一种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法

一种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法
【专利摘要】本发明属于农业领域中化学防治药剂的筛选技术，具体公开了一种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法。所述柑桔黄龙病防控药剂快速筛选方法的初步评价材料为带菌柑桔木虱，并采用RT-qPCR实时动态监测所述黄龙病病菌在带菌柑桔木虱体内的消长程度来评价药效。本发明创造性地利用带菌柑桔木虱作为抗黄龙病病菌化学药剂的筛选材料，可以在短时间内对大量潜在的柑桔黄龙病防控药剂进行快速筛选与评价，解决了目前抗黄龙病病菌化学药剂筛选周期过长，缺乏一套准确、有效的评价体系等不足。
【专利说明】一种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及农业领域中化学防治药剂的筛选技术，更具体的，涉及一种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法。

【背景技术】
[0002]柑桔黄龙病在我国发生历史悠久，危害日益严重。有资料记载的是Reinking于1919年在我国广东潮汕地区首次发现柑桔黄龙病。到20世纪80年代中期，柑桔黄龙病已在我国广东、广西、福建、海南和台湾的柑桔产区广泛蔓延，并在浙江、贵州、湖南等地部分柑桔产区相继发生。我国有柑桔栽培的19个省、区已有11个遭受危害，受害面积占柑桔总栽培面积的80%以上，总产量的85%左右(范国成等，2009)。然而，鉴于黄龙病病菌((CandidatusLiberibacter asiaticus’ ,简称Las)难培养的特性,与其相关的化学药剂筛选工作至今依然进展缓慢。
[0003]针对柑桔黄龙病化学防治而开展的抗黄龙病病菌化学药剂筛选实验。目前,在国内外也均有所进展。但是，早期的筛选方法一般以针对发病植物本身的症状变化为主，往往缺乏一套准确、有效的评价体系，且还存在筛选周期较长(一般需要1-3年甚至更长时间的连续监测)，易受外界环境影响等不足。如:树干注射法、韧皮部敷药法、叶面喷雾法和土壤浇灌法等。直到近年来，鉴于柑桔黄龙病的危害形势日愈严峻，而现阶段黄龙病病菌一直未能成功进行分离培养，才使得更多的学者致力于使用柑桔黄龙病的其他病害源作为其防治药剂的筛选评价体系。如Muqing Zhang( 2010，2011)等利用已感染黄龙病的长春花枝条在药剂处理后的成活率来评价药效，构建了基于长春花的黄龙病化学防治药剂初筛体系。该初筛体系虽已大大缩短了筛选时间，但仍需至少60-90 d才能获得初步的筛选结果。总而言之，目前抗黄龙病病菌化学药剂筛选周期过长，并且缺乏一套准确、有效的评价体系。


【发明内容】

[0004]本发明针对现有技术的不足，提供了一种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法。本发明创造性地利用带菌柑桔木虱作为抗黄龙病病菌化学药剂的筛选材料，可以在短时间内对柑桔黄龙病防控药剂进行快速筛选与评价，解决了目前抗黄龙病病菌化学药剂筛选周期过长，缺乏一套准确、有效的评价体系等不足。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
[0006]—种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法，所述柑桔黄龙病防控药剂的初步评价材料为带菌柑桔木虱，并采用RT-qPCR实时动态监测所述黄龙病病菌在带菌柑桔木虱体内的消长程度来评价药效。
[0007]现有技术中构建了基于长春花的黄龙病化学防治药剂初筛体系，利用PCR检测技术，以化学药剂处理后2飞个月长春花的成活再生生物量及新生长枝条的韧皮部杆菌的含量为指标，筛选出抗韧皮部杆菌的药物，筛选时间长，可能存在筛选不准确的情况。而本发明创造性地利用带菌柑桔木虱作为抗黄龙病病菌化学药剂的筛选材料，并采用RT-qPCR实时动态监测所述黄龙病病菌在带菌柑桔木虱体内的消长程度，仅需5天即可筛选出有效抗柑桔黄龙病病菌的化学药剂，筛选时间短、准确性高，提供了一种更为快速、有效的抗黄龙病病菌化学药剂筛选方法，解决了目前抗黄龙病病菌化学药剂筛选周期过长，缺乏一套准确、有效的评价体系等不足。
[0008]优选的，所述方法包括如下步骤:
51.饲喂处理:带菌柑桔木虱成虫取食适量化学药剂溶液后，再用健康的柑桔叶片饲养;
52.药效评价:提取饲喂处理后的带菌柑桔木虱总DNA，再通过RT-qPCR技术实时动态监测黄龙病病菌在木虱体内的消长程度来初步评价药效。
[0009]优选的，所述化学药剂溶液的浓度为1000 mg/L。
[0010]优选的，所述化学药剂的处理时间为24h。
[0011]优选的，所述木虱成虫经过饥饿处理12h后再用于SI步骤。
[0012]优选的，所述所述S2步骤中RT-qPCR实时动态监测的检测引物为HLBasf/HLBasr，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1?2所示；探针为HLBp，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；
所述检测反应体系为2XTaqMan PCR Master Mix 10 μ L, 10 μπιοΙ/L的上下游引物和探针各0.4 μ L，DNA模板I μ L，再加灭菌ddH20至总体积20 μ L，反应条件为95°C预变性30 s后；95°C退火5 s，60°C延伸30 s，共40个循环；在每个循环的退火和延伸阶段同步实时采集荧光，根据标准曲线，换算出待测样品中黄龙病病原的含量。
[0013]本发明通过实验发现，经过5d处理后，筛选出四环素类抗生素中的盐酸四环素和盐酸土霉素，氨基糖苷类抗生素中的硫酸庆大霉素和硫酸阿米卡星为有效抗柑桔黄龙病病菌的化学药剂。
[0014]本发明还提供一种抗病菌化学药剂的快速筛选方法的应用，所述方法的评价材料为其病菌的病害源昆虫，并采用RT-qPCR实时动态监测所述病菌在带菌昆虫体内的消长程度来评价药效，将所述方法应用于刺吸式口器害虫传播的难培养病菌化学防治药剂的筛选。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
(I)本发明创造性地利用带菌柑桔木虱作为抗黄龙病病菌化学药剂的筛选材料，可以在短时间内对柑桔黄龙病防控药剂进行快速筛选与评价，解决了目前抗黄龙病病菌化学药剂筛选周期过长，缺乏一套准确、有效的评价体系等不足。
[0016](2)本发明采用带菌柑桔木虱作为抗黄龙病病菌化学药剂的初步评价材料，通过实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)实时动态监测黄龙病病菌在其体内的消长程度来评价药效，仅需5天即可筛选出有效抗柑桔黄龙病病菌的化学药剂，提供了一种更为快速、有效的抗黄龙病病菌化学药剂筛选方法，筛选得到的高效柑桔黄龙病防控药剂，既可作为生产上的柑桔黄龙病化学防治药剂加以直接利用，还可为防治柑桔黄龙病新型药剂的研究与开发，及柑桔黄龙病病菌与寄主互作机理等研究工作提供理论参考。
[0017]

【专利附图】

【附图说明】
图1为不同时间处理对柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的影响。
[0018]图2为四环素类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性测定结果。
[0019]图3为氨基糖苷类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性测定结果。
[0020]图4为β -内酰胺类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性测定结果。
[0021]图5为喹诺酮类抗菌药及其他抗菌药对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性测定结果。
[0022]图6为盐酸四环素和盐酸土霉素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的脱除效果。
[0023]图注(图1-3):CK表示空白对照组；*表示经t检验存在显著差异Gd < 0.05) ;**表示经t检验存在极其显著差异Gd < 0.01)o
[0024]

【具体实施方式】
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试齐U、方法和设备。
[0025]本发明【具体实施方式】主要应用于抗黄龙病病菌化学药剂的快速筛选，并且适当的改变供试昆虫、化学药剂种类以及饲喂装置，本发明所述方法还可以应用于其他刺吸式口器害虫传播的难培养病菌化学防治药剂的筛选。
[0026]实施例1抗黄龙病病菌化学药剂的快速筛选过程
取15头饥饿12 h后的带菌柑桔木虱，用3 mL 1000 mg/L的供试化学药剂溶液饲喂24h，再用健康柑桔叶片饲养。饲养条件:温度为26-28°C，相对湿度为60%-75%，光周期L:D=14: 10 h。实验过程中，每隔24 h检查一次健康柑桔叶片的保湿情况，并同时加入适量的相应化学药剂溶液进行保湿处理，以防止健康柑桔叶片过度脱水而导致带菌柑桔木虱无法正常取食。以不添加任何化学药剂的双蒸水为空白对照，每次处理均设置3个重复。化学药剂饲喂处理完成后，采用OMEGA?公司购买的E.Z.N.A.? Insect DNA Kit试剂盒(D0926-01)提取带菌柑桔木虱总DNA，再利用RT-qPCR技术实时动态监测黄龙病病菌在其体内的消长程度来初步评价药效。
[0027]Las 的 RT-qPCR 检测参照 Li 等(2006)报道的引物 HLBasf/HLBasr (5 ^-TCG AGCGCGTATGCAATACG-3’/5 ‘-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’)，其核苷酸序列分别如 SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2 所示；探针 HLBp (5 ‘-FAM-AGACGGGTGAGTAACGCG-BHQ-3’)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示探针及引物均由大连宝生物工程有限公司合成。RT-qPCR反应体系%:2 X TaqMan PCR Master Mix 10 μ L, 10 μ mol/L 的上下游引物和探针各 0.4 μ L，DNA模板I μ L，再加灭菌ddH20至总体积20 μ L。每轮反应均设置7个梯度的标准品(Α4质粒)作为外参绘制标准曲线，ddH20为空白对照，健康柑桔DNA样品为阴性对照，且实验重复3次以上。反应在CFX96 Touch ?荧光定量PCR检测系统上进行，反应条件为:95°C预变性30 s后，40个循环(95°C退火5 s;60°C，延伸30 S)，在每个循环的退火和延伸阶段同步实时采集荧光。程序设置及结果读取均使用B1-Rad CFX Manger 2.1软件。根据A4质粒外参的标准曲线，换算出待测样品中黄龙病病原的含量。
[0028]实施例2不同时间处理对柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的影响
研究盐酸四环素的不同处理时间对带菌柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌效果的影响。当带菌柑桔木虱取食含有盐酸四环素的化学药剂溶液24 h后，再用健康柑桔叶片分别饲养
1、3、5、7和9 d，实验结果见图1，柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的抑制率分别为:14.19%、25.54%,59.17%、68.88%和89.10% ;而空白对照组柑桔木虱体内黄龙病病菌的浓度则分别上升了 -1.55%,25.51%,29.21%,39.89%和37.86%。且经3 d处理后，处理组柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的抑制率与空白对照组之间存在显著性差异(P〈0.05);经5、7和9 d处理后，处理组柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的抑制率与空白对照组之间存在极显著性差异(P〈0.01)。同时，发现柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的变化在3 d和5 d处理处最为明显。因此，初步选定5 d为其最佳处理天数。其后，其他所有化学药剂溶液均按5 d处理。
[0029]实施例3四环素类抗生素对带菌柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响研究四环素类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响，实验结果见图2。
当带菌柑桔木虱取食含有盐酸米诺霉素的化学药剂溶液24 h后，再用健康柑桔叶片饲养5 d，其体内黄龙病病菌浓度的抑制率为5.58%，与处理前无显著性差异；当带菌柑桔木虱取食分别含有盐酸四环素或盐酸土霉素的化学药剂溶液后，其体内黄龙病病菌浓度的抑制率分别为59.17%和49.70%，且与处理前存在极显著性差异(P〈0.01)。但是，当带菌柑桔木虱取食含有盐酸多西环素的化学药剂溶液后，其体内黄龙病病菌浓度却上升了 34.90%。这表明，四环素类抗生素中的盐酸四环素和盐酸土霉素均能有效抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内增殖，且能极显著降低带菌柑桔木虱体内的黄龙病病菌浓度；盐酸米诺霉素虽也能在一定程度上抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内增殖，但其对带菌柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的降低作用并不明显；而盐酸多西环素不能有效抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内的增殖。结果表明，盐酸四环素和盐酸土霉素为从本次筛选所用四环素类抗生素中筛选出的有效抗柑桔黄龙病病菌化学药剂。
[0030]实施例4氨基糖苷类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响研究氨基糖苷类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响，实验结果见图
3。当带菌柑桔木虱取食含有硫酸链霉素的化学药剂溶液24 h后，再用健康柑桔叶片饲养5 d，其体内黄龙病病菌浓度的抑制率为6.97% ;而取食含有硫酸卡那霉素的化学药剂溶液后，其体内黄龙病病菌的浓度则上升了 6.22%，但均与处理前无显著性差异。当带菌柑桔木虱取食分别含有硫酸庆大霉素或硫酸阿米卡星的化学药剂溶液后，其体内黄龙病病菌浓度的抑制率分别为41.21%和42.69%，且与处理前存在极显著性差异(P〈0.01)。这表明，氨基糖苷类抗生素中的硫酸庆大霉素和硫酸阿米卡星均能有效抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内增殖，且能极显著降低带菌柑桔木虱体内的黄龙病病菌浓度；而硫酸链霉素虽也能在一定程度上抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内增殖，但其对带菌柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的降低作用并不明显；而硫酸卡那霉素不能有效抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内的增殖。结果表明，硫酸庆大霉素和硫酸阿米卡星为从本次筛选所用氨基糖苷类抗生素中筛选出的有效抗柑桔黄龙病病菌化学药剂。
[0031]实施例5 内酰胺类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响研究β_内酰胺类抗生素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响，实验结果见图4。当带菌柑桔木虱取食分别含有氨苄西林或头孢他啶的化学药剂溶液24 h后，再用健康柑桔叶片分别饲养5 d，其体内黄龙病病菌浓度的抑制率分别为7.40%和21.71%，但均与处理前无显著性性差异；当带菌柑桔木虱取食含有青霉素G的化学药剂溶液后，其体内黄龙病病菌浓度却上升了 39.60%。这表明，β-内酰胺类抗生素中的氨苄西林和头孢他啶虽能在一定程度上抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内增殖，但对带菌柑桔木虱体内黄龙病病菌浓度的降低作用并不明显；而青霉素G不能有效抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内的增殖。结果表明，本次筛选尚未从本次筛选所用的β-内酰胺类抗生素中，筛选出有效的抗柑桔黄龙病病菌化学药剂。
[0032]实施例6喹诺酮类抗菌药等对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响研究喹诺酮类抗菌药等对柑桔木虱体内黄龙病病菌的抑菌活性的影响，实验结果见图5。当带菌柑桔木虱取食分别含有盐酸环丙沙星、培氟沙星、水溶性氯霉素或噻霉酮的化学药剂溶液24 h后，再用健康柑桔叶片分别饲养5 d，其体内黄龙病病菌浓度分别上升了12.37%,30.84%、13.02%和26.13%。这表明，喹诺酮类抗菌药中的盐酸环丙沙星、培氟沙星，氯霉素类抗生素中的水溶性氯霉素以及噻霉酮等均不能有效抑制黄龙病病菌在柑桔木虱体内的增殖。结果表明，本次筛选尚未从本次筛选所用的喹诺酮类抗菌药和氯霉素类抗生素中，筛选出有效抗柑桔黄龙病病菌化学药剂。
[0033]实施例7盐酸四环素和盐酸土霉素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的脱除效果研究盐酸四环素和盐酸土霉素对柑桔木虱体内黄龙病病菌的脱除效果，实验结果见图
6。当带菌柑桔木虱取食含有盐酸四环素的化学药剂溶液24 h后，再用健康柑桔叶片分别饲养15 d (存活8头)和20 d (存活3头)，其体内黄龙病病菌浓度的抑制率分别为98.36%和100.00% ;而带菌柑桔木虱取食含有盐酸土霉素的化学药剂溶液24 h后，再用健康柑桔叶片分别饲养15 d (存活11头)和20 d (存活5头)，其体内黄龙病病菌浓度的抑制率分别为95.87%和99.29%。实验结果初步表明，带菌柑桔木虱体内的黄龙病病菌，可以通过长时间取食含有盐酸四环素或盐酸土霉素的化学药剂溶液而脱除。
【权利要求】
1.一种柑桔黄龙病防控药剂的快速筛选方法,其特征在于，所述柑桔黄龙病防控药剂快速筛选方法的初步评价材料为带菌柑桔木虱，并采用奶-驴⑶实时动态监测所述黄龙病病菌在带菌柑桔木虱体内的消长程度来评价药效。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.饲喂处理:带菌柑桔木虱成虫取食适量化学药剂溶液后，再用健康的柑桔叶片饲养； 82.药效评价:提取饲喂处理后的带菌柑桔木虱总0嫩，再通过奶-驴⑶技术实时动态监测黄龙病病菌在木虱体内的消长程度来初步评价药效。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述化学药剂溶液的浓度为1000
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述化学药剂的处理时间为2处。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木虱成虫经过饥饿处理12卜后再用于81步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述52步骤中奶-驴⑶实时动态监测的检测引物为'，其核苷酸序列分别如3即10勵:广2所示；探针为18？，其核苷酸序列如卿10勵:3所示； 所述检测反应体系为2X1叫1册？邙10 111,10 9 11101/1的上下游引物和探针各0.4 9匕0嫩模板1仏，再加灭菌况职至总体积20 9匕反应条件为951预变性30 8后；951退火5 8，601延伸30 8，共40个循环；在每个循环的退火和延伸阶段同步实时采集荧光，根据标准曲线，换算出待测样品中黄龙病病原的含量。
【文档编号】C12Q1/68GK104404158SQ201410744410
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】王华堂, 曾鑫年, 陈冬梅, 高传贺, 孔凡超 申请人:华南农业大学