一种能够缓解铅毒性的植物乳杆菌及其用途的制作方法

专利名称：一种能够缓解铅毒性的植物乳杆菌及其用途的制作方法
一种能够缓解铅毒性的植物乳杆菌及其用途
技术领域：
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种能够缓解铅毒性的植物乳杆菌，本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途。
背景技术：
铅是一种对人体健康极其有害的重金属。其具有的独特理化性质使其获得广泛的应用，在工业上是一种重要的化学材料，从而进入了人类生活的方方面面；但是，它又是一种对多个脏器具有毒性的金属元素，在人体内无任何生理作用，理想血铅浓度应为零。随着工业、农业、交通、油漆、印刷及电子产业的迅速发展，空气、土壤、水及食物都不同程度地受到了铅污染。长期铅暴露使人们对铅的接触和吸收在逐渐增加，导致体内铅蓄积。铅能够作用于全身各个系统和器官，它的毒性与其化合物的形态和溶解度有关，但主要涉及造血、 心血管、消化、泌尿、免疫等系统，直接危害人体的健康，其中对神经系统、肾脏、造血系统和血管等的损害最为显著。铅中毒患者会出现腹痛、腹泻、呕吐、头痛、头晕、昏迷等症状，并造成血管痉挛，肝肾损伤等生理病症。对于由铅蓄积和铅中毒引起的各种生理病症，传统的疗法主要采用依地酸二钠钙、二巯基丁二酸钠等螯合剂进行注射治疗，以达到排铅的目的，例如中国药典第二版 (2000年)记载了依地酸二钠钙作为铅和镉等重金属中毒的解毒剂。然而，这些药物都存在着一定的毒副作用。依地酸二钠钙是一种广谱性络合剂，具有较强的肾毒性，且用药时会经尿排出大量人体不可缺少的微量元素，例如锌、铜、锰、铁等，而这些元素与很多酶的活性有关，因此大量使用依地酸二钠钙会危及人的身体健康。二巯基丁二酸钠可能导致消化系统功能紊乱，并造成头痛、恶心、四肢酸痛等症状。鉴于传统治疗方法存在的多种问题，针对铅蓄积和铅中毒寻找一种新的干预或治疗方法显得十分必要。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称， 广泛存在于自然发酵乳制品、发酵植物食品，如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、保护肝脏并增强肝脏的解毒等功能。因此探索乳酸菌在缓解铅毒性效应中的效果就可以进一步地挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的乳酸菌，为利用膳食策略缓解铅中毒效应开辟出新的途径和解决方案。目前，一些专利文献涉及排铅保健食品及其制备方法，例如CN101933937A公开了一种具有自然螯合功能，而可以将动物体内的铅离子排出体外的低分子柑桔果胶； CN101011432涉及蕨菜黄酮提取物在作为排铅和缓解铅中毒药物中的应用；CN1506070提供了一种含水苏糖的排铅保健品。但是，目前涉及具有缓解铅中毒效应的乳酸菌专利申请文件不多，例如CN101134945A公开了一种肺炎克雷伯氏菌Z-KAE15，它对铅具有高耐受性、 高吸附性，它应用于环境工程技术领域中。另外，CN101252943A公开了一些植物乳杆菌，它用于促进哺乳动物吸收铁、锌、钙、镁离子。
因此，筛选出一种具有缓解铅毒性功能的乳酸菌，并且证明它们在动物模型中具有良好的缓解铅中毒作用，同时研制这些乳酸菌实际的用途就显得十分必要。本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验研究，终于完成了本发明。

发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8661。本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌CCFM8661的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种乳酸菌，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对该乳酸菌鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8661,该菌菌株已于 2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5494。所述的植物乳杆菌CCFM8661具有下述性质(I)具有耐酸性，在pH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好；(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力；(3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与缓解铅暴露小鼠铅毒性的作用。本发明还涉及所述的植物乳杆菌CCFM8661在制备缓解铅中毒的药物组合物与发酵食品中的用途。根据本发明的一种优选实施方式，所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM8661 菌剂与在药学上可接受的载体组成的。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌CCFM8661菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM8661的菌液通过常规冷冻干燥工艺或其它工艺制备所得到的粉剂， 它含有106CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM8661。根据本发明的另一种优选实施方式，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、 丸剂或口服液剂型。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌 CCFM8661囷种的发酵剂生广的乳制品、 制品与果蔬制品。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的Α、培养基的制备使用以所述培养基总重量计87. 7%水将10%酶水解脱脂乳、
O.5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨与O. 3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6. 8，这样得到所述的培养基；B、保护剂的制备使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、 30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；C、将植物乳杆菌CCFM8661菌种按照以所述培养基的重量计2_4%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，在温度37°C的条件下培养18h，用 PH7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度101(lCFU/ml ;接着，让该悬浮液在温度37°C的条件下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8661,该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5494。本发明人根据下述筛选标准，通过大量筛选实验与分析验证，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8661具有下述性质(I)具有耐酸性，在pH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好；(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有较好的耐受能力；(3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与缓解铅暴露小鼠铅毒性的作用。下面将详细描述这些实验与分析认证结果。I、具有耐酸性，在pH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM8661接种于MRS培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)中，在温度37°C的条件下培养24h，再经MRS培养液传代培养 2 3次后，取ImL植物乳杆菌CCFM8661培养液，分别接种于19mL不同pH值(3. 0-9. O) 的MRS液体培养基中，在温度37°C的条件下培养24h，测定初始和培养结束后的OD6tltl值，利用这个值测量在细菌培养液中的细胞浓度，从而估计细菌的生长情况。OD6tltl值是采用分光光度法在波长600nm处测定的细菌培养液的吸光值，它通常用于表示在细菌培养液中细胞浓度，以确定液体培养物中细菌的生长情况。这些试验结果证明，植物乳杆菌CCFM8661在 PH3. 0-9. O的环境中生长良好，因此得以进行后续实验。采用与前面所述的同样培养方式培养得到植物乳杆菌CCFM8661培养物。其菌体用I. OmL pH7. 2PBS (磷酸盐缓冲液)清洗两次，再用I. OmL pH7. 2磷酸盐缓冲液重悬，其重悬液与9. OmL pH 2. 5人工胃液混合，然后在温度37°C的条件下进行培养，分别在开始(Oh) 和3h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。 存活率是在该培养液中在第3h时的活菌数对数值与在第Oh时活菌数对数值之比，以％表示。本发明筛选存活率在80%以上的菌株进行后续研究。实验结果表明，植物乳杆菌CCFM8661在pH2. 5的人工胃液环境中的存活率在90% 以上。由此可见，植物乳杆菌CCFM8661具有耐酸性，在pH2. 5的环境下存活良好。2、在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力通过乳杆菌在不同铅含量培养基中的生长曲线可以研究其在体外对铅离子的耐受能力。在无菌条件下，向IL水中加入O. 20g氯化铅，即得到浓度为150mg/L的铅离子水溶液。使用这种铅离子水溶液溶解MRS固体培养基干粉得到含150mg/L铅离子的MRS液体培养基。同样地，分别配制50mg/L、500mg/L铅离子浓度的MRS液体培养基。按照以含铅离
5子的MRS液体培养基重量计2 %接种量将进入稳定期的植物乳杆菌CCFM8661菌液接种于所述含铅离子的MRS液体培养基中。在其培养过程中，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、 24h时进行标准平板计数，从而得到如附图I所示的植物乳杆菌CCFM8661生长曲线。附图I的结果表明，本发明植物乳杆菌CCFM8661对铅离子的具有良好的耐受能力。3、在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力在无菌条件下，按照耐酸性(在pH3. O能够生长)的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出7株乳酸菌。这7株乳酸菌及作为对照菌株的I株大肠杆菌、I株枯草芽孢杆菌进行了纯化和活化培养。将上述菌株转移至150mg/L铅溶液中， 使菌体最终浓度达到lg/L。将含有上述菌株的样品在37°C下培养lh，使用Beckman离心机以6000r/min离心20min,再用无菌水洗漆、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光谱分析仪(Spectr AA 220, Varian, USA),按照 Yeager 等人所述方法(Yeager D. ff. , Cholak J., Henderson E.W.Determination of lead in biological and related materials by atomic absorption spectrometry. Environmental Science and Technology 1971 ；5 1020-1022.)测定铅离子含量，以确定各菌株对铅离子的吸附能力。这些测定结果列于附图 2中。附图2清楚地表明，与其它试验菌株和对照菌株相比，本发明植物乳杆菌 CCFM8661对铅离子的吸附量最大，因此，对铅离子具有良好的吸附能力。4、对铅暴露小鼠具有缓解铅毒性的效应取20_25g健康雄性昆明小鼠40只，随机分为4组阴性对照组，醋酸铅模型对照组，植物乳杆菌CCFM8661治疗组与依地酸二钠钙阳性治疗对照组。阴性对照组进水为普通饮用水；其余3组的进水为lg/L醋酸铅溶液，在造成铅暴露染毒模型后，植物乳杆菌 CCFM8661治疗组每日灌喂本说明书实施例3制备的浓度2. OX 109cfu/mLCCFM8661脱脂乳悬液，阳性对照治疗组每日腹腔注射5g/L依地酸二钠钙药剂。实验结束后取血并处死小鼠，分别取肝、胃、肾，在按照与前面所述的相同消化处理后，采用上述Yeager等人描述的原子吸收分光光度法测定铅含量。这些测定结果列于附图3中。通过对铅暴露染毒模型组及共同喂食铅及植物乳杆菌CCFM8661组小鼠体内血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量，以及机体抗氧化指标(SOD、MDA)的比较，发现本发明植物乳杆菌CCFM8661能够降低小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量，并显著改善小鼠机体的抗氧化指标。环境中的铅通常经食物和呼吸途径进入人体，对消化、神经、呼吸和免疫系统造成急性或慢性毒性影响，往往导致肠绞痛、贫血和肌肉瘫痪等病症，严重时可发生脑病，甚至导致死亡。因此，通常根据职业性慢性铅中毒诊断标准GBZ37-2002确定人体是否铅中毒。在本发明中，术语“缓解铅毒性”应该理解是能够使机体内的铅中毒现象减轻或消失的过程。依据卫生部在2003年颁布的《保健食品检验和评价技术规范》，通过实验研究证明，使用含有本发明植物乳杆菌CCFM8661菌剂的药物组合物能够降低铅中毒小鼠的血、肝脏、肾组织中的铅含量，缓解机体氧化应激减轻铅中毒小鼠的病理症状，提高小鼠体内谷胱甘肽含量，降低丙二醛含量，具有促进排铅的保健功能。
研究结果表明，本发明的植物乳杆菌CCFM8661具有下述性能(I)具有耐酸性，在pH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好；(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力；(3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与缓解铅暴露小鼠铅毒性的作用。本发明的植物乳杆菌CCFM8661具有下述生物学特性菌体特征呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体约O. 5-1. O μ m宽，2-4 μ m长，成单、 成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形。菌落特征在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在O. 3-2. Omm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。生长特性该菌株的最低生长温度为20°C，最高生长温度为40°C，在温度30_37°C 下生长最佳，最高和最低初始生长pH为9. O和2. 5，最适生长初始pH为6. O ;本发明植物乳杆菌CCFM8661菌株的延迟期相对较短，4h左右开始进入对数生长期，12h就达到稳定期。本发明植物乳杆菌保存方法所述植物乳杆菌CCFM8661原始菌种在温度_75°C下以30%重量百分数的甘油悬液形式保存，或者在温度4°C下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。本发明植物乳杆菌CCFM8661培养方法与培养条件在MRS培养基中在兼性厌氧条件与温度37°C的条件下培养18-36h即可使用。本发明还涉及所述的植物乳杆菌CCFM8661在制备缓解铅毒性的药物组合物与发酵食品中的用途。所述的药物组合物是植物乳杆菌CCFM8661菌剂与在药学上可接受的载体组成的。根据本发明，所述的植物乳杆菌CCFM8661菌剂是采用通常的冷冻干燥制备技术将含有所述的植物乳杆菌的菌液制成的冻干粉剂，或是采用其它方法如喷雾干燥法制备得到的粉剂。所述的植物乳杆菌CCFM8661菌剂含有106CFU/mL以上的活性植物乳杆菌 CCFM8661。植物乳杆菌CCFM8661含量测定方法是本技术领域的技术人员熟知的MRS平板菌落计数法。在所述的药物组合物中，所述植物乳杆菌CCFM8661菌剂的量是所述药物组合物重量的15-35%，优选地是18-32%，更优选地是20-30 %。根据本发明，在药学上可接受的载体应该是指在药学领域中的常规药物载体，例如是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。根据本发明，所述的填充剂应该理解是用来增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂；或者应该理解是用以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。所述的填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。优选地，所述的填充剂选自淀粉、蔗糖或微晶纤维素。更优选地，所述的填充剂选自淀粉或微晶纤维素。
根据本发明，所述的润湿剂应该理解是药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。所述的润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。优选地，所述的润湿剂选自水、乙醇或淀粉。本发明使用润湿剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 1-3. 0%。根据本发明，所述的粘合剂应该理解是当原料药物本身无粘性或粘性不足时，需加入粘性物质以便于制粒，这种粘性物质称为粘合剂。所述的粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。优选地，所述的粘合剂选自纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。更优选地，所述的粘合剂选自明胶或聚乙烯吡咯烷酮。本发明使用粘合剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 5-5. 0%。根据本发明，所述的崩解剂应该理解是一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。人们知道，片剂经过压缩后的硬度大，如果其中不含有可以促进崩解作用的辅料，它在胃肠道中崩解很慢，影响疗效。所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂或碳酸氢钠。更优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素或碳酸氢钠。本发明使用崩解剂的量是以所述药物组合物总重量计5. 0-15. 0%。根据本发明，所述的润滑剂应该理解是一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，防止片剂材料粘附在制片机模子上，有利于片剂脱模的化学物质。所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。优选地，所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。更优选地，所述的润滑剂选自滑石粉或硬脂酸钙。本发明使用润滑剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 5-3. 0%。根据本发明，所述的矫味剂应该理解是在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道，使病人难以觉察药物强烈苦味或其它异味，例如辛辣、刺激等的药用辅料。所述的矫味剂例如选自单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。优选地，所述的矫味剂选自单糖浆、蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。更优选地，所述的矫味剂选自蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬油芳香剂；海藻酸钠或阿拉伯胶的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。本发明使用矫味剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 5% -2. 0%。本发明的植物乳杆菌CCFM8661菌剂可以与在药学上可接受的载体或赋形剂组合制成各种剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体或赋形剂可以根据不同剂型进行选择，所使用的这些载体或赋形剂及其用量对于制药技术领域的普通技术人员都是容易确定的，也是显而易见的。在本发明中，采用制药技术领域的普通技术人员熟知的普遍使用的方法和设备制备本发明药物颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。所述的“剂型”一般应该理解是适用于人的单剂量药物形式，单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的植物乳杆菌CCFM8661菌剂。在本发明中，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CCFM8661菌种的发酵剂生广的乳制品、 制品与果蔬制品。。所述发酵剂的制备方法如下Α、培养基的制备使用以所述培养基总重量计87. 7%水将10%酶水解脱脂乳、
O.5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨与O. 3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6. 8，这样得到所述的培养基；B、保护剂的制备使用水与保护剂原料制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；C、将植物乳杆菌CCFM8661按照以所述培养基的重量计2_4%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37°C的条件下培养18h，用 PH7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度101(lCFU/ml ;接着，让该悬浮液在温度37°C的条件下预培养60min，再采用冻干法制成所述的发酵剂。所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪。在本发明中，所述的牛奶应该理解是牛乳、马乳或还原乳。所述的还原乳是用以还原乳总重量计10-15%奶粉与85-90%软化水配制的。所述的奶粉是目前市场上广泛销售的产品。所述的酸奶油是稀奶油经乳酸菌发酵制成的奶油。酸奶油比甜奶油有更多的优越性，香味更浓郁，奶油产量也更高；另外由于乳酸菌抑制了有害微生物，所以消毒杀菌后再次污染微生物的风险也较低。所述的干酪是由牛奶经发酵制成的一种营养价值很高的食品。所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱。它们都是我国的传统食品或调味品。所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。在生产乳制品、豆制品与果蔬制品时，按照下述方法使用本发明的植物乳杆菌 CCFM8661菌剂发酵剂通常，在生产乳制品、豆制品和果蔬制品的常规生产过程中，把本发明的植物乳杆菌CCFM8661菌剂发酵剂按照常规使用量接种到待处理的原料中，在能够使所述植物乳杆菌CCFM8661繁殖的温度、压力下进行发酵或存活，其代谢产物使发酵制品具有一定的酸度、香味等优异特性，同时使产品延长了保藏时间，改善了产品营养价值和消化性。[有益效果]本发明的植物乳杆菌CCFM8661具有耐酸性，在体外对铅离子有良好的耐受能力， 能够耐受起始浓度为150mg/L的铅离子溶液。并且对铅离子有较强的吸附作用，可降低小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量，显著改善小鼠机体的抗氧化指标，缓解铅中毒小鼠的病理症状。所述的植物乳杆菌CCFM8661用于制备缓解铅中毒的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

图I是植物乳杆菌CCFM8661于含起始浓度为50mg/L，150mg/L, 500mg/L的铅离子培养基中的生长曲线；图2是乳酸菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌对铅离子的吸附情况。其中CCFM8661、14、ST_3为植物乳杆菌；2_2为加氏乳杆菌；2_3为鼠李糖乳杆菌 LGG ;22为两歧双歧乳杆菌；2-3为德氏乳杆菌。Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)及 E. coli (大肠杆菌)作为实验对照菌株。图3是植物乳杆菌CCFM8661对铅暴露小鼠血液，肝脏，肾脏，胃中铅水平的降低作用；a, b，c，d表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P < O. 05)。
具体实施方式实施例I :植物乳杆菌CCFM8661对铅离子的耐受能力实验在无菌条件下，向IL水中加入O. 20g氯化铅，得到150mg/L的铅离子水溶液。使用这种铅离子水溶液溶解MRS培养基固体配料，得到含150mg/L铅离子的MRS液体培养基。 MRS培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，它含有胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵、吐温80、硫酸镁、硫酸锰，pH 6. 2 6. 4。以与前面描述的同样方式配制含有50mg/L与500mg/L铅离子浓度的MRS液体培养基。将进入稳定期的植物乳杆菌CCFM8661按照以含铅的MRS液体培养基重量计2%接种量接种于所述的含铅MRS液体培养基中，在温度37°C的条件下进行培养，分别在0h、2h、 4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h时取样，进行标准平板计数，得到如附图I所示的植物乳杆菌 CCFM8661生长曲线。另外，将ImL所述的菌液接入不含铅的MRS液体培养基中，在同样条件下进行培养并计数，其结果作为空白对照结果，这些试验结果也列于附图I中。由附图I可以看出，在150mg/L铅离子浓度下，植物乳杆菌CCFM8661虽然在开始时生长受到抑制，但随后其生长量迅速增加，在24h时生长量甚至超过了空白对照组，因此，其结果表明植物乳杆菌CCFM8661对铅离子具有良好的耐受能力。实施例2 :植物乳杆菌CCFM8661对铅离子的吸附能力实验按照耐酸性(在pH3. O环境中能够生长)的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出7株乳酸菌，将这7株乳酸菌与作为对照菌株的I株大肠杆菌和I 株枯草芽孢杆菌在无菌条件下进行纯化和活化，纯化和活化时乳酸菌使用MRS培养基，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌使用LB培养基。LB培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，它含有胰蛋白胨、酵母浸膏、NaCl、琼脂，pH7.0。另外，所述的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌还需置于摇床中在温度37°C的条件下分别进行好氧培养12h和16h。将这些活化菌液振荡均勻，以转速6000r/min进行离心15min。得到的菌体转移到装有150mg/L铅离子浓度溶液的容器中，而空白组则转移到去离子水中。根据菌体质量确定蓝盖瓶中液体的体积，使菌体的最终浓度达到lg/L。将以上样品于温度37°C下培养lh。使用Beckman离心机以转速6000r/min离心20min,再用无菌水洗漆、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光谱分析仪(Spectr AA 220, Varian, USA)按照 Yeager 等人所述方法(Yeager D. ff. , Cholak J., Henderson E. ff. Determination of lead in biological and related materials by atomic absorption spectrometry. Environmental Science and Technology 1971 ；5 1020-1022.)测定铅离子含量，以确定不同菌株吸附铅离子的能力。其试验结果如附图2所示。由附图2可以看出，不同的菌种对铅离子的吸附能力差异较大。其中植物乳杆菌CCFM8661的吸附能力最强，可吸附4955. I μ g/g铅离子，而大肠杆菌对铅离子的吸附能力较差，只能吸附398 μ g/g的铅离子，其吸附能力远低于本发明的植物乳杆菌CCFM8661。实施例3 :植物乳杆菌CCFM8661灌喂小鼠的耐受剂量实验将植物乳杆菌CCFM8661冻干菌粉重悬于脱脂乳粉中，制成浓度为2. O X 109cfu/mL 的悬液。取约20g健康雄性昆明小鼠10只，每日给予该浓度悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。这些试验结果列于表I中。表I :喂食浓度2. OX 109cfu/mL的植物乳杆菌CCFM8661对小鼠体重的变化情况
时间(天)I234567体重(g) 死亡情况21.2±1.521.9±2.122.5±2.223.5±2.124.2±1.924.9±1.925.7±1.8注_:小鼠无死亡表I中的这些结果表明，喂食浓度2. OX 109cfu/mL的植物乳杆菌CCFM8661未对小鼠造成明显影响，体重明显上升，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。实施例4 :植物乳杆菌CCFM8661对铅暴露小鼠体内铅水平的降低作用取20_25g健康雄性昆明小鼠40只，随机分为4组阴性对照组，醋酸铅模型对照组，植物乳杆菌CCFM8661治疗组与依地酸二钠钙阳性治疗对照组。阴性对照组进水为普通饮用水；其余3组的进水为lg/L醋酸铅溶液。在造成铅暴露染毒模型后，植物乳杆菌 CCFM8661治疗组小鼠每日灌喂实施例3制备的浓度2. O X 109cfu/mLCCFM8661脱脂乳悬液， 阳性对照治疗组小鼠每日腹腔注射5g/L依地酸二钠钙药剂。实验结束后取血并处死小鼠， 分别取肝、胃、肾，采用实施例I描述的消化方法进行消化后，按照实施例2采用的原子吸收分光光度法测定其铅含量。这些试验结果如附图3所示。由附图3可以看出，本发明的植物乳杆菌CCFM8661 治疗组和依地酸二钠钙阳性治疗对照组中小鼠血液、肝脏、胃、肾脏中的铅含量均比阴性对照组高，但均低于铅模型对照组。本发明植物乳杆菌CCFM8661治疗组相对于铅模型对照组，其血液及各器官中的铅含量明显低，均具有显著性(P <0.05)，这也说明植物乳杆菌 CCFM8661干预确实具有降低铅暴露小鼠体内铅含量的作用。实施例5 :植物乳杆菌CCFM8661对铅暴露导致氧化损伤的恢复作用
取20_25g的健康雄性昆明小鼠40只，随机分为4组阴性对照组，醋酸铅模型对照组，本发明植物乳杆菌CCFM8661治疗组与依地酸二钠钙盐(EDTANa2Ca)阳性治疗对照组。阴性对照组进水为普通饮用水；其余3组的进水为lg/L醋酸铅溶液，在造成铅染毒模型后，本发明植物乳杆菌CCFM8661治疗组每日灌喂实施例3制备的浓度2. O X 109cfu/mL的 CCFM8661脱脂乳悬液，阳性对照治疗组每日腹腔注射5g/L依地酸二钠钙盐药剂。实验结束后取血并处死小鼠，取肝，采用Ellmam的方法(ElImam, G. C. Tissue sulfhydryl groups. Archives of biochemistry and biophysics 82(1) :70-77.)及南京建成生物工程研究所生产的丙二醛试剂盒测定谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平。这些试验结果列于下表2中。表2 :本发明植物乳杆菌CCFM8661对铅中毒导致氧化损伤的恢复作用
权利要求
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8661,该菌株已于 2011 年 11 月 29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其保藏号为CGMCC 5494。
2.根据权利要求I所述的植物乳杆菌CCFM8661，其特征在于它具有下述性质(1)具有耐酸性，在PH3.0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好；(2)在体外含铅培养基中培养，对铅离子有良好的耐受能力；(3)在体外含铅水溶液中孵育，对铅离子有良好的吸附能力；(4)具有降低铅暴露小鼠体内铅含量与缓解铅暴露小鼠铅毒性的作用。
3.根据权利要求I所述的植物乳杆菌CCFM8661在制备缓解铅毒性的药物组合物与发酵食品中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是由植物乳杆菌 CCFM8661菌剂与在药学上可接受的载体组成的。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的植物乳杆菌CCFM8661菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM8661的菌液通过常规冷冻干燥工艺或其它工艺制备所得到的粉剂， 它含有106CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM8661。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。
7.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、 片剂、丸剂或口服液剂型。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌 CCFM8661囷种的发酵剂生广的乳制品、 制品与果蔬制品。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的Α、培养基的制备使用以所述培养基总重量计87. 7%的水将10%酶水解脱脂乳、 O. 5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨与O. 3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6. 8，这样得到所述的培养基；B、保护剂的制备使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；C、将植物乳杆菌CCFM8661菌种按照以所述培养基的重量计2_4%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37°C的条件下培养18h，用 PH7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬达到浓度101(lCFU/ml ;接着，让该悬浮液在温度37°C的条件下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品O
全文摘要
本发明涉及一种能够缓解铅毒性的植物乳杆菌及其用途。本发明的植物乳杆菌CCFM8661具有耐酸性，在体外对铅离子有良好的耐受能力，能够耐受起始浓度为150mg/L的铅离子溶液，并且对铅离子有较强的吸附作用，能降低铅暴露小鼠血液、肝脏、肾脏、胃中的铅含量，显著改善铅暴露小鼠机体的抗氧化指标，缓解铅暴露小鼠的病理症状。所述的植物乳杆菌CCFM8661用于制备缓解铅毒性的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。
文档编号A23C13/16GK102586148SQ20121004632
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者刘小鸣, 宋元达, 张灏, 张秋香, 王刚, 田丰伟, 翟齐啸, 范大明, 赵建新, 郭敏, 陈卫 申请人:江南大学