一种能够缓解慢性酒精性肝损伤的鼠李糖乳杆菌及其用途的制作方法

专利名称：一种能够缓解慢性酒精性肝损伤的鼠李糖乳杆菌及其用途的制作方法
一种能够缓解慢性酒精性肝损伤的鼠李糖乳杆菌及其用途技术领域：
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种能够缓解慢性酒精性肝损伤的鼠李糖乳杆菌，本发明还涉及所述鼠李糖乳杆菌的用途。
背景技术：
酒精滥用和酒精依赖已成为当今世界日益严重的公共卫生问题，在我国酒精所致的肝损伤呈逐年上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损伤的第二大病因。酒精对肝脏的损伤主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。酒精性肝损伤还会导致其它危害，例如致使肝脏无法完全过滤血液，会引发高血脂、心脑血管病；肝脏分解代谢能力降低，并发糖尿病、胆石症、肾病；引发急性妊娠性脂肪肝以及对机体消化系统的损伤等。因此，探寻酒精性肝病的发病机制和防治干预措施将具有十分重要的意义。目前人们认为，酒精性肝损伤的主要原因是乙醇在肝细胞内代谢时产生的毒性代谢产物以及由此引起的代谢紊乱。酒精性肝损伤原因具体地是1、乙醛的毒性作用乙醛通过与半胱氨酸、谷胱甘肽及维生素E的相互作用促进脂质过氧化；乙醛与肝脏内多种蛋白结合，作为抗原，刺激机体产生抗体，引起相应的免疫应答，导致肝细胞损伤；乙醛还可以与酶的重要功能基团结合，导致酶的活性改变，从而影响酶的功能。2、自由基的损害作用乙醇在代谢过程中可以产生大量的自由基和活性氧，自由基能够直接损伤肝细胞，还会通过增加肝细胞对脂质过氧化的敏感性，引起肝细胞损伤。3、内毒素的诱导作用乙醇的摄入使得肠道菌群紊乱，同时，破坏肠道粘膜结构和功能的完整性，增加肠粘膜的渗透性，弓丨起血液中内毒素含量增加，而内毒素则会诱导多种细胞因子的产生，通过炎症因子造成对肝细胞的损伤。目前针对酒精性肝损伤的成因主要治疗方法有戒酒、营养治疗、药物治疗、基因治疗，与酒精性肝病相关疾病的治疗等方法。目前最常用的方法为药物治疗，它虽有一定的疗效但也存在着很多不足，例如许多药物可能驱使血脂更集中于肝脏代谢，这样反而促使脂质蓄积并损害肝功能；并且这些药物均在肝脏中代谢，有可能进一步加重肝脏的负担；还有一些药物见效慢、不良反应严重，甚至会产生耐药性和毒副作用。所以，研究人员正在积极探索酒精性肝病的新型治疗与干预方案，而益生菌由于不会产生耐药性和毒副作用，并且已广泛应用于改善人类健康，尤其是对酒精性肝病的防治具有一定针对性(见附图5所示)，于是逐渐引起了人们的关注。益生菌是指在其摄入一定数量后，能够促进动物或人体原生微生物菌群生长而对宿主产生有益影响的活性微生物。所述的益生菌主要包括乳杆菌，双歧杆菌和部分链球菌等；它们一般具备特殊的生理活性和保健功能，例如调节宿主的肠道菌群，治疗由抗生素引起的腹泻，降低血脂胆固醇水平，抑制大肠杆菌、幽门螺杆菌等有害菌的感染等。此外，益生菌能够有效清除自由基，提高机体的抗氧化活性；能够调节肠道菌群，降低内毒素含量；同时，益生菌还能够调节机体的免疫系统。益生菌的这些功能为人们提示，其对于缓解酒精性肝损伤能够发挥一定的作用。而目前有关益生菌保肝护肝方面的报道相对较少，因此，探索利用益生菌作为食疗性的保健食品来缓解酒精性肝损伤具有重要的研究意义，随着人们对酒精性肝损伤的日益重视以及益生菌的不断推广应用，利用益生菌及其产品对酒精性肝病进行膳食干预将具有极为广阔的市场前景。在目前已公开的专利申请中，针对酒精性肝损伤的预防和治疗主要集中于中药组合物。例如CN 101224232A公开了从中药葛根的根中提取得到葛根总黄酮，能够抑制小肠通透性的增加，降低血液中酒精浓度，减轻酒精吸收以及由酒精引起的肝脏损害。CN101961367A公开了一种预防酒精性肝损伤的中药组合物，由真菌多糖成分与水飞蓟水提物成分组成，其溶解性好，在胃肠道中崩解快，吸收好，可增强免疫力并对酒精性肝损伤起辅助保护的作用。还有CN 102058632A和CN 102160637A等也分别公开了中草药及其提取物对酒精性肝损伤的保护作用。涉及到乳制品，例如CN101623032A公开了一种对酒精性肝损伤有辅助保护作用的牛奶，其中添加了水溶性膳食纤维、卵磷脂和大豆多肽等，这种牛奶可以增强肝脏机能，加快酒精代谢，缓解酒精性肝损伤。CN 101328469A公开了一种具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌grx02，并证明了其对急性酒精性肝损伤可以发挥不同程度的保护特性。但是，这些专利没有完全涉及一种可以调节肠道菌群、缓解慢性酒精性肝损伤的益生乳杆菌。因此，目前还需要有一种能够调节肠道菌群、缓解慢性酒精性肝损伤的益生菌及其相关食品。

发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种能够抗氧化、缓解慢性酒精性肝损伤的的鼠李糖乳杆菌。本发明的另一个目的是提供所述的鼠李糖乳杆菌的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFM1107,该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5496。本发明还涉及所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107在使用所述鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂制备乳制品中的用途。根据本发明，所述的乳制品是含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳、乳粉、乳胶囊制品或发酵乳。根据本发明的一种优选实施方式，所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂是按照下述制备方法制备的将鼠李糖乳杆菌CCFMl 107菌种按照以脱脂乳重量计12%接种于在温度110°C下灭菌IOmin的脱脂乳中，然后在温度37°C的条件下培养14_16h至凝乳，连续在相同的条件下培养活化两代，得到的发酵脱脂乳作为母发酵剂；将所述的母发酵剂按照以灭菌脱脂乳体积计3-5%接种于在温度110°C下灭菌IOmin的脱脂乳中，然后在温度37°C的条件下培养14_16h至凝乳，得到所述的工作发酵齐U，该工作发酵剂的活菌数浓度是1-3X 109cfu/mL。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂是按照下述制备方法制备的
将鼠李糖乳杆菌CCFMl 107菌种按照以MRS液体培养基重量计1_5%接种于MRS液体培养基中，在温度37°C条件下培养12-16h进行活化，连续在相同的条件下培养活化两代，然后将活化培养物按照以MRS液体培养基体积计2-4%接种于MRS培养基中，在温度37°C条件下培养16-18h，再在温度4°C条件下以4000r/min离心15min，去除上清液，得到的细胞沉淀用无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂，该工作发酵剂的活菌浓度是l-3X109cfu/mL。根据本发明的另一种优选实施方式，含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳是按照下述步骤制备得到的原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在温度140°C下高温热杀菌2s，然后冷却至度4°C，再加入所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107工作发酵剂，使其浓度达到106Cfu/mL以上，在4°C冷藏保存，得到含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳。根据本发明的另一种优选实施方式，含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳粉或乳胶囊制品是按照下述步骤制备得到的原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌2s，得到的灭菌原料乳再冷却到37°C，再按照以原料乳体积计4%接种所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107工作发酵剂，然后在温度37°C的条件下发酵16h，得到含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的发酵乳；接着，含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳按照其与上述灭菌原料乳的体积比I : 3加到所述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳粉；把所述的含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳粉装入胶囊，制成乳胶囊制品。根据本发明的另一种优选实施方式，含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的发酵乳是按照下述步骤制备得到的原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌2s，得到的灭菌原料乳再冷却到37°C，再加入以原料乳体积计3-5%所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂与3-5%可制备发酵乳的商品发酵剂，混匀后在温度37°C的条件下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0. 6-0. 7 %，然后冷却至温度4°C，再进行冷藏保存得到含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的商品发酵剂是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳，所述的奶是牛奶、羊奶或马奶。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFM1107,该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5496。本发明人从实验室分离保藏的菌种中筛选出一株益生菌CCFM1107，利用形态特征、培养性状等微生物学特性，以及16S rDNA序列测定的分子鉴定手段对该益生菌CCFM1107 鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFMl 107。该菌株已于 2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5496。所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的形态学特征如下菌落特征在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.5-1. Omm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图I。菌体特征呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，菌体成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形，参见附图2。本发明鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的培养特征如下本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1107延滞期相对较短，在4h就进入对数生长期，在14h 16h达到稳定期，在24h后逐渐衰亡，细胞数目开始降低。本发明鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的液体培养特征鼠李糖乳杆菌CCFMl 107在MRS液体培养基中生长良好，在培养约4h，其培养液开始混浊，在培养约8h开始有菌体细胞沉淀，轻轻摇动没有气泡产生，在培养12h后有大量菌体沉淀，培养20h后乳白色菌体沉淀明显增加，且菌体较为牢固地聚集在培养底部，上层培养液非常澄清，PH值由最初的6. 2降到3. 8。在本发明中，所述的MRS液体培养基是本技术领域的技术人员熟知的，是BDDifco公司以商品名BactO Lactobacilli MRS Broth销售的用于乳杆菌培养的培养基，也可以是国内有关公司生产的相同的商品化培养基。本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM1107来源于传统发酵食品，根据卫生部可食用菌种名单属公认安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)菌种,可用于发酵食品中。本发明还涉及所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107在使用所述鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂制备乳制品中的用途。所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂是按照下述制备方法制备的一般地，首先需要对鼠李糖乳杆菌CCFMl 107纯培养物进行反复接种，以恢复其菌株的活力。取少量纯培养物接种至在温度110°c下灭菌IOmin的脱脂乳中，在温度37°C的条件下进行培养。最初数小时慢慢地加以振荡，使菌种与脱脂乳混合均匀，然后静置培养直至凝固。凝固后，用灭菌吸管从底部吸取l_2mL凝乳培养物，在无菌条件下加到灭菌脱脂乳中进行培养至凝乳。按照这种方法反复进行数次，使菌种充分活化，这样用于制备母发酵剂。然后，将经过如此复壮的鼠李糖乳杆菌CCFM1107菌种按照以脱脂乳重量计12%接种于在温度110°C下灭菌IOmin的脱脂乳中，然后在温度37°C的条件下培养14_16h至凝乳，连续在相同的条件下培养活化两代，得到的发酵脱脂乳作为母发酵剂。所述的加热杀菌是例如使用英国斯必克APV公司销售的145C型杀菌机进行的。脱脂乳是一种本技术领域里人们熟知的乳品。将原料乳经过验收、过滤后，预热至38°C左右，利用离心分离机，例如瑞典阿法-拉伐(Alfa-Laval)公司制造的封闭式离心分离机便可以将原料乳分成稀奶油和脱脂乳两部分，通过这种方法便可以得到所述的脱脂乳。将所述的母发酵剂按照以灭菌乳体积计3-5%接种于在温度110°C下灭菌IOmin的脱脂乳中，然后在温度37°C的条件下培养14-16h至凝乳，得到所述的工作发酵剂，该工作发酵剂的活菌浓度是1-3X 109cfu/mL。工作发酵剂质量优劣直接影响所生产的发酵乳制品的质量。因此，需要对工作发酵剂进行感官检查，判断工作发酵剂是否凝固均匀，组织细腻、致密，是否有弹性，是否有酸味和芳香味，无异味，无气泡；还需要进行化学检查，测定其酸度，其滴定酸度一般是90-110° T ;采用本技术领域里的常规方法(参见GB 4789. 2-2010，食品安全国家标准，中华人民共和国卫生部)测定细菌总菌数，测定鼠李糖乳杆菌CCFM1107活菌浓度应该达到l-3X109cfu/mL。或者，所述的 鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂是按照下述制备方法制备的将鼠李糖乳杆菌CCFMl 107菌种按照以MRS液体培养基重量计1_5 %接种于MRS液体培养基中，然后在温度37°C的条件下培养12-16h进行活化，连续在相同的条件下培养活化两代，然后将活化培养物按照以MRS液体培养基体积计2-4%接种于MRS培养基中，然后在温度37°C的条件下培养16-18h,再在温度4°C条件下以4000r/min离心15min,去除上清液，得到的细胞沉淀用无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂，该工作发酵剂的活菌浓度是 l-3X109cfu/mL。 在本发明中，所述的乳制品是含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的乳、乳粉、乳胶囊制品或发酵乳。根据本发明，含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的乳是按照下述步骤制备得到的原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在温度140°C下高温热杀菌2s，然后冷却至度4°C，再加入所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107工作发酵剂，使其浓度达到106Cfu/mL以上，在4°C冷藏保存即得到含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳。在本发明中，加热杀菌设备是本技术领域里通常使用的市场上广泛销售的设备。所述的加热杀菌是例如使用英国斯必克APV公司销售的145C型杀菌机进行的。所述的高温热杀菌是例如使用日本PowerPoint International有限公司销售的PT-20C-R型管板式组合式超高温杀菌机进行的。含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的乳还可以在其中添加在本技术领域里通常使用的砂糖、稳定剂、香精、色素、果汁等辅料。所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳，所述的奶是牛奶、羊奶或马奶。例如脱脂奶是脱脂牛奶、脱脂羊奶或脱脂马奶；鲜奶是鲜牛奶、鲜羊奶或鲜马奶。所述的复原奶应该理解是一种用浓缩全脂乳或/和全脂乳粉与水勾兑而成的原料乳。根据本发明，含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的的乳粉或胶囊制品是按照下述步骤制备得到的原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌2s，得到的灭菌原料乳再冷却到37°C，再按照以原料乳体积计4%接种上述的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107工作发酵剂，然后在温度37°C的条件下发酵16h，得到含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的发酵乳；接着，含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳按照其与上述灭菌原料乳的体积比I : 3加到所述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳粉。所述的均质是一项在食品生产中经常采用的技术。食品加工中的均质就是指物料的料液在挤压、强冲击与失压膨胀三重作用下使物料细化，从而使物料能更均匀的相互混合，比如奶制品加工中使用均质机使牛奶中的脂肪球破碎更细小，从而使整个产品体系更加稳定。均质主要通过均质机来进行的。均质机是食品、乳品行业的重要加工设备，本发明使用的均质机是目前市场上销售的产品，例如上海东华高压均质机厂销售的GYB40-10S型高压均质机。根据本发明，所述的真空浓缩是食品生产中经常采用的技术，本技术领域里的技术人员根据物料性质选择其浓缩温度与真空度是不存在任何困难的。本发明使用的真空浓缩设备是目前市场上销售的产品，例如扬州市食品机械厂销售的真空浓缩锅。根据本发明，所述的喷雾干燥是食品生产中经常采用的技术，本技术领域里的技术人员根据物料性质选择其干燥温度与干燥时间是不存在任何困难的。本发明使用的喷雾干燥设备是目前市场上销售的产品，例如上海沃迪科技有限公司销售的实验型喷雾干燥机。根据本发明，把含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的所述乳粉装入胶囊，制成胶囊制品。根据本发明，所述的胶囊是目前医药、食品市场上销售的产品。根据本发明，含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳是按照下述步骤制备得到的原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌2s，得到的灭菌原料乳再冷却到37°C，再加入以原料乳体积计3-5%所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂与3-5%可制备发酵乳的商品发酵剂，混匀后在温度37°C的条件下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计0. 6-0. 7 %，然后冷却至温度4°C，再进行冷藏保存得到含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳。所述的商品发酵剂是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，例如美国丹尼斯克公司或丹麦科汉森公司的产品。保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus)目前被广泛地应用在发酵乳制作的过程当中，在分类上属于乳酸杆菌属，因其菌种产地、微生物特性、效能优异等特点，被微生物学家命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种(简称保加利亚乳杆菌)。嗜热链球菌是制作发酵乳的重要发酵剂，广泛用于生产发酵乳制品，其中包括酸奶和奶酪。嗜热链球菌也具有一些功能活性，例如产生胞外多糖、细菌素和维生素。通过动物实验表明，本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM1107能改善酒精性肝损伤小鼠的肝功能、抗氧化指标、缓解内毒素血症及调节肠道菌群分布，可以有效地缓解酒精性肝病，其作用效果与市场上常用的黑龙江葵花药业股份有限公司生产的葵花护肝片相当，甚至更好。
[有益效果]本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM1107具有很高的抗氧化能力；细胞浓度为101(lcfu/mL的鼠李糖乳杆菌CCFM1107完整细胞和无细胞提取物对二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的清除率分别为93. 51 %和89. 66 % ;细胞浓度为1010cfu/mL的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107完整细胞和无细胞提取物对羟自由基的清除率分别为94. 16%和93. 87% ;鼠李糖乳杆菌CCFMl 107完整细胞和无细胞提取物均具有一定的还原能力，浓度为101(lCfu/mL的完整细胞和无细胞提取物的还原能力分别相当于392. 07 u mol/L和373. 91 u mol/L浓度的半胱氨酸盐酸盐；鼠李糖乳杆菌CCFMl 107还具有抑制脂质过氧化的能力，浓度为101(lCfu/mL的完整细胞和无细胞提取物对脂质过氧化的抑制率分别达到84. 52%和81. 18%。鼠李糖乳杆菌CCFMl 107能够耐受胆盐的浓度为0. 35%，能够耐受的氯化钠浓度为8%，耐受的pH值为3.O。动物实验结果表明，本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM1107能改善酒精性肝损伤小鼠的肝功能、抗氧化指标、缓解内毒素血症及调节肠道菌群分布，可以有效地缓解酒精性肝病，其作用效果与市场上常用的黑龙江葵花药业股份有限公司生产的葵花护肝片相当，甚至更好。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFMl 107 菌株已于 2011 年 11 月 29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo. 5496。

图I表示鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的菌落形态；图2表示鼠李糖乳杆菌CCFMl 107革兰氏染色的菌体形态(1000X)；图3表示鼠李糖乳杆菌CCFMl 107在MRS液体培养基中在温度37°C与厌氧培养条件下的生长曲线；图4表示各组小鼠肝脏病理切片HE染色的形态观察(200 X)A为空白组，B为模型组，C为药物组，D为灌胃CCFM1107的干预组，E为灌胃植物乳杆菌N-9组，作为阴性对照组；图5表示酒精性肝损伤发病原因与益生菌健康功效的关系。
具体实施方式通过下述实施例将更好地理解本发明。除非特别指出，下面这些实施例使用的设备、测定方法等都是本说明书中指出的那些设备和方法，实施例不再赘述。实施例I :本发明鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的16S rDNA序列鉴定将鼠李糖乳杆菌CCFMl 107接种于MRS液体培养基中，在温度37 V的条件下培养18h，取ImL培养菌液采用细菌基因组DNA提取试剂盒，按其说明进行操作。以基因组 DNA 作为模板，以文献(Critical Evaluation ofTwo Primers Commonly Usedfor Amplification of Bacterial 16S rRNA Genes. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2008, 74 (8) :2461-2470)公布的细菌鉴定通用引物为引物，采用50 y L反应体系进行PCR扩增、然后对扩增产物进行纯化、回收和测序。目的基因PCR扩增产物的测序是由上海生物工程技术服务有限公司完成的，将鼠李糖乳杆菌CCFM1107的16S rDNA的测序结果利用NCBI核酸数据库进行比对，最终结果表明本发明的CCFM1107与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus strain HT2,Lactobacillus rhamnosus strain 20300 以及Lactobacillus rhamnosus strain NM94-5等多种鼠李糖乳杆菌的同源性均高达99%，因此，将本发明的CCFMl 107菌株鉴定为鼠李糖乳杆菌，命名为Lactobacillus rhamnosus CCFM1107，于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 5496。实施例2 鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的微生物学性质测定
鼠李糖乳杆菌CCFMl 107按照以MRS液体培养基体积计5 %接种量接入MRS液体培养基中，分别在011、111、211、311、411、611、811、1011、1211、1411、1611、1811、2011、2211 和 24h 这些时间点用PH计测定培养液的pH值，并用分光光度计测定在600nm处的OD6tltl值。本发明使用的pH计是梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司销售的320-S pH计，使用的分光光度计是尤尼柯(上海)仪器有限公司销售的UV-2100紫外可见分光光度计。以0D_值和pH值对培养时间绘图，可以得到鼠李糖乳杆菌CCFMl 107在MRS培养基中的生长曲线，其结果如图3所示。在MRS培养基中，鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的延滞期相对较短，在4h时进入对数 生长期，在14 16h时进入稳定期。随着培养时间的延长，pH不断下降。进入稳定期后，PH基本保持不变。培养24h后，pH由最初的6. 13降至3. 86。24h培养液中鼠李糖乳杆菌CCFMl 107活菌浓度为6. 8X 108cfu/mL。实施例3、鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的抗氧化能力首先，制备鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的完整细胞及无细胞提取物。将本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1107活化培养后接种于MRS液体培养基中，在温度370C的条件下培养24h，经在6000r/min与温度4°C的条件下离心lOmin，得到培养上清液和菌体沉淀，菌体沉淀经无菌生理盐水洗涤两次后，在无菌生理盐水重悬，调整细胞浓度约为109cfu/mL。所得菌细胞悬液分为两组，一组为完整细胞组(1C)，另一组用于无细胞提取物(CFE)的制备。将细胞悬浮液用超声波破碎仪(Sonics&Materials公司，VCX500型)在200W与温度4°C的条件下进行超声破碎，每个处理进行5s、每个处理间隔5s，超声粉碎30min，再在显微镜下检查没有完整菌体，然后以温度4°C与6000r/min的条件下离心lOmin，收集上清液，即为无细胞提取物。然后，进行鼠李糖乳杆菌CCFM1107各项抗氧化能力的测定，其中包括对DPPH自由基、羟自由基的清除率，还原活性以及脂质过氧化的抑制率，这些结果列于表I中。(I)清除DPPH自由基的能力DPPH (I, I- 二苯基-2-三硝基苯餅，I, I-Diphenyl-2-pi cry Ihydrazy I radical)自由基是一种常见的筛选和评价抗氧化剂的有效方法，它是一种稳定的有机自由基，有单个电子，在醇溶液中呈现紫色，在517nm处有较强吸收，当加入对DPPH自由基有清除作用的物质后，其吸收会减弱，可通过这一变化检查测试物质的抗氧化性能。本实施例按照改进的 MEEI-YN LIN 和 FEN-JUAN CHANG 的方法(Antioxidative effect of intestinalbacteriaBifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilusATCC4356. Digestive Diseases and Sciences，2000，45 (8) :1617-1622)，测定出 CCFM1107完整细胞与无细胞提取物对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率是根据该文献给出的计算方法计算得到的。(2)清除羟自由基的能力羟自由基是活泼性最强，氧化性最大的自由基，对DNA、蛋白质和脂类有较强的结合能力，是引起体内氧化损伤的主要因素。本实施例通过Fenton反应产生羟自由基HO*，以邻菲罗啉-Fe2+作为该反应的氧化还原指示剂，加入HO 的清除剂，则HO 减少，同时Fe2+ 增多，溶液颜色变红。具体方法参照 John M. C. GUTTERIDGE，Ferrous-salt-promoteddamage todeoxyribose and benzoate.The increased effectiveness ofhydroxyl-radicalscavangers in the presence of EDTA，Biochemical Journal. 1987，243 :709-714。羟自由基清除能力是用羟自由基清除率表示的，羟自由基清除率是根据该文献给出的计算方法计算得到的。(3)还原活性的测定
还原活性主要指一些酶(如过氧化氢酶、NADH氧化酶、NADH过氧化物酶)和非酶复合物(维生素C、维生素E、谷胱甘肽)具有减少氧自由基和螯合Fe2+的能力，进而减少氧化反应的发生。本实施例按照改进的Meei-Yn Lin和Chyuan-Liang Yen的方法(Antioxidative ability of lactic acidbacteria. Journal of Agricultural and FoodChemistry, 1999,47 :1460-1466)测定出CCFM1107完整细胞与无细胞提取物的还原活性。还原活性是用还原力表示的，它相当于半胱氨酸盐酸盐浓度，还原力是根据该文献给出的计算方法计算得到的。(4)抑制脂质过氧化的能力脂质过氧化反应主要是指在生物膜不饱和脂肪酸中在氧自由基诱导下发生的一系列自由基反应。脂质过氧化反应的最终产物有丙二醛(MDA)，MDA可破坏蛋白质、核酸等生物大分子，造成机体老化和多种疾病的发生。因此，测定MDA的含量，在一定程度上可反映脂质过氧化损伤的程度，是目前公认的反映脂质过氧化的指标。本实施例按照改进的 M. Y. LIN 和 C. L. YEN 的方法(Reactive oxygen species and lipidperoxidationproduct-scavenging ability of yogurt organisms. Journal of DairyScience，1999,82 :1629-1634)测定出CCFM1107完整细胞与无细胞提取物抑制脂质过氧化的能力，其抑制脂质过氧化能力是以脂质过氧化抑制率表示的，脂质过氧化抑制率是根据该文献给出的计算方法计算得到的。上述CCFM1107完整细胞与无细胞提取物的DPPH清除率、羟自由基清除率、还原力与脂质过氧化抑制率的结果汇集于表I中。表I鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的抗氧化能力
~~DPPH~~择自由基~还原力/相当于半胱氨酸脂质过氧化 抗氣化指标
清除率/% 清除率/% 盐酸盐的浓度(pmol/L) 抑制率/%
完整细胞 93.51±3.57 94.16±5.64392.07±7.1584.52±3.69
无细胞提取液 89.66±4.02 93.87±2.38373.91±6.3681.18±4.85由上表可知鼠李糖乳杆菌CCFM1107在清除自由基、抑制脂质过氧化以及还原力方面均表现出较高的活性。综上所述，CCFM1107在所筛的菌株中具有较高的抗氧化活性。实施例4 鼠李糖乳杆菌CCFMl 107对胆盐的耐受性试验在MRS液体培养基中加入牛胆汁盐，牛胆汁盐浓度达到以其MRS液体培养基质量计分别为 0. 0%、0. 10%,0. 20%,0. 30%,0. 35%,0. 40%和 0. 45%，灭菌后以 MRS 液体培养基体积计5%接种量接种本发明的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107菌种，在温度37 °C的条件下培养24h后观察各组培养液菌体的生长情况，并测定其在600nm下的OD6tltl值，本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1107在不同胆盐浓度的MRS培养基中的生长情况见下表2。人们知道，胆盐对这种菌株的抑制作用取决于胆盐浓度和菌株本身的特性，人肠道中胆盐的含量为0. 03%-o. 30%，能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道中存活。由表2的结果可以看出本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1107在胆汁盐浓度最高为0. 35%的培养基中还能生长。因此鼠李糖乳杆菌CCFM1107具有良好的耐胆盐能力。表2在不同胆盐浓度的培养基中鼠李糖乳杆菌CCFM1107的生长情况
权利要求
1.一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1107,该菌菌株已于2011年11月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其保藏号为CGMCC5496。
2.根据权利要求I所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl107在使用鼠李糖乳杆菌CCFMl 107工作发酵剂制备乳制品中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的乳制品是含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的乳、乳粉、乳胶囊制品或发酵乳。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl107工作发酵剂是按照下述制备方法制备的 将鼠李糖乳杆菌CCFM1107菌种按照以脱脂乳重量计12%接种于在温度110°C下灭菌IOmin的脱脂乳中，然后在温度37°C的条件下培养14_16h至凝乳，连续在相同的条件下培养活化两代，得到的发酵脱脂乳作为母发酵剂； 将所述的母发酵剂按照以灭菌脱脂乳体积计3-5%接种于在温度110°C下灭菌IOmin的脱脂乳中，然后在温度37°C的条件下培养14-16h至凝乳，得到所述的工作发酵剂，该工作发酵剂的活菌浓度是1-3X 109cfu/mL。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl107工作发酵剂是按照下述制备方法制备的 将鼠李糖乳杆菌CCFM1107菌种按照以MRS液体培养基重量计1_5%接种于MRS液体培养基中，在温度37°C条件下培养12-16h进行活化，连续在相同的条件下培养活化两代，然后将活化培养物按照以MRS液体培养基体积计2-4%接种于MRS培养基中，然后在温度37°C的条件下培养16-18h，再在温度4°C条件下以4000r/min离心15min，去除上清液，得到的细胞沉淀用无菌脱脂乳悬浮，得到所述的工作发酵剂，该工作发酵剂的活菌浓度是l-3X109cfu/mL。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于含有鼠李糖乳杆菌CCFMl107的乳是按照下述步骤制备得到的 原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在温度140°C下高温热杀菌2s，然后冷却到温度4°C，再加入根据权利要求4或5所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107工作发酵剂，使其浓度达到106cfu/mL以上，在4°C冷藏保存，得到含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于含有鼠李糖乳杆菌CCFMl107的乳粉或乳胶囊制品是按照下述步骤制备得到的 原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌2s，得到的灭菌原料乳再冷却到37°C，再按照以原料乳体积计4%接种根据权利要求4或5所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107工作发酵剂，然后在温度37°C的条件下发酵16h，得到含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳；接着，含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳按照其与上述灭菌原料乳的体积比I : 3加到所述灭菌原料乳中，进行均质，真空浓缩、喷雾干燥得到含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的乳粉； 把所述的含有鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳粉装入胶囊，制成乳胶囊制品。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于含有鼠李糖乳杆菌CCFMl107的发酵乳是按照下述步骤制备得到的原料乳在温度95°C下加热杀菌20min或在140°C下高温热杀菌2s，得到的灭菌原料乳再冷却到37°C，再加入以原料乳体积计3-5%根据权利要求4或5所述的鼠李糖乳杆菌CCFMl 107工作发酵剂与3-5%可制备发酵乳的商品发酵剂，混匀后在温度37°C的条件下混菌发酵至滴定酸度以乳酸计O. 6-0. 7%，然后冷却至温度4°C，再进行冷藏保存，得到含有鼠李糖乳杆菌CCFMl 107的发酵乳。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的商品发酵剂是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
10.根据权利要求6、7或8中任一项权利要求所述的用途，其特征在于所述的原料乳是一种或多种选自脱脂奶、鲜奶、复原奶的原料乳，所述的奶是牛奶、羊奶或马奶。
全文摘要
本发明涉及一种能够抗氧化、缓解慢性酒精性肝损伤的鼠李糖乳杆菌CCFM1107，还涉及所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1107在使用其工作发酵剂制备乳制品中的用途。所述的乳制品是含有本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1107的乳、乳粉、乳胶囊制品或发酵乳。本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM1107具有很高的抗氧化能力、二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基与羟自由基的清除能力、抑制脂质过氧化能力、耐受胆盐、氯化钠和pH的能力。本发明的鼠李糖乳杆菌CCFM1107能改善酒精性肝损伤小鼠肝功能、抗氧化指标、降低血清内毒素水平及调节肠道菌群分布，可以有效地缓解酒精性肝损伤。
文档编号C12R1/225GK102618456SQ20121004632
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者刘小鸣, 张灏, 张秋香, 王刚, 田丰伟, 范大明, 赵建新, 迟菲菲, 陈卫, 黄文利 申请人:江南大学