禾谷类胚乳中淀粉的合成是一个多酶催化的复杂过程，主要涉及四大类酶：adp-葡萄糖焦磷酸化酶(agpase)、淀粉合成酶(sss)、淀粉分支酶(sbes)、淀粉去分支酶(dbes)。这四大类酶都包括许多家族成员，各成员又有精细分工，在淀粉合成过程中发挥不同的作用。直链淀粉是由α-1,4糖普键连接的线性多聚物，通常只含有很小程度的分支。在正常作物种子中，直链淀粉约占储藏淀粉的20-30％，它对于淀粉颗粒的形成并非必要。淀粉的颗粒结构主要是由于支链淀粉的折叠而形成的。agpase是淀粉合成过程中非常关键的酶，因此其对其活性的影响会直接影响到淀粉的合成。淀粉合成酶是通过催化α-1,4-葡聚糖链，在adp-葡萄糖上不断的添加寡聚糖，从而实现葡聚糖链的延伸。根据淀粉体中存在的状态，可分为颗粒结合型淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase，gbss)和可溶性淀粉合成酶(solublestarchsynthase，sss)。直链淀粉主要是由颗粒结合型淀粉合成酶gbssi负责合成的。淀粉合成酶将adpg(adp-葡萄糖)中的葡萄糖基添加到支链淀粉的分支链或直链淀粉的非还原性末端。淀粉合成酶可分为5个家族：ssi、ssii、ssiii、ssiv和gbss。它们分别延伸支链淀粉中不同聚合度的支链，或者延伸线性的直链淀粉链。gbss家族有两个成员：gbssi和gbssii。gbssi由wx基因编码，主要负责胚乳和花粉粒中直链淀粉的合成。gbssii主要在叶片中表达，负责非储藏器官中的直链淀粉的合成。在玉米、小麦、水稻、马铃薯的gbssi缺失突变体中，贮藏器官淀粉粒中仅含有支链淀粉组分，几乎不含有直链淀粉成分。gbssi是唯一能够连续地延伸直链淀粉的淀粉合成酶，生成长的寡糖链。多糖链的分支通过淀粉分支酶来实现，在淀粉分支酶(sbe)催化作用下，剪切掉多糖链内部的α-1,4糖苷键，释放还原端，产生一个α-1，6糖苷键，结合上可溶性糖链形成分支。sbe在支链淀粉合成过程中扮演着不同的角色，由于直链淀粉分支较少，sbe在直链淀粉的分支过程中也一定起重要作用。淀粉去分支酶的功能是去除一些不规则的分支。对玉米、水稻和拟南芥的isa酶突变体分析发现，该酶的突变能直接导致淀粉含量的降低，不正常的淀粉结构、颗粒形态和植物糖原的积累，而pul主要在淀粉降解过程中起作用，然而在淀粉合成过程中也起作用，其突变影响淀粉含量和结构。

综上，通过基因工程手段培育直链淀粉和支链淀粉的比例各不相同的植物对于淀粉工业化生产是迫切需要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于zmmikc2a基因调节水稻籽粒淀粉含量的方法，以提供一种能够提高水稻籽粒直链淀粉含量和直链淀粉/总淀粉比例的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种基于zmmikc2a基因调节水稻籽粒淀粉含量的方法，所述zmmikc2a基因为下述i)或ii)的dna分子：

i)核苷酸序列如seqidno.1所示的dna分子；

ii)核苷酸序列与seqidno.1至少具有98％同一性且编码如seqidno.2所示的氨基酸序列的dna分子；

所述方法为：以人工合成或基因克隆方法获得所述zmmikc2a基因，构建zmmikc2a基因过量表达载体，并将过量表达载体导入目的水稻基因组中，得到籽粒直链淀粉含量以及直链淀粉/总淀粉比例均高于目的水稻的zmmikc2a基因过量表达植株。

所述zmmikc2a基因的获得方法为基因克隆法，具体步骤包括：提取玉米籽粒胚乳或玉米花丝rna并反转录成cdna，以cdna为模板，根据zmmikc2a基因序列设计特异性扩增引物，进行pcr扩增。

进一步地，所述特异性扩增引物序列为：

mikc2a-f：5′-atgggtaggggaaggattga-3′

mikc2a-r：5′-ttagaactgatgatgagggttattg-3′

进一步地，所述步骤(2)中，zmmikc2a基因过量表达载体为多克隆位点区域依次连接有35s启动子、zmmikc2a基因和终止子的pcambia1301植物表达载体。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种基于zmmikc2a基因调节水稻籽粒淀粉含量的方法，该方法利用zmmikc2a基因对植物籽粒淀粉合成相关基因的正调控作用，通过基因工程的方法改变水稻籽粒中直链淀粉含量和直链淀粉/总淀粉比例，获得具有高直链淀粉的转基因水稻新品种，对利用基因工程技术开发具有特定功能的转基因水稻新品种具有重要的实践意义。

附图说明

图1为peasy-t1载体图谱；

图2为pcambia1301载体图谱；

图3为zmmikc2a转基因水稻籽粒大小和千粒重测定结果柱状图；其中图3a为水稻籽粒长度测定结果，图3b为水稻籽粒宽度测定结果，图3c为水稻籽粒厚度测定结果，图3d为水稻籽粒千粒重测定结果；wt为野生型植株，c1-3为转p1空载体的转基因植株，l1-5为过量表达植株；

图4为zmmikc2a转基因水稻籽粒直链淀粉和总淀粉含量柱状图；其中图4a为直链淀粉含量，图4b为总淀粉含量；wt为野生型植株，c1为转p1空载体的转基因植株，l1-5为过量表达植株。

具体实施方式

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1zmmikc2a基因的获得

选取玉米b73品种授粉后16天的籽粒胚乳，提取玉米胚乳rna并反转录成cdna，以玉米胚乳cdna为模板，根据zmmikc2a基因序列和玉米b73基因组数据库，结合植物表达载体的多克隆位点设计引物mikc2a–f-1、mikc2a–r-1，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物。

引物序列为：

mikc2a–f-1：5′-ggggtaccatgggtaggggaaggattga-3′

mikc2a–r-1：5′-tcccccgggttagaactgatgatgagggttat-3′

pcr反应程序为：98℃，预变性10min；98℃，变性20s；60℃，退火20s；72℃，延伸2min，30个循环；72℃，复性10min；10℃保存。

将pcr扩增产物用质量比为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段并连接至peasy-t1载体(购于全式金生物技术有限公司，载体图谱如图1所示)，获得连接产物。将连接产物转化到大肠杆菌感受态trans5α细胞中，提取质粒。以提取的质粒做模板，以mikc2a-f-1、mikc2a-r-1为引物进行pcr扩增验证，同时用kpni和smai双酶切质粒进行检测，筛选阳性克隆子，将阳性克隆子送去华大生物公司进行测序，测序结果使用mega4.0软件比对，结果与预测一致。获得的重组质粒命名为t-mikc2a。

2.2zmmikc2a基因过量表达载体的构建

以pcambia1301(购于上海捷兰生物技术有限公司，载体图谱如图2所示)为原始载体，在其多克隆位点的ecori和saci酶切位点之间连接一个35s启动子，并在sphi和hindiii酶切位点之间加上一段nos终止子，获得改造的载体p1。用kpni和smai双酶切t-mikc2a得到小的目的片段，同时用kpni和smai双酶切p1得到大的目的片段，将上述两片段使用t4连接酶连接，构建获得载体p1-zmmikc2a，作为转水稻的zmmikc2a基因过量表达载体。

2.3农杆菌介导的zmmikc2a基因过量表达植株的获得

农杆菌介导的过量表达植株的获得方法及培养过程中使用的培养基配方参见文献：methodsinmolecularbiology，vol.343：agrobacteriumprotocols，2/e，volume1，具体包括以下步骤：

2.3.1水稻成熟胚诱导愈伤的获得

在实验前，将目的水稻的成熟种子在强太阳光下晒3-4h后对其去壳处理。先用灭菌水洗，水至清，再用75％(质量)乙醇浸泡5min，然后用灭菌水、次氯酸和吐温配制的杀菌水(具体比例：灭菌水：次氯酸＝1：1，总体积：吐温＝1ml:1ul)浸泡30min，期间不停的摇晃，从而进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗，直至水变澄清，再将成熟种子放在灭菌滤纸上吸干水分后，取其于愈伤诱导培养基上，26±1℃培养；10-15d后，将诱导出的乳黄色愈伤转入继代培养基上继代培养。每两周继代培养一次，继代两次后挑选继代培养5-7d，将色泽淡黄的愈伤用于共培养。

2.3.2用于转化水稻的农杆菌菌液的准备

将p1-zmmikc2a转化农杆菌lba4404中，获得重组农杆菌lba4404/p1-zmmikc2a，同时将未连接zmmikc2a的p1空载体转化农杆菌lba4404中，获得重组农杆菌lba4404/p1作为对照。分别将重组农杆菌lba4404/p1-zmmikc2a、lba4404/p1接种于yep液体培养基(含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28℃振荡培养至od600＝0.6-1.0；室温下5000rpm离心5min收集菌体，随后将其悬浮于液体共培养基中，调整菌体浓度至od600＝0.4，获得共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

2.3.3农杆菌侵染水稻营养器官

挑选色泽鲜嫩、呈乳黄的愈伤，集中放入100ml无菌三角瓶中，加入上述制备好的农杆菌悬浮液(悬浮液以淹没愈伤为好)；28℃，220rpm摇床上培养20-30min；倒掉菌液，将侵染后的愈伤置于含无菌滤纸的培养皿上吸去多余菌液，随即转移到固体共培养基上，22℃暗培养2-3d。

2.3.4选择培养

将共培的愈伤先用灭菌水清洗直至水变澄清，弃去清洗液，转入含有羧苄青霉素(100mg/ml)的溶液中振荡清洗30min以上，用无菌滤纸吸干，置于含无菌滤纸的培养皿中干燥处理；再将愈伤挑选到含有羧苄青霉素(500mg/ml)和潮霉素(50mg/l)筛选培养基上，28℃光照培养30d左右，直至长出新的抗性愈伤。

2.3.5抗性愈伤的分化

从筛选培养基上挑选长势较好呈乳黄色的新愈伤于含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，先28℃暗培养3d，然后转移到30℃条件下进行全光照培养，15-30d，有绿点出现；30-40d后会分化出幼苗。

2.3.6生根、壮苗和移栽

待分化出的幼苗h≥3cm时，转移至生根培养基上，培养2-3周；选择h≥15cm、根系发达的幼苗，加水室温下炼苗2-3d后，用温水洗去培养基，移入含水稻培养土的水桶中栽培。待苗生长健壮后移入水田中生长，获得26株独立转化事件的转zmmikc2a基因水稻苗和43株转p1空载体的水稻苗。

2.4转基因水稻的鉴定

为了检测转基因水稻，以提取的转基因水稻总dna为模板，用目的基因zmmikc2a片段和潮霉素基因为检测对象，设计引物，进行pcr扩增，用以初步鉴定转zmmikc2a基因植株；同时以潮霉素基因为检测对象，初步鉴定转p1空载体植株。

检测目的基因zmmikc2a片段的引物：

mikc2a–f-2：5’-atgggtaggggaaggattga-3’

mikc2a–r-2：5’-ttagaactgatgatgagggttattg-3’

pcr反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸2min，30个循环；72℃总延伸6min。

检测潮霉素基因的引物：

hyg-f：5’-taggagggcgtggatatggc-3’

hyg-r：5’-tacacagccatcggtccaga-3’

pcr反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃总延伸10min。

结果，26株独立转化事件的转zmmikc2a基因水稻苗中有22株同时扩增出目的基因zmmikc2a片段和潮霉素基因，43株转p1空载体的水稻苗中全部扩增出潮霉素基因，将该22株转zmmikc2a基因植株进行southern杂交，全部验证通过，即获得了22株t0代转基因植株(命名为l1-22)和43株t0代转p1空载体植株(命名为c1-43)。t0代转基因植株成熟后，收获t1代种子，t1代种子自交繁殖得到t2代种子。依次类推，获得zmmikc2a基因过量表达的转基因水稻株系和转p1空载体的对照株系。

2.5zmmikc2a转基因水稻籽粒大小和千粒重测定

选取五株转基因株l1、l2、l3、l4、l5的t3代籽粒进行大小和千粒重测量。籽粒大小使用游标卡尺单粒逐个测量，五个独立转化株其t3代籽粒分别选取了1000粒，分部对籽粒长、宽以及厚度进行测定，实验至少三次重复；千粒重使用电子天平，每百粒计数称重，五个独立转化株其t3代籽粒分别选取10个100粒计重，相加数即为千粒重量，三个重复。

实验以野生型中花11(wt)和三株转p1空载体株c1、c2、c3为对照，结果如图3所示，五个独立转化株籽粒的长度(图3a)、宽度(图3b)、厚度(图3c)以及千粒重(图3d)变化不大，说明zmmikc1a基因的转入对水稻籽粒外部表型影响不大。

2.6zmmikc2a转基因水稻籽粒直链淀粉和总淀粉含量测定

取5株独立转化事件转基因株l1、l2、l3、l4、l5的t3代籽粒进行直链淀粉和总淀粉测定，并以野生型目的玉米籽粒(wt)和转p1空载体株c1做对照，每次实验测定至少重复三次，测定方法如下：

直链淀粉测定时，首先对籽粒中淀粉进行提纯，将烘干去硬壳和胚的种子在室温下用0.4％(质量分数)的naoh溶液浸泡48h，料液(样本比0.4％的naoh溶液)比为1:3，洗涤后再用0.4％的naoh溶液浸泡24h，反复水洗至种子表面不再黏滑为止，沥干水分，用胶体磨粉碎，淀粉乳过筛(200目)，离心(3000r/min,20min)，取下层白色沉淀,即为淀粉,将淀粉反复漂洗离心，40℃鼓风干燥，粉碎，过筛(200目)，即得淀粉纯品，用于直链淀粉的测定。直链淀粉的测定采用爱尔兰megazyme公司生产的直链淀粉/支链淀粉分析试剂盒(货号：k-amyl)，测定方法可参见试剂盒说明书，在此不做详细描述。

总淀粉测定时，先将烘干的种子去硬壳和胚，再使用组织研磨仪将其研磨成粉末，40℃过夜烘干，过0.5mm筛(35目)。总淀粉测定采用爱尔兰megazyme公司生产的总淀粉测定试剂盒(货号：k-tsta)，具体为：将研磨后样品(准确称量～100mg)加入到试管中(16×120mm)，确保全部样品位于试管底部；加入0.2ml乙醇溶液(80％v/v)，用漩涡混合器混合；放入搅拌架子，加入2ml的2mol/l的koh至每个试管中，冰水混合浴中搅拌20min左右，重悬粉末和溶解抗性淀粉(注意：不要使用涡旋仪混匀，会使淀粉乳化，确保加入koh时，试管处于剧烈震荡状态。这是为了避免淀粉形成团块难以溶解)；当试管在磁力搅拌器上搅拌时，加入8ml的1.2mol/l醋酸钠缓冲液(ph3.8)至每个试管。立即加入0.1ml耐热α-淀粉酶(试剂盒配置溶液)和0.1ml淀粉葡糖苷酶(试剂盒配置溶液)，充分混合，在50℃下孵育；孵育30min，间断混匀；样品淀粉含量>10％：将全部的溶液转移到100ml的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积至100ml,充分混匀。取部分溶液离心(1800rpm,10min)；转移两份稀释的样品溶液(0.1ml)到圆底试管中(16×100mm)；加入3.0mlgopod溶液(试剂盒配置溶液)到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白对照),然后在50℃下孵育20min；葡萄糖对照包括0.1ml葡萄糖标准溶液(1mg/ml)+3.0mlgopod溶液。试剂空白对照：0.1ml蒸馏水+3.0ml的gopod溶液；相对于试剂空白在510nm下测定每一个样品和葡萄糖质控的吸光度。计算公式如下：

δa＝相对于试剂空白所读取的吸光度；fv＝总体积(例如100ml或10ml)；0.1＝样品分析体积；1/1000＝转化从μg至mg；100/w＝淀粉作为干粉重量的比例；w＝干粉重量；162/180＝d葡萄糖转化为脱氢葡萄糖；淀粉％(占干物质比重)＝淀粉％×100/100-水分含量(％)。

结果如图4所示,图中可以看出，zmmikc1a转基因水稻籽粒直链淀粉和总淀粉含量都有所提高，其中直链淀粉含量增加幅度在1.75％-21.03％(图4a)，总淀粉含量增加幅度为1.65％-6.87％(图4b)。zmmikc1a基因过量表达，提高了水稻籽粒中直链淀粉和总淀粉的含量，特别是直链淀粉含量。说明zmmikc1a基因能直接或间接影响淀粉合成过程中直链淀粉相关基因的表达，对直链淀粉表达起正调控作用。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

sequencelisting

<110>安徽省农业科学院烟草研究所

<120>一种基于zmmikc2a基因调节水稻籽粒淀粉含量的方法

<130>/

<160>2

<170>patentinversion3.3

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