专利名称：一种高效表达鸡γ干扰素重组载体的构建及活性检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达鸡Y干扰素重组载体的构建及活性检测， 属于用分子生物学领域。
技术背景干扰素(Interferon，IFN)是一类由T淋巴细胞和NK细胞产生的低分子可溶性多功能糖蛋白，能增强细胞毒性T细胞功能，促进B细胞分化和活化，诱导动物细胞产生多种抗病毒、抗肿瘤活性的细胞因子，具有良好的免疫调节作用(HOU Y-D. Molecular virology. Beijing :Xueyuan Press,1990.)。
鸡、干扰素最早由Issaacs等于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时发现的，之后得益于生物技术的飞速发展，鸡Y干扰素的生物学研究进入到一个更为深入广泛的研究阶段。20世纪80年代初，人和许多哺乳动物干扰素基因也相继被克隆。近几年，Digby、Sick等国内外学者相继报道了鸡γ干扰素基因序列，在基因克隆、序列分析和体外重组表达等方面进行了大量的研究。已有的研究表明，鸡Y干扰素开放性阅读框有495个碱基，编码19个氨基酸的信号肽和145个氨基酸的成熟蛋白。鸡γ干扰素对某些病毒(腺病毒，流感病毒，水疱性口炎病毒等)的生长及繁殖有较强的抑制作用， 可作为一种活化机体细胞的抗病毒生物制剂，同时也可作为免疫佐剂提高疫苗的保护效力 (Kaiser P, Wain H Μ, Rothwell L. Structure of the chicken interferon-y gene and comparison to mammalian homologues. Gene,1998,207(1) :25-32 ；Digby M R,Lowenthal J W. Cloning and expression of the chicken interferon-gamma gene. J IFN Cyto Res, 1995,15 :939-945 ；Weining K C, Schultz U, Munster U, et al. Biological properties of recombinant chicken interferon-gamma. Eur J Immunol. 1996,26 :2440-2447 ； Michalski W P,Shiell B J,ONeil TE,et al. Recombinant chicken IFN-gamma expressed in E. coli analysis of C-terminal truncation and effect on biologic activity. J IFN Cyto Res, 1999,19 :383-392 ；Yeh H Y, Winslow B J, Junker D E, et al. In vitro effects of recombinant chicken interferon-gamma on immune cells. J IFN Cyto Res, 1999，19 :687-691)。发明内容
本发明的目的是提供一种高效表达鸡Y干扰素重组载体的构建及活性检测，以求在大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的鸡Y干扰素蛋白。
主要包括设计合成了鸡Y干扰素蛋白的基因，分析了蛋白表达调控元件、启动子的基因结构和相互关系，选择扩增包含T7启动子及相关调控元件、鸡γ干扰素基因及T7 终止子在内的基因片段，作为鸡Y干扰素的表达盒并对其进行了部分基因改造，扩增得到的表达盒命名为T7 CHIF ；选择原核表达载体pET-28a质粒的基因片段作为重组载体质粒的复制元件，包含PBR322 origin、kan抗性基因、fl origin等基因，构建了带有该基因的单拷贝表达载体^a-T7CHIF。
本发明设计合成了能表达鸡Y干扰素蛋白的基因，这种基因含有如下核苷酸序列(序列1)
5 ‘ -ATGCATACTGCAAGTAGTCTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTG ACTTTAACTCAAGTCATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAGAGA AATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAAAACACTGACAAGTCAAAGCC GCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAAAACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATA TCATGGACCTGGCCAAGCTCCCGATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTA CAGAAGCTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGCTAA-3'
为扩增如上所述的基因，本发明设计并合成了如下相应引物(序列2和序列3)
CHIFl 5' -CGGAATTCATGACTTGCCAGACTTAC-3‘ ECORI
CHIF2 5' -GCGTCGACTTAGCAATTGCATCTCCT-3‘ SALI
将含有如上所述核苷酸序列的基因(序列1)克隆入原核表达载体pET_28a多克隆位点中，使其在T7启动子下能够表达，构建的重组质粒命名为^a-CHIF。
本发明在构建好的重组质粒^a-CHIF的基础上，分析了蛋白表达调控元件、启动子的基因结构和相互关系，选择扩增包含T7启动子及相关调控元件、鸡γ干扰素基因及T7 终止子在内的基因片段，作为鸡Y干扰素的表达盒，扩增得到的表达盒命名为T7 CHIF。
为扩增鸡γ干扰素的表达盒(T7 CHIF)设计合成了如下引物(序列4和序列5)
CH 改造 1:5' -TGGAGGCCTATCCGGATATAGTTCCTC-3 ‘，设计 MuI 酶切位点；
CH 改造 3 5 ‘ -ATACTGCAGTGTAGTACTCGATCCCGCGAA-3 ‘，设计 ScaI 和 PstI 酶切位点。
扩增的表达盒(T7CHIF)序列(序列6)如下
5 ‘ -ATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGG TTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGT GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATGCATACTGCAAGTAGTCTA AATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGTCATTCAGATGTAGCTGACGG TGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAGAGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTT CGATGTACTTGGAAATGCTTGAAAACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACT CTGAAAAACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCTCCCGATGAACGACTT GAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAGCTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGA AAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGCTAAGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGCGACCCATTTGCTGTC CACCAGTCATGCTAGCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCC ATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCCCTATAG TGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCG-3‘
本发明为构建高效表达鸡Y干扰素蛋白重组载体，选择原核表达载体pETj8a 质粒的基因片段作为重组载体质粒的复制元件，包含PBR322 origin, kan抗性基因、fl origin等基因。采用PCR扩增的方法取得的重组载体质粒的复制元件命名为^a改。
为扩增重组载体质粒的复制元件改)设计合成了如下引物(序列7和序列 8)
沘改1 :5 ‘ -GCGCTGCAGAGATCTCGATCCTCTACG-3，，设计了 I3StI 和 BglII 酶切位点； 407 开始 28 改 2 :5 ‘ -TATAGGCCTTGGCGAATGGGACGCGCC-3 ‘，设计了 StuI 酶切位点。5369结束
扩增的目的序列⑶a改，序列9)如下
5 ‘ -CGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGC CTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTA TGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTC AACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGATCCCGGACACCA TCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAA CCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAG CCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCAC AACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATT GTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGA AGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACC AGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATC AACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAAT CGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCA ATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTG AATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGA GTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGC CGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGC CAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAAC CGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAG CGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCGGGATCTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCC AGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCG TAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTG TCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGA GAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAG GCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAA ACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGC GCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAA CGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAA CGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTAC CCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCT TTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAA TCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACA CATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAG CGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATG CGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAAT ACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCA GCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCA GCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCC CTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCT TTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCC CCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCA CTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCC TAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTG GTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGA AAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGG GATTTTGGTCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGG GAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAA TGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCA AAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACC ATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGT ATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTC CTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTG GTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTT GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAA TAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGT GAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTT TCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAA CAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGC GTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAAT AGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAA GGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTG CCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGA GAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACC ACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCA-3'
将PCR扩增得到的重组载体质粒的复制元件QSa改，序列9)经限制性内切酶 PstI和MuI酶切后，回收；扩增到的鸡Y干扰素的表达盒(T7 CHIF，序列6)经限制性内切酶MuI和I^stI酶切回收后，与回收的28a改连接后，构建表达鸡、干扰素的单拷贝原核表达质粒，命名为^a-T7CHIF。
本发明为构建高效表达鸡Y干扰素蛋白重组载体即双拷贝鸡Y干扰素基因表达质粒^a-2T7CHIF，将单拷贝表达质粒CHIF经限制性内切酶MuI和I^stI酶切回收含有表达盒的目的片段；经内切酶kal和I3StI酶切回收含表达盒和复制元件的目的片段，将二者连接后，构建表达鸡Y干扰素的双拷贝原核表达质CHIF即高效表达鸡Y干扰素蛋白重组载体。
高效表达鸡Y干扰素蛋白重组载体中含有的双拷贝鸡Y干扰素基因，其序列 (序列10)如下
5 ‘ -AGGCCTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGAT CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCATGCATACTGCAAGT AGTCTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGTCATTCAGATGTAGC TGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAGAGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGA TTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAAAACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTC TATACTCTGAAAAACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCTCCCGATGAA CGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAGCTGGTGGATCCTCCGAGTTTCA AAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGCTAAGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGCGACCCATTT GCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTG CTGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCC CTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGTCCTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCA AGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGG GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGA ATTCATGCATACTGCAAGTAGTCTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACT CAAGTCATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAGAGAAATGAGAAA AGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAAAACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAA ACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAAAACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACC TGGCCAAGCTCCCGATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAGCTG GTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGCTAAGTCGACGGAGCTCGAAT TCGGATCCGCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTG ATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTG TTATCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGTACTACACTGCAG-3'
将上面构建的高效表达鸡Y干扰素蛋白重组载体08a_2T7 CHIF)转化大肠杆菌 BL21，获得可表达鸡γ干扰素蛋白的基因工程大肠杆菌。
将鸡Y干扰素蛋白基因克隆入带有高效表达Τ7启动子，受噬菌体Τ7强转录及翻译信号控制的重组载体08a-2T7 CHIF)，并在乳糖的作用下，鸡、干扰素蛋白获得高效表达。所生产的鸡Y干扰素蛋白在细胞病变抑制试验中，能有效保护CEF细胞抵抗病毒的攻击ο具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明
1.鸡外周血淋巴细胞的分离及诱导培养
两周龄雏鸡翅静脉无菌采血3mL (适量肝素抗凝)。将采得的抗凝血经PBS稀释后在无菌状态下缓慢加入2倍体积的GE淋巴细胞分离液-Ficoll (购于GE公司)上层，室温下2000r/minin离心lOmin，取中间的云雾状淋巴细胞层。用含15%小牛血清的RPIM1640 营养液稀释成0. 5 X IO6个/mL，每孔2mL，然后加入ConA (刀豆蛋白，购于sigma公司)诱导剂使每孔终浓度为151^/1^,371:,51% CO2温箱中诱导培养12h。
2.细胞总RNA的提取
取诱导后的鸡外周血淋巴细胞，PBS洗涤3次后，进行RNA提取。具体步骤如下取500 μ L诱导后的鸡脾细胞悬液加入500 μ L 1Trizol试剂(用于裂解细胞，购于hvitrogen 公司)，颠倒混勻，室温放置lOmin。加入200 μ L氯仿，混勻后放置5min，12000r/min离心 lOmin，吸取上清加入等体积异丙醇，室温放置5min ；离心lOmin，弃去上清，加入75%乙醇洗一遍，自然干燥后，加入适量的DEPC-H2O,可立即使用或-70°C保存。3.鸡Y干扰素基因的扩增及回收以ConA刺激的淋巴细胞总RNA为模板，进行RT-PCR。反应结束后取10 μ L PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。RT-PCR产物经琼脂糖电泳鉴定后，切下约 500bp处目的条带，随后按回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)使用说明进行回收。4.重组质粒^a-CHIF构建将回收的鸡γ干扰素基因EcoRI和^ilI双酶切，与同样酶切的ρΕΤ48ει载体(购自Novagen公司)连接，构建重组质粒^a_CHIF。5.构建表达鸡Y干扰素的单拷贝原核表达质PCR扩增重组载体质粒的复制元件08a改)，经限制性内切酶I3StI和MuI酶切回收；扩增到的鸡Y干扰素的表达盒(T7 CHIF)经内切酶MuI和I^stI酶切回收后，与回收的改连接后，构建表达鸡Y干扰素的单拷贝原核表达质S^a_T7CHIF。6.构建高效表达鸡Y干扰素蛋白重组载体质粒^a_2T7CHIF将单拷贝表达质粒CHIF经限制性内切酶MuI和I^stI酶切回收含有表达盒的目的片段；经内切酶MuI和I^stI酶切回收含表达盒和复制元件的目的片段，将二者连接后，构建表达鸡Y干扰素的双拷贝原核表达质CHIF即高效表达鸡、干扰素蛋白重组载体。7.重组大肠杆菌Q8a-2T7 CHIF/E. coli)的构建、诱导表达按照《分子克隆》(著[美]J.莎姆布鲁克黄培堂译，科学出版社，出版日期 2005-3-1,96页)的方法，将^a-2T7 CHIF质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞(购自北京博迈德科技发展有限公司)，涂布于卡那霉素平板上。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿于37°C温箱中培养1 至出现单菌落，命名为大肠埃希菌(Escherichia coli)28a-2T7 CHIF/E. coli株(该菌株已于2012年1月12日送交北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No. 5730)。挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基，37°C振荡培养过夜。次日接种含卡那霉素的LB培养基，37°C振荡培养至测定A600 = 0. 6 0. 8时， 按终浓度 0. 02mmol/L 加入 0. 2mmol/L 乳糖，25 37°C诱导 6h，4°C，4000r/min 离心 5min。 用PBS重悬浮菌体。8.鸡Y干扰素在大肠杆菌中表达检测及纯化超声波破碎菌体，150hz破碎100次至液体清亮。将破碎后的菌体在4°C条件下，12000r/min离心IOmin后，分离沉淀和上清，分别置于_20°C保存。取少量上清进行 SDS-PAGE电泳检测。9.细胞病变抑制法测定表达的鸡Y干扰素生物活性将提取好的鸡、干扰素以细胞维持液作4倍系列稀释，作10个稀释度，接入长满单层的96孔细胞培养板，每孔加入0. ImL稀释好的样品，每个稀释度加入8孔。置 370C 5% CO2孵箱中培养Mh。倒掉培养板中的上清液。将水泡性口炎病毒稀释成100个TCID50/0. lmL，加入到培养板中，每孔加0. ImL,同时设立阴性对照(只加稀释两倍的干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)，空白对照(不加干扰素，不加病毒)，置于37°C 5% CO2温箱培养，逐日观察病变情况，判定结果并计算鸡γ干扰素效价。结果显示鸡Y干扰素蛋白可以明显抑制病毒的增殖，每0. ImL鸡γ干扰素效价为4_6 5单位。本发明的积极意义本发明涉及一种高效表达鸡Y干扰素重组载体的构建及活性检测。本发明为构建高效表达鸡Y干扰素蛋白重组载体即双拷贝鸡Y干扰素基因表达质粒^a_2T7CHIF， 将单拷贝表达质粒CHIF经限制性内切酶酶切回收含有表达盒的目的片段与含表达盒和复制元件的目的片段连接后，构建表达鸡Y干扰素的双拷贝原核表达质
CHIF即高效表达鸡γ干扰素蛋白重组载体。实现了鸡Y干扰素蛋白在大肠杆菌中的高效表达。这为工业化大量生产鸡Y干扰素蛋白应用于我国养禽业奠定了坚实的基础。本发明涉及的微生物大肠埃希菌(Escherichiacoli)28a-2T7 CHIF/E. coli 株(该菌株已于 2Ol2 年 1 月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号=CGMCC No. 5730
图1鸡γ干扰素基因的扩增结果该图是本发明实施例鸡Y干扰素扩增结果，其结果与预期结果一致，约500bp，表明成功扩增得到目的基因1，2 RT-PCR结果；M DL2000 DNAMarker0图2为鸡γ干扰素的表达盒(T7 CHIF)扩增结果约890bp 1，2PCR结果；M DL15000DNA Marker图3为重组载体质粒的复制元件08a改)扩增结果约4970bp 128a改PCR结果； MDL15000 DNA Marker图4构建表达鸡、干扰素的单拷贝原核表达质粒，命名为^a_T7CHIF酶切结果 IStuI/PstI 酶切鉴定；M DL15000 DNA Marker图5构建表达鸡Y干扰素的双拷贝原核表达质粒^a_2T7 CHIF即高效表达鸡Y 干扰素蛋白重组载体IStuIA3StI酶切鉴定；M DL15000 DNA Marker图6是本发明实施例工程菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图1双拷贝 28a-T7CHIF表达结果；2单拷贝^a_T7CHIF表达结果；M蛋白质标准Marker本发明实验中所用的遗传资源、试剂及生化产品除已表标明来源外，其他均购自国内商业公司。
权利要求
1.一种高效表达鸡Y干扰素重组载体的构建，其特征在于(1)该重组载体为表达鸡Y干扰素的双拷贝原核表达质CHIF，含有序列9 所示氨基酸序列；(2)该重组载体是使用了质粒载体pET48a(+)，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制， 在IPTG的诱导下，高效表达T7启动子下游的外源基因，含有两套表达元件。
2.如权利要求1所述一种高效表达鸡Y干扰素重组载体的构建，其特征在于含有两套表达元件是单拷贝表达质粒CHIF经限制性内切酶MuI和I^stI酶切回收含有表达盒的目的片段；经内切酶^aI和I^stI酶切回收含表达盒和复制元件的目的片段。
3.—种重组大肠埃希氏菌，其特征为该重组菌是由权利要求1所述的重组载体转化而来，被命名为大肠埃希菌(Escherichia coli)28a-2T7 CHIF/E. coli株，该菌株已于2012 年01月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号=CGMCC No. 5730。
4.一种高效表达鸡Y干扰素重组载体表达产物活性的测定，其特征在于是采用细胞病变抑制法测定表达的鸡Y干扰素生物活性。
全文摘要
本发明涉及一种高效表达鸡γ干扰素重组载体的构建及活性检测。本发明为构建高效表达鸡γ干扰素蛋白重组载体即双拷贝鸡γ干扰素基因表达质粒28a-2T7CHIF，将单拷贝表达质粒28a-T7 CHIF经限制性内切酶酶切回收含有表达盒的目的片段与含表达盒和复制元件的目的片段连接后，构建表达鸡γ干扰素的双拷贝原核表达质粒28a-2T7 CHIF即高效表达鸡γ干扰素蛋白重组载体。实现了鸡γ干扰素蛋白在大肠杆菌中的高效表达。这为工业化大量生产鸡γ干扰素蛋白应用于我国养禽业奠定了坚实的基础。
文档编号C12N15/70GK102533837SQ20121004714
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者刘 东, 刘新文, 刘蕾, 李金积, 王龙, 申洪银, 范根成, 邹敏, 郭伟伟, 陶晓珊 申请人:青岛易邦生物工程有限公司