一种植物盐诱导表达启动子POsSalt1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种植物盐诱导表达启动子POsSalt1及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子仅在受到盐胁迫时特异性的启动外源基因在植物中表达，因此可以在植物抗盐基因工程改良中具有一定应用前景。
【专利说明】-种植物盐诱导表达启动子POsSaltl及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种植物 盐诱导基因表达启动子及其应用，在植物抗盐基因工程改良中可通过替代组成型启动子， 在保证所驱动抗盐基因在盐胁迫时正常发挥功能的同时避免在非盐胁迫情况下不必要的 表达。
【背景技术】
[0002] 盐害是最重要的植物逆境之一，盐胁迫造成的影响几乎涉及植物所有的生理和生 化过程，严重时导致植物不能正常生长、减产甚至绝收。水稻是全世界第二大粮食作物，年 种植面积20亿亩左右，全世界大约有1/3的人以稻米为主食。水稻在我国是第一大粮食作 物，我国年种植面积为全国粮食播种面积的1/3,而水稻产量占全国粮食总产量的44%。从 我国水资源、气候以及生态等方面看，除现有的稻区外，我国还有一些地区很适宜于水稻生 产，但由于土壤的盐渍化而未能种植。因此培育耐盐水稻品种提高水稻的耐盐能力是提高 盐碱地的利用率和经济效益，缓解世界粮食危机的最佳方案之一。
[0003] 随着分子生物学技术以及植物基因工程的迅速发展，利用转基因技术来改变一些 作物的性状，提高其对外界胁迫条件的耐受性从而增加作物的产量已经成为一种重要的技 术。外源基因在转基因植物中低水平表达和非特异性表达是制约植物基因工程发展的一个 重要因素，主要原因是缺少理想的启动子。
[0004] 组织特异启动子由于其表达的空间特异性，可将外源基因在转基因植物中定位表 达，这不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，而且还能提高外源基因产物在 特定部位的浓度，增加转基因的效果。与组成型表达启动子相比，诱导型启动子驱动的外 源只在特定的环境或者组织中才高强度表达，因此可以根据实验需要来控制目的基因的时 空表达。Kazuo等人在水稻中过表达0SNAC6基因，利用组成型启动子导致水稻生长延迟产 量降低，但是利用其本身的启动子就可以解决这个问题。Aryadee等在烟草中利用启动子 Rabl6A表达自身基因，发现只有在胁迫条件下该基因才能在叶中大量表达，从而提商其抗 逆性，而且转基因植株与对照相比其形态发育以及产量都没有受到影响。因此，诱导型表达 启动子在植物抗逆基因工程中亟待开放应用。
[0005] 综上所述，在植物中，合理使用盐诱导特异性启动子能明显改善植物性状，但应用 于水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源根特异性启动子依然 较少，因此发展更多的水稻等禾谷类作物的盐诱导特异性启动子对基础研究和生产应用都 具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种驱动外源基因在盐诱导条件下表达的启动子、获得含有 该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的"植物"是指单子叶植 物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0007] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物盐诱导表达启动子，所述植物盐 诱导表达启动子包含序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No: 1所示的 DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的水稻盐诱导表达启动子， 本文中称为POsSaltl或启动子POsSaltl。本发明的发明人发现日本晴水稻中的一段DNA 序列能够起到驱动特定基因在盐诱导的情况下特异性表达的作用，因此提取出了该DNA序 列并加以验证。
[0008] 优选地，本发明提供的植物盐诱导表达启动子的DNA序列为SEQ IDNo:l所示的序 列，即POsSaltl或启动子POsSaltl。
[0009] 另一方面，本发明还提供一种包含上述植物盐诱导表达启动子POsSaltl的表达 盒。
[0010] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的 植物盐诱导表达启动子POsSaltl，在所述重组表达载体中，所述植物盐诱导表达启动 子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组 表达载体为pCAMBIA1391-P0sSaltl，该重组表达载体为将SEQ ID No:l所示的序列即 POsSaltl或启动子POsSaltl构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为 pCAMBIA1391-P0sSaltl〇 toon] 另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物盐 诱导表达启动子POsSaltl、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌 农杆菌。
[0012] 另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物盐诱 导表达启动子POsSaltl、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子 优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
[0013] 再一方面，本发明提供上述植物盐诱导表达启动子POsSaltl在培育转基因植物 中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物盐诱导表达启动子连接于载体的待表达 的基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体， 将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0014] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如 水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
[0015] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No :1中相同）：
[0016] GGGGTGAA 6A GAAA CGCTGGGG GAGAGAGGGAAGGAGGGAGGAGGAAGAAGGGAAGCCGG GAAGGAGCTAGAGGGAGGATGACATGTGGGTCTCACATATCAATGGATCCCACAATATAATTTTTTGTGTGAGTGAC ATGTAGGTCCTACCTTTTTTTTATTTTTATTCTAATGCCACATAAGCGCCACGTAGAACAAAGACTTGGTCAATACC GCCACGTAGGCGCCACGTCAGCTAAAATCACCGAGGGATATAATTTGCACCGGTTTTGATAGTTGGAGGAGTCAATT TACCTGGTTTTGTGGTTAAAGGATATGAATCATACTCGGAGCTATAGTTGAGGGAGTCAAAGTATATTTTTCCATCC CAATTGTCCCACCCACCTGATACTACCATCACGCGACGCGACGCCCCACGGCCGGCGGCGGCGCGAATCGCCTACCG CCCGCTGCACAGGGGCACTAGACACACATGGGCTGATGGGCACATGACTTAGCCCAGCATTCTCGCTTACATATCTT ATGTTGTTTTTTTTATTAAGACGTGGATTTTACCAAGGATTTTATTAGTATGTTTTCTAAACCGCTAAACAATATGT TTTTCAAAAAATTATATAAAAATAATTTTAAAATATCAAATAAATTTATTTTTAAGTTTGTAACAATTAAAACTTAA TTAATCATGTGACTTTTTCATTTTACGTATGCTAACTTAATCTATATCCAACTCTATTTTAATTATATGTTAATGGC TTTTTTATTTTAGGTAGACTATCTTAATCTTCGTCCAACTCTATTTTTTAATTTTTAAGTTTGTAATAATACTGCCC AACACGGCCAGGATGAAGCGTCGATCTGAATTTCTTTTTCAATTTTGAGGGCACTCTCCTTCTAGAGACACTCCCTT ATGAACGGAGCATCGAATTTGGGATTGTGGCAAATGGCAATGCACCGTTGCTGTGCACAGGTGCCGGCCGGGCGCGC TTACACGGCTACACCTAACACGCCTACACTCTTTTTTCTCATCAGTCATCAGAATACTTACACGTTTACATTTGTGC TTTTGACAATCCTAGTAGGTTATAATTAGTACTAAGTGCTTAGCCGATGAACGAAATGATGACCAACACCACCGACA CACCACCAAAACTCTTGTATGGATGTTTTTCTGTTGTTTGCATATCATTTAAATAGTTACAAATAAATTAATAAAAA CTAGAAGATATATTAATATGTGATATATCACTTCATAAACACGTAACTTAACATTTAATTTCTACTTGTAAGTTTAA TTTATTTTTTGTTGTCATATACAGAAGTTAAATTTTAAGTTGTATGTTTGTAGAGTGATATATCACATGTTAATATA TTTTTTAAAAGCTTTTTATAACTATTTGAGTAGTATGCAAGTAAGGAGTGGAAGTAAGGAGTGGACGTTCAAAACTA GTACTCGCTAAACTAGTCGAGATCTCTTTTTCTCTACCGCTGCGCAACAACATTTGATTGAACCATCTTACGATGCT TTTTCTCAGGCTCATGCAGCCATGCTTGGATGCTTGCGTTGTTGAGACTTGAGAGCACGGCACGTATGCGAACTTGA TCAGGTAGGTCGTCACAAACGCGGCGCGCGTCGACGAGAGGCCGAGACAACCACCCACCCACTAGCGCGCGCACCGA GCGAGCTATCTCTCCGCTCGGTCTCGGTCGATCGCCGCGCGCGCGCGTGGCCGAGCTTGCACGGCGCCATTGGCCGA CGCGAGCCGGTGAGGCGATAGTGCTCGCTCCACCACTCTCCCCGACCATCATGGGGGTGTCACCTCACCTGCTACGC CTGTATATATATAAAGCACCAGCAGCCATGAAGCCCATCAACGAAAAACTACGTGACAGCGTGACACAGGGGGTAGT TAATTACTAGTTATTCGCAG TGCGTGCGT GTGTGTGTGTGA G
[0017] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列 "(707(707,⑶为获得启动子过程中使用的正向弓丨物的留存序列， 共计22bp ;序列末尾以斜体并加粗表示的序列"Γ6Τ6Τ6Τ6Τ6Τ(；7'6Τ6?6Τ61?；"为获 得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补）， 共计22bp ;该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是， 本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的 DNA序列。
[0018] 综上所述，本发明的发明人发现日本晴水稻中的一段DNA序列能够起到驱 动特定基因在盐诱导的情况下特异性表达的作用，并从日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)中分离克隆L0C_0s04g33920. 1基因上游包括转录起始位点在内的1950bp 的DNA序列，并将其命名为POsSaltl (序列表中的SEQ ID No: 1)。将该序列经酶切后连接 到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重 组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基 因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在盐诱导处理后，整 体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1950bp的序列具有驱动基因表达 的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻盐诱导处理后表达。
[0019] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在盐 诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达 量，增加转基因的效果。
[0020] 技术效果
[0021] 本发明所克隆的水稻启动子POsSaltl能够调控基因在植株中集中表达，在实际 应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目 标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生长特性和机制，代替35S等组成型启动子。 可以在保证所驱动抗盐基因在盐胁迫时正常发挥功能的同时避免在非盐胁迫情况下不必 要的表达，从而培育出实用有效的抗盐植物品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0023] 图1为将POsSaltl启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中 A 为 pCAMBIA1391 示意图，B 为 pCAMBIA1391-P0sSaltl 示意图，其中示出 了利用 POsSaltl 启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；
[0024] 图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
[0025] 图3为盐诱导处理图片，将萌发7天后的POsSaltl : :gus转基因幼苗，在200mM NaCl溶液中处理24小时，模拟盐处理，同时以水处理为对照。图中NT为对照，Salt是200mM NaCl处理24小时后的染色结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0027] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0028] 含有酶切位点的POsSaltl启动子的获得
[0029] 步骤1、引物的设计
[0030] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组序 列，依据水稻POsSaltl基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0031] 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA，公开使用载 体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例， 靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No: 2)5'端带PstI，酶切位点 (CTGCAG)，反向引物（SEQIDNo:3)5,端带EcoRI，酶切位点（GAATTC)，引物序列如下：
[0032] 正向引物：CTGCAGGGGGTGAAGAGAAACGCTGGGG PstI
[0033] 反向引物：GAATTCCTCACACACACACACGCACGCA EcoRI
[0034] 由深圳华大基因公司合成。
[0035] 步骤2、启动子POsSaltl的获得
[0036] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POsSal11，按 常规PCR体系，采用如下扩增程序：
[0037] 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，循环 35 次；最 后 72°C延伸 10min。
[0038] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1950bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体 (购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue 感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经 菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用PstI和EcoRI进行双酶切验证， 如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所 要获得的启动子POsSaltl，其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0039] 植物表达载体的构建和农杆菌的转化
[0040] 从上面"启动子POsSaltl的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用PstI 和EcoRI双酶切，回收启动子POsSaltl片段。同时利用PstI和EcoRI对pCAMBIA1391 进行线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的POsSaltl片段和pCAMBIA1391片段用T4 连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子POsSaltl与Gus基因融合的植物 表达载体pCAMBIA1391-P0sSaltl (图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监 督检验测试中心水稻组保存）。
[0041] 利用启动子POsSaltl驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0042] 步骤1 :农杆菌介导的水稻遗传转化
[0043] 成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有1滴Tween20 的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯 酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子 的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及 胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3?5天后用于农杆菌 转化。
[0044] 采用上述"植物表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载 体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得POsSaltl : :gus转基因水稻植株该 遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai, et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant Cell Report,2012. D0I10. 1007/s00299-012-1275-3.) 等提出的方法。
[0045] 步骤2、甘露醇模拟的盐胁迫处理
[0046] 以萌发7天后的POsSaltl : :gus转基因水稻植株为材料，置于200mM NaCl溶液 中24小时盐处理后，取全株染色；同时将材料置于水中为对照。
[0047] 步骤3、⑶S组织化学染色
[0048] 参照 Jefferson (Jefferson RA 等人· GUS fusion : β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J]. ΕΜΒ0 J. ,1987, 6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37°C染色24 小时。脱色时在37°C条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。
[0049] ⑶S组织染色结果显示，在盐诱导条件处理24小时后，NaCl处理的POsSaltl :: gus转基因水稻植株经⑶S染色后呈现蓝色，而未处理的对照植株无染色。结果说明，在盐 胁迫诱导条件下，启动子POsSaltl能够驱动Gus基因在水稻植株中高水平表达，结果见图 3,图中左侧为未处理的植株、右侧为盐诱导胁迫下的植株。
[0050] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【权利要求】
1. 一种植物盐诱导表达启动子POsSaltl，其特征在于，所述植物盐诱导表达启动子 POsSaltl包含SEQ ID No: 1所示的DNA序列。
2. 根据权利要求1所述的植物盐诱导表达启动子，其特征在于，所述植物盐诱导表达 启动子POsSaltl的DNA序列为SEQ ID No: 1所示的序列。
3. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1-2中任意一项所述的植物盐 诱导表达启动子POsSaltl。
4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项 所述的植物盐诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物盐诱导表达启动子连接 于载体中待表达的基因序列的上游； 优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-P0sSaltl， 其中PCAMBIA1391为植物双元表达载体。
5. -种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1-2中任意一项所述的植物盐 诱导表达启动子POsSaltl、权利要求3所述的表达盒、或根据权利要求4所述的重组表达载 体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。
6. -种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物盐 诱导表达启动子POsSaltl、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载 体。
7. -种根据权利要求1-2中任意一项所述的植物盐诱导表达启动子POsSaltl在培育 转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1-3中任意一项所述的 植物盐诱导表达启动子POsSaltl连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表 达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植 物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
【文档编号】C12N15/113GK104046629SQ201410325516
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】秦瑞英, 杨剑波, 李莉, 李 浩, 马卉, 魏鹏程, 杨亚春, 许蓉芳 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所