一种检测黄曲霉素B1的试纸条及方法与流程

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉素b1的试纸条及方法。

背景技术：

黄曲霉素b1(afb1)是由黄曲霉和寄生曲霉等所产品的一种次生代谢物，其进入人体或者动物体内后，会导致急、慢性毒性，严重时，会导致人体或动物体发生癌变或畸变。近年来，黄曲霉素b1(afb1)超标现象频繁的出现在各种食品、药品中，对人的健康构成严重威胁。

目前，检测afb1的方法有很多，常用的有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、色谱质谱联用法、酶联免疫吸附法等。这类方法要么检测仪器和成本昂贵，要么存在操作不便、检测时间长等问题。

适配体(aptamer)为一种人工合成的单链的dna或rna序列，对特定的靶分子(如小分子，蛋白质等)具有很高的特异性，被认为是一种化学抗体。afb1的特异性适配体于2012年被加拿大的neoventuresbiotechnologyinc公司首次报道。之后，基于适配体构建的afb1的检测方法就越来越引起关注。目前，利用afb1适配体建立的afb1试纸条的检测方法有胶体金层析法、侧向层析定量法等，但灵敏度普遍较低。

公开为cn105784990a的专利申请公开了一种利用适配体检测黄曲霉毒素b1的试纸条及检测方法，检测黄曲霉毒素b1的灵敏度为0.5ng/ml，仍需进一步改进。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测黄曲霉素b1的试纸条及方法。

本发明提供了一种发卡式单链dna，由a、b、c三段串联组成，其中，b段为黄曲霉素b1的适配体序列，a段可与c段互补，a段包含3-30个核苷酸。

其中，b段的序列如seqidno.1所示。

其中，由a、b、c三段串联组成的序列如seqidno.6所示。

本发明还提供了上述dna在制备检测黄曲霉素b1的试剂或试纸中的用途。

本发明还提供了一种用于检测黄曲霉素b1的试纸条，它包括上述dna。

其中，它还包括seqidno.4和seqidno.5所示的序列。

其中，如图2(1)所示，试纸条包括样品吸收垫、标记物结合垫、反应膜和吸水纸垫、底板，反应膜上有检测区和质控区，标记物结合垫包被有标记探针，所述标记探针为荧光团标记的上述dna；

检测区包被有检测探针，所述检测探针为生物素标记的一种核苷酸序列，其由二段串联组成；一段为seqidno.3所示的序列，另一段为seqidno.1所述序列的非互补链，包含0-50个核苷酸；

质控区包被有质控探针，所述质控探针为生物素标记的一种核苷酸序列，其与黄曲霉素b1的适配体序列互补；

优选地，

所述荧光团为荧光微球、胶体金，量子点，荧光蛋白，鲁米诺，cy5；

所述检测探针为生物素标记的seqidno.4所示序列；

所述质控探针为生物素标记的eqidno.5所示序列；

其中，所述生物素还偶联了链霉亲和素。

本发明还提供了上述试纸条的制备方法，步骤如下：

(1)取样品吸收垫、吸水纸垫，备用；

(2)合成上述标记探针，将其包被在标记物结合垫上，备用；

(3)制备反应膜：合成上述检测探针、质控探针；分别将链霉亲和素与检测探针、质控探针上的生物素偶联后，包被在反应膜上形成检测区、质控区，备用；

(4)依次将样品吸收垫、步骤(2)得到的标记物结合垫、步骤(3)制备的反应膜、吸水纸垫固定在底板上，即可。

包被方式为滴加，手动划线，喷涂，浸泡等方式。

所述底板的材料为pvc。

本发明还提供了上述试纸条在检测黄曲霉毒素b1中的用途。

本发明还提供了一种检测样品中黄曲霉毒素b1的方法，步骤如下：

(1)样品前处理；

(2)用上述试纸条进行检测；

(3)对检测结果进行分析，即可。

本发明afb1试纸条检测待测样品中afb1的原理：当待测样本中不含afb1(见图2，(2)所示)，标记物结合垫处的标记探针随着层析方向向右移动，由于标记探针中的dna分子发夹处的序列2(seqidno.2)已经与序列3(seqidno.3)形成双链，不会与反应膜的检测区的序列4(seqidno.4)互补结合，因此在检测区不会出现亮线。当标记探针层析到质控区，标记探针中的afb1适配体则会与质控区的序列5(seqidno.5)互补结合，因此在质控区会出现亮线；当待测样本中含有afb1(见图2，(3)所示)，afb1先与标记物结合垫处的标记探针中的afb1适配体结合，同时，标记探针中的dna分子发夹的双链部分被打开，afb1与标记探针形成的复合物层析到反应膜的检测区时，标记探针中的序列2(seqidno.2)与检测区的序列4(seqidno.4)互补结合，导致标记探针形成的复合物在检测区被捕获，从而检测区出现亮线。而过量未反应的标记探针层析到质控区处，被质控区的序列5(seqidno.5)捕获，从而质控区也出现亮线。待测样本中afb1的含量越高，结合所述试纸条标记物结合垫处的标记探针的量就越多，未结合的标记探针就越少，检测区荧光信号t值就越大，对应的荧光信号的t/c值也就越大。根据t/c值，通过标准曲线方程就可以检测样本中的afb1的含量。

一般检测afb1的侧向层析方法均需要用载体蛋白，通过竞争法实现对afb1的检测。本发明人通过设计特定的荧光团标记的核酸序列，建立了一种检测区信号从‘无’到‘有’的检测afb1的试纸条及方法。

本发明发卡式单链dna可以用于制备检测黄曲霉素b1的试纸条，使用本发明试纸条及方法可以准确检测黄曲霉素b1，灵敏度高达0.05ng/ml，灵敏度和特异性高、适用性广，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为荧光微球标记的dna分子发夹的结构式图。

图2为本发明试纸条及方法的检测原理示意图。

图3为稀释afb1标准品得到的afb1的浓度梯度样本的检测结果。

图4为不同浓度的afb1与荧光信号t/c值的标准曲线图。

图5为零浓度校准品与0.1ng/ml的标准品-t/c值的线性拟合曲线图。

图6为本发明试纸条及方法的特异性检测图。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。本发明所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1本发明afb1试纸条及制备方法

一、试纸条的组成

本发明检测黄曲霉素b1的试纸条，如图2(1)所示。

试纸条包含底板，及依次固定在底板上的样品吸收垫、标记物结合垫、反应膜和吸水纸垫，反应膜上有检测区(t)和质控区(c)，试纸条由塑料卡壳包装。

其中，标记物结合垫包被有标记探针，标记探针为荧光团标记的seqidno.6所示序列；荧光团可以是荧光微球、胶体金，量子点，荧光蛋白，鲁米诺或cy5；

检测区包被有检测探针，检测探针为链霉亲和素偶联生物素标记的seqidno.4所示序列；

质控区包被有质控探针，质控探针为链霉亲和素偶联生物素标记的seqidno.5所示序列。

二、试纸条的制备方法

本发明中所有序列均是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，生物素标记也是由该公司直接完成。

(一)标记探针、检测探针和质控探针的合成

1、标记探针的合成

标记探针为荧光微球标记的dna分子发夹，见图1。荧光微球标记dna分子发夹是通过碳二亚胺法实现的。

dna分子发夹是由afb1适配体(序列见seqidno.1)构成的‘环’，以及两段互补序列(seqidno.2和seqidno.3)构成的‘茎’组成的；afb1适配体与样品中的afb1结合后，会导致‘茎’的部分被打开。

dna分子发夹的核苷酸序列如下(seqidno.6)：

5’-nh2-(ch2)6-tttttttt-gtt-ggg-cac-gtg-ttg-tct-ctc-tgt-gtc-tcg-tgc-cct-tcg-cta-ggc-cca-ca-aaaaaaaa-3’。

afb1适配体(seqidno.1)

gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccaca

seqidno.2：tttttttt

seqidno.3：aaaaaaaa

2、检测探针的合成

检测探针为生物素标记的序列4(seqidno.4)核苷酸序列，在afb1适配体与样品中的afb1结合导致‘茎’的部分被打开后，检测探针中的序列4(seqidno.4)可以与标记探针中的序列2(seqidno.2)段互补，从而实现检测区捕获荧光团。

seqidno.4aaaaaaaaaaaa

3、质控探针的合成

质控探针为生物素标记的afb1适配体的互补单链挂核苷酸序列，可以与标记探针中的dna分子的‘环’通过碱基互补结合。质控探针中的afb1适配体的互补单链寡核苷酸序列为：

5’-biotin-tgt-ggg-cct-agc-gaa-ggg-cac-gag-aca-cag-aga-gac-aac-acg-taccc-aac-3’

seqidno.5：

tgtgggcctagcgaagggcacgagacacagagagacaacacgtacccaac

(二)制备afb1试纸条

1、标记物结合垫的制备

通过碳二亚胺法，在dna分子发夹上偶联荧光微球，得到偶联物标记探针。然后利用喷金划膜仪(购自杭州峰航科技)，将标记探针喷涂在标记物结合垫上(怀远县通成纸制品有限公司，金标垫8955)，(包被浓度为0.5μm)，得到包被标记探针的标记物结合垫；

2、反应膜的制备

反应膜包括检测区(t)和质控区(c)。所用膜为millipore135的硝酸纤维素膜。

通过链霉亲和素与检测探针上的生物素反应，然后利用喷金划膜仪，将检测探针包被在反应膜上形成检测区，包被浓度为1μm。

链霉亲和素与质控探针上的生物素反应，然后利用喷金划膜仪，将质控探针包被在反应膜上形成质控区，包被浓度为1μm。

3、试纸条的制备

试纸条由样品吸收垫(怀远县通成纸制品有限公司，通用垫8975)、上述步骤1制备的包被标记探针的标记物结合垫、上述步骤2制备的反应膜、吸水纸垫依次按照顺序黏贴在pvc底板(怀远县通成纸制品有限公司，42pvc胶板)上，其顺序参照附图2(1)所示。

4、试纸条的卡壳组装

将步骤3制备得到的试纸条手动组装塑料卡壳(青岛广达森塑胶有限公司)，然后用压壳机压紧，得到成品的试纸条。

实施例2本发明afb1试纸条的使用方法

一、使用本发明试纸条检测样品中是否存在afb1

取待测样本100μl，从试纸条的样品滴加处加样，10分钟后，将滴加了待测样本的试纸条放入荧光测试仪fa50(深圳锦瑞生物科技股份有限公司)中，进行检测，当待测样本中不含afb1，检测区不会出现亮线，质控区会出现亮线；当待测样本中含有afb1，检测区出现亮线，质控区也出现亮线。待测样本中afb1的含量越高，检测区出现亮线，质控区也出现亮线。

如果使用的荧光团的发射波长在人肉眼可见光的范围内(390～780nm)，例如胶体金，亮线可通过直接肉眼观察：如果使用的荧光团的发射波长不在人肉眼可见光的范围内，则需要使用荧光测试仪检测亮线。

二、使用本发明试纸条检测样品中afb1含量

1、取afb1的标准品，配制浓度梯度的系列样本(用水或生理盐水稀释配制)；

2、将配制的afb1的标准品的每一个样本，分别取100ul，然后分别滴加到实施例1制备的试纸条的样品吸收垫上；10分钟后，将滴加了标准品的试纸条依次放入荧光测试仪fa50(深圳锦瑞生物科技股份有限公司)中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度，然后将检测区的荧光信号强度(t)比上质控区的荧光信号强度(c)，得到t/c值。根据每个样本的浓度与该浓度对应的荧光信号的t/c值，制作曲线并拟合线性方程，得到标准曲线方程。结果见图3-4。

3、将待测样本代替标准品溶液，用上述试纸条做相同过程的检测。记录该待测样本的检测区和质控区的荧光信号比值t/c，根据步骤2中的标准曲线方程，计算得到待测样本中afb1的含量。

对待测样本的说明：待测样本可以是液体样本或固体样本。

液体样本：可以牛奶、口服液等，如果是高浓度液体样本，则需要进行样本稀释，用样本稀释液(如生理盐水，磷酸盐缓冲液)进行稀释，至afb1检测的线性范围内。对于未知样本，直接测试时，根据得到的t/c值，通过线性方程来计算该未知样本的浓度，如果计算结果接近或超过线性范围的上限(本专利的afb1的线性范围上限为50ng/ml)，则需要稀释样本进一步确定该未知样本浓度。稀释时，可以做10倍，100倍，甚至1000倍不同倍数的稀释确保稀释后的浓度在线性范围内。

固体样本：需要进行前处理过程，包括消解、萃取、稀释等。以花生粕为例，测定过程如下：称取1g花生粕，加入4ml正己烷和5ml70％的甲醇水溶液进行消解，离心后取下层液体1ml，加入9ml生理盐水进行萃取。然后取100μl样本滴加测试。如果样本超过了线性范围，则需要进一步稀释，直至稀释后的浓度在线性范围内，稀释时可以用生理盐水或者磷酸盐溶液。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明试纸条及方法的特异性检测

配制浓度为10ng/ml的afb1、1000ng/ml的黄曲霉素m1(afm1)、1000ng/ml的黄曲霉素g1(afg1)、1000ng/ml的黄曲霉素b2(afb2)、1000ng/ml的赭曲霉素a(ota)、1000ng/ml的玉米赤霉烯酮(zen)，以及1000ng/ml的呕吐霉素(don)溶液和空白样品，用实施例1制备的试纸条分别进行测定，用荧光检测仪fa50分别测定每个样本检测区和质控区处的荧光强度，结果见图6。

结果表明，6种干扰物(afm1，afg1，afb2，ota，zen，don)虽然使用量为afb1浓度的100倍，但得到的t/c值跟空白样品的t/c值相当；而相对它们1％浓度的afb1得到的t/c值明显比空白样品大的多。

可见，本发明试纸条及方法，检测结果与样品的实际情况一致，说明本发明试纸条及方法具有良好的特异性，可以准确检测黄曲霉素b1。

试验例2、本发明试纸条及方法的灵敏度检测

灵敏度计算方法参照《gb/t26124-2011临床化学体外诊断试剂(盒)》中给定的灵敏度计算方法进行，方法如下：

重复测定零浓度标准品(即样本稀释液，如生理盐水)20次，得出20次测量结果的t/c值，计算其平均值(cm)和标准差(sd)，得出cm+2sd所对应的t/c值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度(即0.1ng/ml)-t/c值结果进行两点回归拟合得出一次方程(见图5)，将cm+2sd所对应的t/c值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为检测灵敏度。根据此方法，得到所述方法的检测灵敏度为0.05ng/ml。

可见，本发明试纸条可以检测到0.05ng/ml的低浓度黄曲霉素b1，灵敏度高。

试验例3本发明试纸条及方法在牛奶afb1检测中的应用

1、标准曲线的绘制

配制不同浓度的afb1标准品水溶液，用实施例1制备的试纸条分别进行测定，用荧光检测仪fa50分别测定检测区和质控区的荧光强度，结果见图3。可见，随着afb1浓度的增加，检测区处荧光强度与质控区的荧光强度的比值逐渐增强。利用t/c值，绘制检测afb1的标准曲线见图4。得到标准曲线方程：y＝0.05962x+0.07598，r²＝0.9922，其中y为t/c，x为样本浓度值。

结果显示，在afb1标准品的浓度在0.1～50ng/ml范围内，t/c值与标准品的浓度有很好的线性关系，r²为0.9922。

可见，本发明试纸条在线性范围具有良好的线性关系，r²>0.99，说明本发明试纸条能够准确的计量检测样本中的afb1浓度。

2、样本的测定

取某品牌牛奶1ml，加入9mlph7.4的磷酸盐缓冲液，混合均匀后，将样品溶液分成两份，一份通过液相色谱-质谱联用(lc-ms)方法进行检测,另外一份用上述制作的afb1试纸条进行检测。

3、检测结果

液相色谱-质谱联用(lc-ms)方法检测得到该品牌牛奶样本中afb1的含量为12.5ng/ml。

通过afb1试纸条测试得到的t/c值为0.1537，根据步骤1中的标准方程，以及稀释倍数，计算得到该牛奶样本中的afb1的含量为13.04ng/ml，这一结果与lc-ms法误差低于10％。

可见，本发明试剂条及方法对黄曲霉素b1检测的结果与液相色谱-质谱联用法相当，说明本发明试剂条及方法可准确检测黄曲霉素b1。

综上，本发明试纸条及方法可以准确检测黄曲霉素b1，灵敏度和特异性高、适用性广，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。

sequencelisting

<110>中山火炬职业技术学院

赵,斌

<120>一种检测黄曲霉素b1的试纸条及方法

<130>gy149-17p1211

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<213>afb1适配体序列

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<213>检测探针的序列

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<213>质控探针的引物

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<213>dna分子发夹的核苷酸序列

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ttttttttgttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccacaaa60

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