一种扩增鸭坦布苏病毒的方法
【专利摘要】本发明涉及病毒培养【技术领域】，具体涉及一种扩增鸭坦布苏病毒的方法。利用本发明所述方法扩增鸭坦布苏病毒，接毒92h时，细胞活率即降至30%以下，病毒滴度高于1011TCID50/ml。尤其是当接种的鸭坦布苏病毒数与BHK-21活细胞数的比例为1:3-4时，反应器内增殖病毒滴度显著高于接种比例为1：1-2时的反应器中增殖的病毒滴度，取得了意料不到的技术效果。
【专利说明】一种扩增鸭坦布苏病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒培养【技术领域】，具体涉及一种扩增鸭坦布苏病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国江苏、浙江、山东、福建、江西、河北等地饲养的开产种鸭和蛋鸭暴发 了一种以产蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征的疾病，对我国的养鸭业造成的经济损失达30 亿以上。流行病学调查表明，该病毒危害几乎所有（除番鸭以外）的产蛋鸭，临床特征主要 表现为高热、食欲废绝、产蛋下降甚至绝产，恢复后的种鸭所产种蛋受精率和孵化率明显下 降，群内发病率几乎100%，产蛋量可下降30%~60%，病死率可达5%~10%。病例剖检的特征性 变化主要见于卵巢，表现为卵泡发育不良，卵泡出血、变性和破裂，部分可见卵黄性腹膜炎。 从病死鸭体内采集标本进行病原分离鉴定，从形态学观察、理化特性测定、动物回归实验和 部分基因序列分析表明，该病毒属于黄病毒科黄病毒属的一个新成员。
[0003] 由于黄病毒科黄病毒属的成员，可在人和动物之间通过蚊虫等叮咬吸血造成疾病 流行，从而引起人和动物严重的自然疫源性疾病，故应加紧对该病毒进行防控，研发和生产 高效的鸭坦布苏病毒疫苗尤为重要。目前该疫苗的生产在技术方面还存在不足，尚未找到 合适的提高病毒滴度和疫苗效价的方法，大大限制了该疾病防控工作的开展。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术问题，提供了一种扩增鸭坦布苏病毒的新方法。利用该方 法扩增鸭坦布苏病毒，不仅病毒增殖速度快，而且病毒滴度高，效果显著。
[0005] 本发明首先提供一种扩增鸭坦布苏病毒的方法，包括如下步骤： 1) 将悬浮有BHK-21细胞的细胞培养液接种于生物反应器中扩增培养； 2) 将鸭坦布苏病毒接种到步骤1)扩增培养的BHK-21细胞上； 3) 将步骤2)接毒后的细胞进行再培养； 4) 收获扩增的子代病毒。
[0006] 所述步骤2)是按照鸭坦布苏病毒数：BHK-21活细胞数=1:1-7的比例将病毒接种 至步骤1)扩增培养的BHK-21细胞上。
[0007] 进一步的，所述步骤2)是按照鸭坦布苏病毒数：BHK-21活细胞数=1:3-4的比例 将病毒接种至步骤1)扩增培养的BHK-21细胞上。
[0008] 利用本发明所述方法扩增鸭坦布苏病毒，接毒92h时，细胞活率即降至30%以下， 病毒滴度高于l〇 nTCID5(l/ml。尤其是当接种的鸭坦布苏病毒数与BHK-21活细胞数的比例 为1:3-4时，病毒增殖速度快且病毒滴度高，当接种的病毒数超过该比例时，病毒滴度反而 明显下降，取得了意料不到的技术效果。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
[0010] 实施例1利用悬浮培养的BHK-21细胞扩增鸭坦布苏病毒 1、 将低血清培养的BHK-21悬浮细胞分别接种于1-7号生物反应器中，首次接种体积为 2L (BHK低血清培养基购自北京赛百泰生物技术有限公司），活细胞密度为2. 7X105/ml，活 率为90%，37 °C培养； 2、 37°C培养24h后，进行活细胞计数，然后按照鸭坦布苏病毒数：BHK-21活细胞数 =1:1-7的比例分别向1-7号培养罐内接种病毒，同时向生物反应器内补加新鲜培养基1L， 调换温度至32°C，继续培养； 3、 32°C培养24h后（即接毒后24h)，取样，进行细胞计数，并计算细胞活率，32°C继续培 养； 4、 32°C继续培养24h后（即接毒后48h)，再次取样，进行细胞计数，计算细胞活率，同时 向生物反应器内再次补加2L新鲜培养液，32°C继续培养； 5、 32°C继续培养24h后（即接毒后72h)，再次取样，进行细胞计数，计算细胞活率，32°C 继续培养； 6、 接毒72h取样计数后，每隔4h取样一次，计数，进行细胞活率监测，待细胞活率降至 30%或以下时进行收毒，将7个反应器内病毒培养液取出，分别进行分装，并取样进行反复 冻融三次后，进行后续检测实验； 对接毒前后不同时间段的细胞进行取样，经台盼蓝染色后，计数，计算细胞活率，结果 表明，接种病毒48h内细胞增长较快，活率较高，保持在90%以上；接毒48h后活细胞数开始 下降，活率明显降低，在接毒72h时可见明显细胞病变，接毒72-96h内，7个反应器内细胞先 后在不同时间出现大量病变及细胞死亡破碎后的碎片。
[0011] 根据本发明，运用已建立的针对该病毒的特异性RT-PCR诊断方法对细胞培养物 进行鉴定，同时通过测定细胞培养物中病毒的TCID50计算病毒在细胞中的增殖滴度。
[0012] 实施例2鸭坦布苏病毒病毒的RT-PCR鉴定 取1-7号生物反应器内收获的病毒培养物，分别用鸭坦布苏病毒特异的检测引物进行 RT-PCR鉴定，检测结果显示，1-7号反应器内收获样品均可扩增到预期的目的基因片段，证 明收获病毒液中确实有鸭坦布苏病毒的存在。
[0013] 实施例3鸭坦布苏病毒TCID5tl的测定 1、制备BHK-21细胞悬液，并进行细胞计数，备用。
[0014] 2、在离心管中将收获的病毒液作连续10倍的稀释，从KT1?1(Γ1(Ι。
[0015] 3、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每 孔接种ιοομ?。
[0016] 4、在每孔中加入细胞悬液10〇μ1，细胞浓度为2?3Χ IO5个/ml，设正常细胞对照， 正常细胞对照作两纵排。（ιοομ?生长液+ιοομ?细胞悬液） 5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。统计出现细胞病变（CPE)的细胞孔。
[0017] 6、用 Karber 法计算 TCID5tl值。
[0018] 计算公式：lgTCID5(l=L-d (s-0. 5) 其中，L :最高稀释度的对数；d :稀释度对数之间的差；s :阳性孔比率总和。
[0019] 实施例4增殖鸭坦布苏病毒检测结果统计 对1-7号反应器内收毒检测结果及病毒增殖过程中不同时间点的细胞活率进行了统 计比较，统计结果见下表： 1-7号生物反应器不同时间点细胞活率及收获病毒含量统计
【权利要求】
1. 一种扩增鸭坦布苏病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤： 1) 将悬浮有BHK-21细胞的细胞培养液接种于生物反应器中扩增培养； 2) 将鸭坦布苏病毒接种到步骤1)扩增培养的BHK-21细胞上； 3) 将步骤2)接毒后的细胞进行再培养； 4) 收获扩增的子代病毒。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤2)是按照鸭坦布苏病毒数： BHK-21活细胞数=1:1-7的比例将病毒接种至步骤1)扩增培养的BHK-21细胞上。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤2)是按照鸭坦布苏病毒数： BHK-21活细胞数=1:3-4的比例将病毒接种至步骤1)扩增培养的BHK-21细胞上。
【文档编号】C12R1/93GK104480074SQ201410744319
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】徐丽丽, 凌红丽, 魏波 申请人:青岛蔚蓝生物股份有限公司