专利名称：同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重pcr检测方法
技术领域：
本发明属于农业分子生物领域，具体的说，涉及一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法。
背景技术：
我国目前已确定有5种嫁接传播病害，包括黄龙病，衰退病，碎叶病，裂皮病和温州蜜柑萎缩病。由于应用无病毒苗木，温州蜜柑萎缩病在田间发生分布很少。柑桔衰退病是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的一种重要病害,广泛分布于世界各柑桔产区，严重威胁着世界上以酸橙为砧木的柑桔产区和对CTV茎陷点株系敏感的葡萄柚、甜橙等品种的安全。柑桔裂皮病是由柑桔裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd)引起的一种世界范围的重要柑桔病害，是限制我国柑桔产量的一种重要的嫁接传播性类病毒，主要为害以积、积橙和菜檬作站木的柑桔品种，弓I起站木部树皮开裂、植株矮化等症状，并导致病树落花落果严重，枯枝多，严重时全株死亡。柑桔碎叶病是由柑桔碎叶病毒(Citrus tatter-leaf virus, CTLV)引起的一种柑桔病害,主要危害以积及其杂种作砧木的柑桔，我国浙江、广东、四川和重庆等省市均有此病的发生。柑桔黄龙病(HLB) 是一种在柑桔生产上危害极其严重的类细菌病害，该病的亚洲种病原物为Candidatus liberobacter asiaticus,是我国南部柑桔产区的毁灭性病害,是国内植物检疫对象。柑桔这4种重要嫁接传播病原物在果园中经常以两种或两种以上病原混合侵染为害，危害轻者可引起树势衰退，产量下降，品质变劣；重者可引起成片柑桔树的死亡，对柑桔高产优质生产构成严重障碍。传统的柑桔病毒病和类病毒病检测方法主要以指示植物鉴定，一般采用Etrog香橼作为指示植物鉴定CEVd，目前鉴定CTV采用墨西哥来檬和酸橙等5种指示植物，CTLV通常采用腊斯克枳橙作为指示植物进行鉴定，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。黄龙病病原物上世纪70年代电镜观察为诊断黄龙病的重要手段，但电镜的检出率较低。目前也有检测CTV和CTLV溃疡病病菌的ELISA检测方法，虽然应用免疫学方法检出速度快，但特异性和灵敏度相对比较差。而PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种病害的检验与诊断。但常规PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需进行多次进行PCR，不但操作复杂，而且费用较高。多重PCR(Multiplex PCR)是近几年兴起的一项新技术，该技术在同一反应管内同时加入多对引物，扩增完成后可同时检测出多种目的核酸片段，满足同时分析不同DNA序列的需要，它具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点。目前已建立了 CTV、CEVd、CTLV的单一 RT-PCR分子检测技术，建立了黄龙病的PCR 技术，但尚未见4种重要嫁接传播病害的一步法多重PCR体系的报道。建立稳定灵敏的同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原一步法多重PCR检测技术体系，有利于摸清田间4种病害发生状况，实施柑桔多种病毒病和类病毒病的高效快速检测，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，推进引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确能同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。本发明的目的是这样实现的本发明选用已经报道柑桔嫁接传播病原的引物对，如下柑桔衰退病毒引物为上游引物5’ -ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3 ’下游引物5’ -TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3 ’柑桔裂皮病类病毒引物为上游引物5’ -GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3，下游引物5’ -CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3 ’柑桔碎叶病毒引物为上游引物5’-TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3’下游引物5’-TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’黄龙病病菌引物上游引物5’ -GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3，下游引物5，-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’(RT)-PCR扩增所需试剂如下柑桔衰退病毒引物0. 13ym0l/L，柑桔裂皮病类病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎叶病毒引物0· 16 μ mol/L，黄龙病病菌引物0.4ymol/L，Mg2+ 为 2. 7mmol/L, dNTP 为 O. 5mmol/L,6mM DTT，RT/Taq 酶，2 X RT-PCR Buffer，灭菌去离子水。(RT)-PCR 扩增条件为55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 个循环； 68°C,7min0本发明具体按如下步骤进行I、总核酸提取(I)取样、研磨由于CTV、CTLV, CEVd和韧皮部杆菌Ca. L. asiaticus在柑桔植株内有各自的分布特点，在进行多重PCR检测时确定在柑桔植株上的取样部位对检测出4种病原至关重要。在柑桔植株内韧皮部杆菌Ca. L. asiaticus在老叶中脉的全年检出率最高； 在通过蚜虫以半持久性方式传播的初侵染柑桔植株内CTV由叶片通过维管系统的韧皮部筛管作长距离转运，因而在感病植株内病毒的分布是从从茎顶部到茎基部逐步递减的，特别是在柚类中CTV分布不均匀，应用DTBIA方法检测，在嫩皮和嫩叶检测率相对较高；CTLV 和CEVd在皮和叶均可作为取样部位。因此检测时应取柑桔植株近基部老叶中脉，同时要取嫩叶的中脉或嫩皮，从同一植株的不同方位取样，每个样品重复抽提3次，这样可以降低这 4种病原的漏检率，提高检测的可靠性。取10-15mg皮或叶脉于无菌eppendorf管,液氮研磨；(2)依次加入60 μ L TES缓冲液和60 μ L饱和酚氯仿异戊醇(25 : 24 : I)， 混匀，
(3) 7CTC水浴 5-10min, 12000rpm 离心 5min，(4)吸取40 μ L上清液由Sephadex G-50-80层析柱中，5000rpm离心4min,收集洗脱液，_20°C保存。上述层析柱制备为加少量TNE平衡的玻璃珠到O. 5mL的Eppendorf管底(先用烧红的细针头在最底部打孔)再将此管放入2mL离心管中，并向O. 5mL的Eppendorf管内加满用 TNE 饱和的 Sephdex G-50, 5000rpm,离心 3min,取出 O. 5mL 的 Eppendorf 管置入 I. 5mL 的Eppendorf管中即可制成。2、(RT)-PCR 扩增将I μ L总核酸提取液在94°C变性，冰水浴2min后，加入RT-PCR扩增所需试剂，利用PCR仪进行扩增。(RT) -PCR 扩增所需体系如下2 X RT-PCR Buffer 液 5 μ L，dNTP O. 3 μ L, DTT O. 6yL, MgSO4O. 3 μ L, RT/Taq酶O. 4 μ L，正向引物混合液0. 715 μ L，反向引物混合液 O. 715 μ L,用灭菌去离子水补足体积至10 μ L。体系中含各病原引物终浓度如下柑桔衰退病毒引物0. 13ymol/L，柑桔裂皮病类病毒引物0. 5μπι01/1，柑桔碎叶病毒引物0. 16μπι01/1，黄龙病病菌引物0.4μπιΟ1/ L,内参泛素基因引物0. 24 μ mol/L。(RT)-PCR 扩增条件为55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 个循环； 68°C,7min ；3、PCR产物电泳检测取5 μ LPCR产物与3 μ L染料相混合，在室温下进行I. 5%水平琼脂糖恒压凝胶电泳。电泳条件为初始电压150V，5min ;后续电压100V，30min。电泳完毕后EB染色，凝胶成像系统观测电泳结果。4、电泳结果分析柑桔裳退病毒引物、柑桔裂皮病类病毒、柑桔碎叶病毒和黄龙病病菌分别扩增出 511bp、371bp、309bp和1160bp的片段，及内参基因194bp，与分别用单一的引物扩增的序列大小相符合，见附图I。对PCR产物用PCR产物纯化试剂盒分别切胶回收，纯化产物经过测序预处理后,送基因公司测序，使用NCBI的BLAST登录序列进行同源性比对分析，均为特异基因片段。5、多重(RT)-PCR灵敏度的测试分别用超纯水10倍梯度稀释总核酸模板，各取I μ L作模板检测(RT)-PCR的灵敏度，结果显示可以从稀释10倍的总核酸中扩增出CEV，可以从稀释IO2倍的总核酸中扩增出CTV，多重PCR与单一 PCR具有相同的检测灵敏度。测试模板为柑桔衰退病毒和柑桔裂皮病毒结果显示模板稀释10倍均可扩增出特异性片段，见附图2。有益效果本发明能同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原，快速准确，避免了常规 PCR的重复检测。检测的稳定性好，特异性强，一致性高，适用于大规模推广，实现了柑桔多种病毒病和类病毒病的高效快速检测，有利于摸清田间4种病害发生状况，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，推进引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。
图I为一步法多重PCR电泳图谱。M100bp DNA分子量标准；1 :4种病原核酸抽提混合液；2 :黄龙病病菌；3 :柑桔裳退病毒；4 :柑桔裂皮病类病毒；5 :柑桔碎叶病毒；6 :阴性对照。图2为多重PCR灵敏度测试分析的电泳图谱。M IOObp DNA分子量标准；1_4 10
倍梯度稀释。图3为随机采取的田间样品进行多重PCR电泳图谱。M :IOObp DNA分子量标准； I :4种病原核酸抽提混合液；15 :阴性对照；16 :水对照，其余为随机采取的田间样品。
具体实施例方式本发明同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法如下I、核酸提取(I)从江西、云南、湖南、浙江、重庆、广东、广西等地方采摘的柑桔样品，随机选取了 13种样品，每样取10-15mg皮和叶脉于无菌eppendorf管,液氮研磨；(2)依次加入60 μ L TES缓冲液和60 μ L饱和酚氯仿异戊醇(25 : 24 : I)， 混匀，(3) 7CTC 水浴 8min, 12000rpm 离心 5min，(4)吸取40 μ L上清液由Sephadex G-50-80层析柱中，5000rpm离心4min,收集洗脱液，_20°C保存。上述层析柱制备为加少量TNE平衡的玻璃珠到O. 5mL的Eppendorf管底(先用烧红的细针头在最底部打孔)再将此管放入2mL离心管中，并向O. 5mL的Eppendorf管内加满用 TNE 饱和的 Sephdex G-50, 5000rpm,离心 3min,取出 O. 5mL 的 Eppendorf 管置入 I. 5mL 的Eppendorf管中即可制成。2、(RT)-PCR 扩增将I μ L总核酸提取液在94°C变性，冰水浴2min后，加入RT-PCR扩增所需试剂，利用PCR仪进行扩增。(RT)-PCR扩增所需体系如下柑桔衰退病毒引物0. 13ymol/L，柑桔裂皮病类病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎叶病毒引物0. 16 μ mol/L，黄龙病病菌引物0. 4ymol/L，内参基因引物0. 24 μ mol/L, Mg2+ 为 2. 7mmol/L,dNTP 为 0. 5mmol/L,DTT 6mM,2XPCR buffer 5. 0 μ L, RT/Taq为0. 4 μ L,用灭菌去离子水补足体积至10 μ L。(RT)-PCR 扩增条件为55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 个循环； 68°C,7min ；3、PCR产物电泳检测取5μ L PCR产物与3 μ L染料相混合，在室温下进行I. 5%水平琼脂糖恒压凝胶电泳。电泳条件为初始电压150V，5min ;后续电压100V，30min。电泳完毕后EB染色，凝胶成像系统观测电泳结果，见附图3。
权利要求
1.一种同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法，4种重要嫁接传播病原包括柑桔裳退病毒，柑桔裂皮病类病毒，柑桔碎叶病毒，柑桔黄龙病菌，其特征在于提取柑桔样品总核酸，选用4种病原的特异引物，对待测样品进行(RT)-PCR扩增，同时设计了泛素基因引物序列，体系中设置了泛素基因作为内参基因，最后电泳鉴定1)根据泛素基因保守序列区域设计特异引物UBQ-F: GATCTTCGCCTTAACGTTGTCAAT， UBQ-R GTTGATTTTTGCTGGGAAGCA,作为内参基因，2)所述(RT)-PCR扩增所需试剂如下柑桔衰退病毒引物0.13μπι01/1，柑桔裂皮病类病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎叶病毒引物0. 16 μ mol/L，黄龙病病菌引物0. 4ymol/L， 内参泛素基因引物0. 24 μ mol/L, Mg2+为 2. 7mmol/L, dNTP 为 O. 5mmol/L,6mM DTT，RT/Taq 酶，2 X RT-PCR Buffer，灭菌去离子水。(RT) -PCR 扩增条件为55 °C，30min ；94 °C，5min ；94 °C，30s ；68 °C，80s ;35 个循环； 68°C,7min0
2.根据权利要求I所述的一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR 检测方法，其特征在与所述提取样品总核酸，样品不仅取柑桔植株近基部老叶中脉，同时还应取嫩叶的中脉或嫩皮，并且同一植株的不同方位取样。
3.根据权利要求I所述的一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR 检测方法，其特征在于所述柑桔衰退病毒引物为上游引物5’ -ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3’下游引物5’ -TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3’所述柑桔裂皮病类病毒引物为上游引物5’ -GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3，下游引物5’ -CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’所述柑桔碎叶病毒引物为上游引物5 ’ -TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3，下游引物5’ -TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’所述黄龙病病菌引物上游引物5 ’ -GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3，下游引物5’ -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’
4.根据权利要求I或3所述的一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法，其特征在于电泳得到的特异性片段大小为柑桔衰退病毒为511bp，柑桔裂皮病类病毒为371bp，柑桔碎叶病毒为309bp，柑桔黄龙病菌为1160bp，内参泛素基因为 194bp0
全文摘要
本发明公开了一种同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法，通过对4种重要嫁接传播病原柑桔衰退病毒，柑桔裂皮病类病毒，柑桔碎叶病毒，柑桔黄龙病菌的引物优选，以及对引物浓度，PCR扩增条件等的优化，实现了同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原。本发明检测方法快速准确，避免了常规PCR的重复检测，检测的稳定性好，特异性强，一致性高，适用于大规模推广，可以用于指导引进品种和推广苗木的无毒化，确保柑桔安全生产。
文档编号C12Q1/70GK102586481SQ20121004601
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者刘金香, 周常勇, 唐科志, 李中安, 王雪峰 申请人:中国农业科学院柑桔研究所