专利名称：耐辐射异常球菌R1 ytxH基因培育耐盐植物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐福射异常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) ytxH基因 (DR0105GeneID =1799501)的新功能，具体涉及该基因在改良植物对盐胁迫抗性方面的应用。
背景技术：
土壤盐溃化是一个世界性的资源问题和生态问题，越来越引起人们的重视。随着分子生物学的技术进步，使基因的定位、分离、转移成为现实，在提高农作物耐盐能力方面起着重要的作用。耐福射异常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因具有对电离福射、UV福射、DNA损伤试剂及渗透胁迫等极强抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株，也可作为一个研究高等植物耐盐的模式物种(Battista et al. , 2001) 来源于D. radiodurans Rl 基因组中一个大质粒，其编码的蛋白与渗透胁迫抗性相关。ytxH基因(DR0105)编码的蛋白 YtxH (含有40_50aa的保守区段)属于Lea76家族，与渗透胁迫相关。但目前未见耐福射异球菌Deinococcus radiodurans Rl中的ytxH基因 (DR0105GeneID :1799501)在提高植物耐盐性方面的功能的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D. radiodurans Rl基因组中发现能够提高植物对盐抗性的基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的性状。本发明通过如下研究发现，Deinococcus radiodurans Rl的ytxH基因 (DR0105GeneID :1799501)具有耐高渗和盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物I、获得含有H radiodurans RlytxH基因(DR0105)的重组工程菌株I)通过 PCR 从 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因组扩增出 D. radioduransRlytxH 基因(DR0105)，基因序列号为=GeneID 1799501 其大小为 492bp， 该基因编码163个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整ytxH基因 (DR0105)的重组质粒 pGEMT-ytxH ;2)将ytxH基因(DR0105)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整ytxH基因重组质粒 pRADZ3-ytxH G ；3)将导入ytxH基因(DR0105)的重组质粒pRADZ3_ytxH G转入受体大肠杆菌 JM109中，获得工程菌株JM-ytxH (见实施例I)；2、含有D. radiodurans RlytxH基因工程菌株的耐盐实验实验证实，经4M NaCl盐溶液冲击后，含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105) 的JM-ytxH重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力；
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此实验表明D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)具有提高原核生物耐盐的能力。3、ytxH基因(DR0105)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性鉴定I)将D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)连接到植物表达载体pBI 121中，构建具有ytxH基因(DR0105)的重组质粒pBI121_ytxH ;2)将pBI121-ytxH重组质粒转化油菜中，获得了能够耐受盐胁迫的转基因油菜植株;此实验表明D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3及图5)。
图I是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)序列的PCR产物的验证电泳2是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)及groEL启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；图3是在盐冲击试验前的含有空载体和含有D. radiodurans RlytxH基因 (DR0105)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)表达载体的大肠杆菌重组菌株；图4是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E. coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)表达载体的大肠杆菌重组菌株。图5 是在 300mmol. L4 的 NaCl 培养基上转 D. radiodurans RlytxH 基因(DR0105) 油菜与非转基因油菜的耐盐试验结果比较。图中，从左至右，左起第I盆是非转基因油菜， 第2-3盆是转入D. radiodurans RlytxH基因的油菜。
具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下克隆载体pGEMT-easy :为Promrga公司市售产品；穿梭质粒pRADZ3 :为本实验室保存；植物表达载体pBI121 :为Clontech公司市售产品；大肠杆菌JM 109 :为北京全式金公司市售产品。农杆菌EHA 105由本实验室保存实施例ID. radiodurans RlytxH基因(DR0105)在大肠杆菌中的表达根据已公布的D. radiodurans Rl基因组中的DR_0105基因序列设计I对PCR特异性引物，从D. radiodurans Rl基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列Up 5' ATTA JCWGT TCGCACGTGGGTGATGAGGC 3'；Down 5' ACGC C4Γν4rGAGGCGATCAGTCCTGGTTTT 。其中黑斜体部分是酶切位点。通过PCR方法从D. radiodurans Rl的基因组中扩增出目的基因序列，反应条件为94°C IOmin, [94°C 60sec,55°C 30sec,72°C 60sec]30 个循环，72°C lOmin，PCR 产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT-ytxH，并测序验证克隆基因正确；然后通过Spel/Ndel双酶切获得含有粘性末端的ytxH基因及含有启动子groEL的pRADZ3载体， 将ytxH基因连接于pRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-ytxH G，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该菌株命名为 JM-ytxHο将含有pRADZ3空质粒的E. coli JMl09命名为JM-Z3。实施例2含D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)重组菌株的耐盐实验一、实验方法I、将实施例I中获得的2个重组的大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含 Amp抗生素)中，摇瓶过夜培养后(37°C )，再转接于IOOmL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至0D_约为0. 5。2、取IOmL的菌液离心后，在等体积的4M NaCl盐溶液里冲击2h，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10_4，取10 μ L点在LB固体培养基表面，经37°C培养16h，观察菌落形成情况并照相。二、实验结果图3显示，4M NaCl盐溶液冲击前前含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105) 的JM-ytxH菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；4M NaCl盐溶液冲击后，含有 D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)的JM-ytxH菌株生长状况良好，菌落数明显高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图4)。三、结论D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)提高了原核生物耐盐的能力。实施例3ytxH基因(DR0105)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性鉴定(一 )农杆菌介导转化油菜实验I.根癌农杆菌EHA105感受态的制备I)挑取单菌落，接种于5mL YEB液体培养基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250rpm 振荡培养过夜；2)取 2mL 菌液，加入 50mL YEB 液体培养基(含 Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm 振荡培养至OD600 O. 6 ;3)将菌液转至50mL无菌离心管中，冰浴30min,5000Xg离心5min ；4)弃上清，用2mL 20mM CaCl2重悬沉淀，每份100 μ L分装到I. 5mL离心管中，液
氣中保存备用。2.重组质粒DNA转入农杆菌I)将约I μ g的pBI-ytxH质粒DNA分别加入到100 μ LEHA105感受态细胞中，混勻，冰浴5min ；2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37°C水浴中温浴5min ；3)加入ImL YEB液体培养基，在28°C摇床上250rpm复苏4 5h ;4)取适量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固体培养基上，置28 °C培养24 48h。3.农杆菌的质粒的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液体培养基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸镁O. 5g/L)，28°C，250rpm振荡培养20h ；2)取 I. 5mL 菌液离心后，弃上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM pH8. O, NaCl IOmM, EDTA IOmM pH 8. O)洗涤2次，弃上清，加入预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. O, IOmM EDTA pH 8. O, RNase A 100 μ g/mL) 300 μ L，用移液器反复抽吸混匀， 室温静置IOmin ；3)加入新鲜配置的溶液II (O. 2M NaOH, I % SDS) 600 μ L，上下颠倒几次混匀；4)加入预冷的溶液III (5Μ乙酸钾pH 5. 2，冰醋酸11. 5mL，加水至IOOmL) 450 μ L， 充分混匀，冰浴5min，4°C 12000 Xg离心5min，取上清用O. 6倍体积的异丙醇沉淀；5)沉淀用适量 TE (Tris-HCI IOmmoI/L，ImmoI/LEDTA，pH 8. O)溶解后，经 PCR、Bam HI、Sac I双酶切验证。4.油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的ytxH基因(DR0105)遗传转化I)油菜无菌苗的培养甘蓝型油菜(Brassicanapus L. ) (84100-18)种子在超净工作台上用灭菌水浸泡 IOmin, 10 %的NaClO灭菌12min，再用O. I %的升汞溶液消毒7_8min，用灭菌水洗3_5遍，并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上(7.5%琼脂)。光照培养，4-5d龄油菜幼苗最适于遗传转化。2)预培养用75%的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长点下约O. 5cm长的下胚轴，置于预培养基(MS+6-BA 2mg/L+2,4_D lmg/L+AgN032. 5mg/ L+AS 19. 62mg/L)上，光照预培养2d。3)农杆菌的培养在50mL LB液体培养基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入 O. ImLytxH-EHA 105 菌液，28°C下 220rpm 振荡培养 16h 左右，室温下 4000 Xg 离心 lOmin， 弃上清液，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100 μ mol/L)悬浮，稀释到原体积的5_20 倍，在28°C下220rpm振荡培养lh，使菌液的OD6tltl达0. 5左右。4)共培养把预培养2d的下胚轴放入菌液中浸染lmin，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，用封口膜封好培养皿，25 °C左右，于暗处共培养约2d(暗培养)。5)诱导培养把共培养2d的下胚轴放到诱导培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25°C左右光照培养，每2周继代I次，直至长出膨大的愈伤组织。6)选择培养把膨大的愈伤组织转移到到筛选培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25°C左右光照培养，每2周继代I次，直至长出苗。7)生根培养当幼芽长到l-2cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养基上 (1/2MS+NAA O. 5mg/L+Kan 25mg/L)进行生根培养。在抗生素筛选条件下，约87%的芽在2 周后形成根。8)炼苗和移栽生根后的幼苗长到5-6cm高时，半敞开培养瓶盖子，进行炼苗；待幼苗适应外界环境以后，转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养，并用1/2MS培养液浇灌。当幼苗生长至7-9cm 时，将幼苗移植到泥土中生长，然后再进行下一步实验。(二)含ytxH基因(DR0105)序列转基因油菜的耐盐性鉴定实验I、实验目的鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对盐胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行耐盐性鉴定。2、实验方法采用不同的NaCl 浓度(0、50、100、150、200、250 和 300mmol. L-1NaCl)分别对转基因油菜植株和非转基因油菜植株进行生长情况的观察。3、实验结果在没有NaCl处理的情况下，转基因油菜和非转基因油菜的生长状况没有明显的
差异;在添加50mmol. T1NaCl的情况下，非转基因油菜仍然能保持生长，但生长的速率比转基因油菜要缓慢一些。表明低盐条件下，野生型植株生长已明显受到抑制；当NaCl的浓度增加到100和150mmol. L—1时，非转基因的油菜叶片最初变黄、接着叶片逐渐萎蔫，20d后全部死亡；当NaCl浓度为200mmol. Γ1时，非转基因的油菜叶片迅速发黄、叶片萎焉，幼叶几乎停止生长，并向叶背面翻卷，由原来的绿色变浅绿，大约在15d后死亡；当NaCl浓度增加到250和300mmol. L—1，非转基因油菜苗均在2d内开始发黄，7_8d 后几乎全部死亡，而转基因油菜均能够存活5周以上。从图5可知转基因油菜可在300mmol. Γ1的NaCl培养基上正常生长，非转基因油菜在300mmol. Γ1的NaCl培养基上干枯死亡。结果证明，该基因对盐的胁迫确有抗性。而在上述各种NaCl浓度下，转入ytxH基因(DR0105)的油菜均能正常生长。上述实验结果见表I :表I转基因油菜和非转基因油菜对盐胁迫的比较
权利要求
1.Deinococcus radiodurans RlytxH 基因(DRO105, GeneID :1799501)培育耐盐植物的用途。
2.含Deinococcus radiodurans RlytxH 基因的重组质粒。
3.含有D.radiodurans RlytxH基因的重组工程菌株。
4.含Deinococcusradiodurans RlytxH基因的重组质粒培育耐盐植物的用途。
5.权利要求4所述的用途，所述重组质粒是能在大肠杆菌表达的质粒。
6.权利要求4所述的用途，所述重组质粒是能在植物中表达的质粒。
7.权利要求4所述的用途，所述重组质粒转化的宿主细胞培育耐盐植物的用途。
8.权利要求7所述的用途，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
9.权利要求I或4所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的ytxH基因(DR0105)具有提高原核生物及植物的抗逆能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证实，ytxH基因(DR0105)能够提高原核生物耐盐的能力；将该基因转入植物后获得的转基因植物也具有耐盐的能力。
文档编号C12N15/31GK102586283SQ201210046539
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者张维, 林敏 , 江世杰, 王劲, 赵鹏, 陈明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所