专利名称：功能性植物、为培育该功能性植物而使用的启动子及其应用方法
技术领域：
本发明涉及功能性植物、为培育该功能性植物而使用的启动子及其应用方法。更具体地说，本发明涉及利用cDNA文库的数据库来获得特异性启动子，由此培育功能性植物的方法。
背景技术：
在基因工程发展过程中，开发出了各种培育转基因植物的方法。在转基因植物中，为了使特定的基因特异性地表达，需要将用于促进表达的启动子这样的遗传元件与该特定的基因可操作地连接，再通过转化等将上述连接形成的混合物导入植物中。
调节植物中的基因表达的启动子是植物遗传工程的必须元件。植物中被选择用作基因表达的启动子有多种(BENFEY P N；REN L；CHUAN-H，EMBO J，9(6).1990.1685-1696.，1990)。可以根据本领域公知的方法来鉴定启动子区。简单地说，构建将启动子区的候选序列与报道基因(例如GUS基因)可操作地连接而形成表达盒。使用构建的表达盒转化适当的植物细胞，再将转化细胞再分化为植物。利用适当的检测系统(例如色素染色)检测转化植物中报道基因的表达。根据检测结果，可以确认启动子区及其表达特性。
细胞(例如植物细胞)中，为了使基因表达，该基因必须与通常细胞中由某种酶识别的启动子进行可操作地连接。被称为启动子或者转录调节区、通常存在于基因5’非编码区(即紧邻编码区的5’区)的区域起始用于生成mRNA转录产物的基因转录。接着mRNA在细胞的核糖体中进行翻译，以获得编码的多肽，具有代表性的启动子含有约500-1500个碱基，在其控制下，基因得以进行受到控制的表达。转基因植物中的异源基因或基因的所选择的序列表达时，具代表性的是要使用组成型启动子，即，使用总是且在整个植物的几乎所有组织中诱导产物的表达的启动子。
为了使植物中所选择的基因表达，采用了来自病毒的启动子。具有上述启动子的已知病毒基因的例子有病毒花椰菜花叶病毒家族(一组双链DNA病毒)，还有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S(Balazs等人，1982；Guilley等人，1982；Odell等人，1985；Odell等人，1987；Odell等人，1988；Tommerup等人，1990；Jefferson等人，1987a；Jefferson等人，1987b)和CaMV 19S的启动子(Fraley等人，1994)、以及玄参花叶病毒(FMV)(Rogers，1995)的启动子。
目前已鉴定和分离了由细菌源得到的、用于调节植物中的基因表达的启动子，例如来自农杆菌(Agrobacterium)的启动子。这样的启动子的例子有来自农杆菌T-DNA胭脂碱合成酶(nos)基因的启动子，还有胭脂碱合成酶(nos)启动子(Rogers，1991)、章鱼碱合成酶(ocs)启动子(Leisner和Gelvin，1998)和麦根酸合成酶(mannopinesynthase，mas)启动子。
CaMV35S启动子在高效表达系统中也有很多弊病。组成型高效表达、即在所有组织中总是持续地大量生产基因产物，这使得植物个体内部有限的代谢产物不必要地在无用的组织中浪费，结果有可能导致繁殖量的降低和产量的减少。组成型高效表达使得基因产物在可利用的部位蓄积，对此，可能增加消费者的疑虑，另外组成型高效表达有可能诱导植物体内的沉默结构。
并且，只要是提供组成型表达的有效的植物启动子(来自植物源的启动子)，几乎均不为人所知。仅有的例子是hsp80——来自花椰菜的热休克蛋白80(Brunke和Wilson，1993)和番茄泛素蛋白(tomato ubiquitin protein)的启动子(Picton等人，1993)。这些启动子可在转化的植物组织中用于诱导异源核酸序列的组成型表达，但与CaMV 35S启动子同样，组成型高效表达、即在所有组织中总是持续地大量生产基因产物，这使得植物个体内部有限的代谢产物不必要地在无用的组织中浪费，结果有可能导致繁殖量的降低和产量的减少。组成型高效表达使得基因产物在可利用的部位蓄积，对此，可能增加消费者的疑虑，另外组成型高效表达有可能诱导植物体内的沉默结构。
因此，现有的启动子难以培育可实现所需功能的表达的转基因植物。
(发明所要解决的问题)从而，本发明以培育功能性植物为课题，特别是以构建用于使所需的基因在所需的植物部位任意表达的系统为课题。
附图简述
图1表示同源性检索结果被视为属于同一组的序列的一个例子。大部分EST序列数据都是DNA测序仪的原始数据。排除DNA测序仪的误差，同源性检索结果多，将克隆进行比较，然后设计引物以进行引物步移。方框圈起的部分和*表示所有克隆中的相同序列。一表示缺失。“原始克隆”表示数据库的参照克隆。“检索结果”表示同源性检索结果。“共有”表示共有序列。“设计引物”表示设计的引物。
图2表示分离转录控制区的方法概要。
图3是表示根中GFP基因的表达的图。上部分为可见光下的照片，下部分表示激励光照射下GFP的荧光发光。WT表示野生型，0082表示属于EB0082_2的克隆，1583表示属于RA1583_1的克隆，50060表示属于CG0060_1的克隆。
图4表示叶中GFP基因的表达。上部分为可见光下的照片，下部分表示激励光照射下GFP的荧光发光。WT表示野生型，0082表示属于EB0082_2的克隆，1583表示属于RA1583_1的克隆，50060表示属于CG0060_1的克隆。
图5表示米粒中GFP基因的表达。上部分为可见光下的照片，下部分表示激励光照射下GFP的荧光发光。WT表示野生型，0082表示属于EB0082_2的克隆，1583表示属于RA1583_1的克隆，50060表示属于CG0060_1的克隆。
图6表示以由生长的愈伤组织提取的DNA为模板进行PCR，检测HPT基因(上侧箭头位置)的有无。是表示GPT基因导入水稻愈伤组织的图。左端表示尺寸标记，各泳道是以由分别导入了下述载体的愈伤组织提取的DNA为模板，在生成1.1kb的HPT基因特异性扩增产物的条件下进行PCR泳道1-3是以由没有基因导入的愈伤组织提取的DNA为模板，泳道4-6是由CaM35S启动子驱动HPT基因的载体，泳道7-9由来自属于RA1583_1的克隆的来自RA1583_1启动子驱动HPT基因的载体，泳道10-12是由来自属于CG0060_1的克隆的来自CG0060_1启动子驱动HPT基因的载体。13和14作为阳性对照，以HPT基因片段和pTH1质粒为模板。15表示作为阴性对照的DNA提取中使用的缓冲液；16表示分别以灭菌水为模板进行PCR。上部分的箭头表示预想的HPT基因扩增产物的尺寸。15和16中未出现扩增产物。
图7是表示添加潮霉素前后各愈伤组织的生长的照片。A和B是来自RA1583_1的克隆的启动子区，C和D是来自CG0060_1的克隆的启动子区，E和F是具有通过作为阳性对照使用的CaMV35S启动子驱动HPT基因的结构的载体，G和H是使用野生型的结果。A、C、E和G表示使愈伤组织在潮霉素存在下生长的结果，B、D、F和H表示生长前的结果。
(序列表的说明)SEQ ID No.1是来自CG0060_1的克隆的启动子区。
SEQ ID No.2是来自EB0082_2的克隆的启动子区。
SEQ ID No.3是来自RA1583_1的克隆的启动子区。
SEQ ID No.4是GenomeWalker的适配子引物(adapter primers)。
SEQ ID No.5是实施例4的含有部分适配子引物序列和限制酶识别序列的引物。
SEQ ID No.6是实施例4的含有翻译起始点前的序列和限制酶识别序列的引物。
SEQ ID No.7是在合有来自CG0060_1的克隆的启动子区的两端添加了限制酶识别序列的启动子盒。
SEQ ID No.8是在实施例5中使用的、含有水稻基因组序列的一部分和限制酶识别序列的引物。
SEQ ID No.9是在实施例5中使用的、含有翻译起始点稍前的序列和限制酶识别序列的引物。
SEQ ID No.10是含有来自EB0082_2的克隆的启动子区的、在两端添加了限制酶识别序列的启动子盒。
SEQ ID No.11是在实施例6中使用的、含有翻译起始点稍前的序列和限制酶识别序列的引物。
SEQ ID No.12是含有来自RA1583_1的克隆的启动子区的、在两端添加了限制酶识别序列的启动子盒。
发明内容
本发明着眼于cDNA文库数据库中的表达频率，分离具有所需表达频率的基因中所含的启动子，通过与所需的基因一起利用其启动子，来培育在希望的部位表达所需基因产物的功能性植物，从而解决了上述课题。
因此，本发明提供下述内容。
1.植物，该植物包含至少一个进行特异性表达的启动子和与该启动子可操作地连接的基因，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
2.项目1的植物，其中上述基因的表达是组成型表达。
3.项目1的植物，其中上述基因在叶中特异性表达。
4.项目1的植物，其中上述基因在愈伤组织中特异性表达。
5.项目1的植物，该植物为水稻。
6.项目1的植物，其中上述基因是抗病基因或抗虫基因。
7.项目1的植物，其中上述基因是选自维生素合成基因、糖合成基因、脂质合成基因、聚酮合成基因、光学合成类基因、功能性成分合成基因和转录因子的基因。
8.启动子，该启动子进行特异性表达，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
9.项目8的启动子，所述启动子不驱动果实中基因的表达。
10.项目8的启动子，所述启动子特异性驱动叶中基因的表达。
11.项目8的启动子，所述启动子特异性驱动愈伤组织中基因的表达。
12.表达盒，该表达盒含有进行特异性表达的启动子，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
13.项目12的表达盒，该表达盒驱动组成型基因的表达。
14.项目12的表达盒，该表达盒特异性驱动叶中基因的表达。
15.项目12的表达盒，该表达盒特异性驱动愈伤组织中基因的表达。
16.植物的可利用部位，该植物的可利用部位由包含至少一个进行特异性表达的启动子和与该启动子可操作地连接的基因的植物获得，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定。
17.项目16的可利用部位，该可利用部位是叶、茎或果实。
18.生产所需基因产物的方法，该方法包括确定启动子的特异性的步骤，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定；将该启动子与编码该所需基因产物的核酸分子进行可操作的连接，制备连接混合物的步骤；将该连接混合物导入植物的步骤；使该植物生长的步骤；以及收集该植物中的该所需基因产物的步骤。
19.培育特异性表达所需基因产物的植物的方法，该方法包括确定启动子的特异性的步骤，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定；将该启动子与编码该所需基因产物的核酸分子进行可操作地连接，制备连接混合物的步骤；将该连接混合物导入植物的步骤；使该植物生长的步骤。
20.项目19的方法，其中上述启动子的特异性通过DNA芯片分析来确定。
21.基因产物，该基因产物由植物获得，所述植物是通过项目19的方法而获得的。
发明的实施方式以下详细说明本发明。本说明书中，如无特别说明，可将单数形式的冠词(例如英语中的“a”、“an”、“the”等，德语中的“ein”、“der”、“das”、“die”等及其变格，法语中的“un”、“une”、“le”、“la”等，西班牙语中的“un”、“una”、“el”、“la”等，其他语言中与此相对应的冠词、形容词等)理解为也包括其复数形式的概念。另外，如无特别说明，可理解为本说明书中所使用的术语是以该领域通常采用的含义来使用。
本说明书中使用的“功能性植物”是指某种植物的某种功能比天然状态的功能有明显(优选统计学意义上的显著)变化(例如增加、增强、减少、消失等)的植物。这里，植物的“功能”是指植物的生理作用。
本说明书中使用的“启动子”是决定基因转录的起始位点，并且直接调节其频率的DNA上的区域域，是RNA聚合酶结合并起始转录的碱基序列。
本说明书中，“启动子区”是指某种结构基因序列附近、具有启动子活性的区域域。“推定(deduced)启动子区”是指某种结构基因序列附近、被认为具有启动子活性的区域域。推定启动子区多是推定为基因转录起始时RNA聚合酶所结合的基因上游碱基序列、推定蛋白质编码区的第1外显子上游约2kbp以内的区域域，因此，如果使用DNA分析软件预测基因组碱基序列中的蛋白质编码区，则可推定出启动子区。推定启动子区随每种结构基因而变动，但通常位于结构基因的上游，不过并不限于此，也可以位于结构基因的下游。优选推定启动子区存在于第一外显子翻译起始点的上游约2kbp以内。
含有至少连续10个本发明的启动子序列中的核苷酸序列的核酸分子可具有与本发明的启动子相同或相似的活性。所述活性可通过使用葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、萤光素酶基因或绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报道基因进行测定(assay)、生物化学或细胞组织学鉴定来确认。所述测定属于本领域的常用技术(Maliga等人.，Methods inPlant Molecular BiologyA labortory course.Cold SpringHarbor Laboratory Press(1995)；Jefferson，Plant Molec.Biol.Reporter 5387(1987)；Ow等人.，Science 234856(1986)；Sheen等人.，Plant J.8777-784(1995))，本领域人员不会有任何困难地即可验证含有至少连续10个本发明的启动子序列中的核苷酸序列的核酸分子可具有与本发明的启动子相同或相似或基本同等或以上的活性。本说明书中，如果在上述测定中判定在检测误差范围内具有相同的启动子活性，则称为具有基本同等或以上的启动子活性。
本发明的启动子的长度通常为10个核苷酸或以上，可优选为20个核苷酸或以上、30个核苷酸或以上、40个核苷酸或以上、50个核苷酸或以上、60个核苷酸或以上、70个核苷酸或以上、80个核苷酸或以上、90个核苷酸或以上、100个核苷酸或以上、150个核苷酸或以上、200个核苷酸或以上、300个核苷酸或以上的长度。
本发明的启动子可以与现有的启动子(例如最小启动子(由来自35S启动子的约80个碱基对构成的启动子)(Hatton等人.，Plant J.，7859-876(1995)；Rouster等人.，Plant J.，15435-440(1998)；Washida等人.，Plant Mol.Biol.，401-12(1999))等)连接使用。此时，即使是原来不显示组织特异性或显示微弱的特异性、或者显示其它特异性的启动子，通过添加本发明的启动子或其片段，也可以制备在根和/或茎尖强烈发挥组织特异性功能的启动子(Hatton等人.，Plant J.，7859-876(1995)；Rouster等人.，Plant J.，15435-440(1998)；Washida等人.，Plant Mol.Biol.，401-12(1999))。
本说明书中使用的“植物”是属于植物界的生物的总称，代表性地指具有生成细胞壁、叶绿素同化作用的有花植物。“植物”包括单子叶植物也包括双子叶植物。优选的植物例如有小麦、玉米、水稻、大麦、高粱等属于禾本科单子叶植物。除优选植物外，例如还有烟草、青椒、茄子、甜瓜、西红柿、甘薯、卷心菜、葱、嫩茎花椰菜、胡萝卜、黄瓜、柑橘类、白菜、生菜、桃、马铃薯和苹果。优选的植物并不限于作物，也包括花、树木、草、杂草等。如未另外注明，植物也指植物体、植物器官、植物组织、植物细胞和种子等任意部分。植物器官的例子有根、叶、茎和花等。植物细胞的例子有愈伤组织和悬浮培养细胞。
本说明书中使用的植物的“可利用部位”是植物的一部分，是指生物摄取该植物时，该生物可摄取的部分。生物为人、植物为水稻时，“可利用部位”也称为“可食用部分”，通常的可利用部分包括米粒。所食用的米粒中的胚乳作为白米，可称为水稻中的可食用部位。米粒是指水稻种子的构成要素——颖、胚、胚乳、种皮中的胚和胚乳。生物为牛、植物为水稻时，通常可利用部位是指除根以外的整个植物体。本说明书中的“果实”是指子房发育形成的器官，果实内，受精胚珠发育形成种子(禾本科中特称为颖果)。本说明书中的“种子”是指胚珠发育形成的普遍性的传播体，由胚、胚乳和种皮构成。
本说明书中，“基因”是指遗传的功能性单位，通常占据染色体上的特定位点(基因座)。基因通常可以在细胞分裂中进行正确的自我复制，控制酶等其它蛋白质的合成。作为功能单位的基因，由DNA大分子的非连续性的分段构成，该DNA分子包含编码特定肽的氨基酸序列的正确碱基序列(A、T、G和C)。基因通常由DNA承载信息，但也有由RNA承载的。如上所述，通常基因存在于染色体中，所有的染色体除了例如男人的性染色体(X和Y)之外，都是成对的，因此除了配子之外，基因通常成对地存在于所有的细胞中，在植物中也同样。除编码蛋白质的区域域(外显子)之外，基因通常包括存在于外显子之间的内含子、第1外显子上游的表达控制区(启动子区)、蛋白质编码区的下游区。
本说明书中，基因“特异性表达”是指该基因在植物的特定部位或时期以与其他部位或时期不同(优选高)的水平表达。特异性表达可以只在某一部位(特异性部位)表达，也可以在除此之外的部位表达。优选特异性表达只在某一部位表达。
本说明书中，“可操作地连接”是指所需序列的表达(操作)置于某个转录控制序列(例如启动子)或翻译控制序列的控制下。启动子为了与基因可操作地连接，通常在该基因的刚刚上游处配置启动子，但也未必一定要相邻。因此此时，“该启动子与该基因可操作地连接”只要是该启动子可控制该基因的表达，则可以是任何的相对的位置关系。
本说明书中，基因在植物中表达时，通常“部位特异性”是指该基因在植物的部位(例如根、茎、干、叶、花、种子、胚芽、胚、果实等)中的表达特异性。“时期特异性”是指该基因根据植物生长阶段(例如发芽后的出芽天数)的表达特异性。“应激应答性”是指对于给与植物的至少一种应激，该基因的表达发生变化。
本说明书中使用的“cDNA数据库”是指由植物组织中提取mRNA，由mRNA合成cDNA，进行大规模克隆，确定序列，将确定了序列的cDNA形成数据库。在水稻基因组计划中，为分别从苄基腺嘌呤处理的愈伤组织、赤霉素处理的愈伤组织、热休克处理的愈伤组织、繁殖期的愈伤组织、幼根、幼绿叶、幼黄化叶、开花期的穗提取mRNA，构建了来自mRNA的cDNA文库，随机地确定了碱基序列形成的数据库。cDNA数据库中的表达频率是通过计算所用样品的个数中实际表达的个数的比例来算出。cDNA数据库例如有基于像水稻基因组计划这样的基因组计划中所发表的数据库而制成的数据库。
根据表达频率确定的启动子的特异性依赖于含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率。因此本发明中使用的启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率来确定。
这样，根据本发明的说明，本领域人员都可以对所需基因赋予所需表达特性，可以培育出使所需基因具有所需特异性并表达的植物。
本说明书中，导入的基因“不表达”是指该基因完全不表达，或以对该导入了基因的宿主基本上不产生影响的程度表达。以基本上不产生影响的程度表达的代表性例子有例如以政府机关规定的标准或以下表达。
本说明书中，某种因子“驱动”(drive)基因的表达是指通过该基因处于该因子的控制下，促进了该基因的表达。某种因子“不驱动”基因的表达，则是指该基因即使处于该因子的控制下，也完全不促进该基因的表达，或以对该导入了基因的宿主基本上不产生影响的程度促进表达。某种因子不驱动基因的表达时，该基因例如可以以政府机关规定的标准或以下进行表达。
本发明的启动子也可以使用与其序列相似的序列。这样的序列可通过FASTA等序列比对程序确定同源性进行选择，还可以通过杂交来选择。
本说明书中，用于杂交的“严谨的条件”是指对于目标序列，具有同源性的核苷酸链的互补链优先与目标序列杂交，并且不具同源性的核苷酸链的互补链基本上不杂交的条件。某个核酸序列的“互补链”是指根据核酸的碱基之间的氢键而对应的核酸序列(例如A对T、G对C)。严谨的条件与序列有关，在各种状况下均不同。更长的序列则在更高的温度下特异性地杂交。通常，严谨的条件选择在规定的离子强度和pH下对特定的序列比其熔解温度(Tm)低约5℃。Tm是在规定的离子强度、pH和核酸浓度下，50％的与目标序列互补的核苷酸以平衡的状态与目标序列杂交的温度。“严谨的条件”与序列有关，根据各种环境参数而不同。核酸杂交的一般性指南在Tijssen(1993)、Laboratory Technniques In Biochemistry And MolecularBiology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第2章“Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assay”、Elsaevier，New York中有说明。
通常的分子生物学方法可参考Ausubel F.A.等人编(1988)、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley、New York、NY；Sambrook J等人(1987)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY等，本领域人员可容易地实施。
代表性的严谨的条件是盐浓度小于约1.0M Na+，更具代表性的是pH7.0-8.3、约0.01-1.0M的Na+浓度(或其它盐)；关于温度，短核苷酸(例如10-15个核苷酸)则至少约30℃，长核苷酸(例如比50个核苷酸长)则至少约60℃。严谨的条件还可通过添加甲酰胺这样的非稳定剂(unstabilizer)来实现。本说明书中的严谨的条件例如有在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(37℃)的缓冲溶液中的杂交，以及用0.1×SSC在60℃洗涤。
“应激”是指对植物施加物理性、化学性、生物学性的妨碍植物正常生长的因子。应激例如有物理性应激(光、热、冷却、冷冻、紫外线、X射线、切断、摩擦等)，化学性应激(氧应激、化学物质、生理活性物质等)、生物学性应激(病毒、病原体(例如稻瘟病菌)感染等)等。因此本发明的启动子也包括在经受这些应激时特异性表达的启动子。
本说明书中，本发明的启动子的表达为“组成型”，这是指在植物的所有组织中、在该植物生长的幼年期和成熟期的任意阶段都以大致定量来表达的性质。具体来说，在与本说明书的实施例同样的条件下进行RNA印迹分析时，例如在任意时刻(例如2个或以上的时刻(第5天和第15天))、在相同或对应的部位都可见表达，此时以本发明的定义，该表达是组成型的。可认为组成型启动子对于在通常的生长发育环境下维持植物的恒定性起到作用。本发明的启动子的表达是“应激应答性”，这是指对植物体施加至少一种应激时，其表达量发生变化的性质。特别是，将表达量增加的性质称为“应激诱导性”，将表达量减少的性质称为“应激减少性”。“应激减少性”的表达的前提是在正常情况下可见表达，因此这是与“组成型”的表达有重复的概念。由植物的任意部分提取RNA，通过RNA印迹分析来分析其表达量，或通过蛋白质印迹分析对所表达的蛋白质进行定量，由此可确定上述性质。
本说明书中，“抗病性”是对植物的性质而言，是可使发病程度减小的能力。本说明书中，“抗虫性”是对植物的性质而言，是可使虫害程度减小的能力。本说明书中，“病害特异性”是指病害发生时某种启动子具有特异性。本说明书中，“虫害特异性”是指虫害发生时某种启动子具有特异性。“抗药基因”是指该基因产物在宿主中表达时，使宿主具有耐药性的基因。抗药基因优选可使转化植物的筛选容易进行的基因，可优选使用提供卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因、和提供潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因等。
本发明的启动子不仅可用于单子叶植物，也可用于双子叶植物以及其他生物的改变。这可通过两种植物间转录调控的基本机理类似予以说明。例如有报道指出玉米的zein基因启动子在烟草中以相同的组织特性表达(Schernthaner等人.，EMBO J.，71249-1255(1988))、水稻的谷蛋白基因启动子在烟草中以相同的组织特性表达(Leisy等人.，Plant Mol.Biol.，1441-50(1989))。特别优选的对象植物除水稻之外，还有小麦、玉米、大麦、高粱、柑橘类、白菜、生菜、烟草、桃、马铃薯、西红柿和苹果等。
本说明书中，提到基因时，“载体”是指可将目标多核苷酸序列转移到目标细胞中的物质。这样的载体的例子有可在原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体和植物个体等宿主细胞中自复制，或可掺入染色体中，在适合本发明的多核苷酸转录的位置含有启动子的载体。植物细胞的“重组载体”的例子有Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。表达盒优选采用植物表达载体的形式。“植物表达载体”是指除结构基因和调控其表达的启动子之外，还有各种调控元件以在宿主植物细胞中可操作的状态连接的核酸序列。调控元件优选含有终止子、抗药基因和增强子。植物表达载体的类型和所用调控元件的种类根据宿主细胞改变，这是本领域技术人员熟知的事项。本发明中使用的植物表达载体还可以具有T-DNA区。特别是在使用农杆菌转化植物时，T-DNA区可提高基因的导入效率。
“终止子”位于基因编码蛋白质的区域域的下游，是DNA转录为mRNA时与转录的终止、polyA序列的添加有关的序列。已知终止子与mRNA的稳定性有关，对基因的表达量有影响。终止子有CaMV35S终止子、胭脂碱合成酶基因的终止子(Tnos)、烟草PR1a基因的终止子，但并不限于这些。
“增强子”可用于提高目标基因的表达效率。增强子优选含有CaMV35S启动子内上游一侧的序列的增强子区。可以使用多个增强子。
用于构建植物表达载体的载体可优选使用pBI系载体、pUC系载体或pTRA系载体。PBI系和pTRA系的载体可经由农杆菌将目标基因导入植物中。可优选使用PBI系的双元载体或中间载体系。例如有pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等。这些载体包含可导入植物的区域(T-区)的基因、作为标志基因的在植物启动子控制下表达的nptII基因(提供卡那霉素抗性)。PUC系的载体可将基因直接导入植物。例如有pUC18、pUC19、pUC9等。植物表达载体可采用本领域公知的基因重组技术构建。
植物表达载体向植物细胞中导入时，可以采用本领域公知的方法，例如经由农杆菌的方法和直接导入细胞的方法。经由农杆菌导入的方法例如可使用Nagel等人的方法(Nagel等人(1990)、Microbiol.Lett.，67.325)。该方法如下首先，通过电穿孔法用植物表达载体转化农杆菌，然后按照Gelvin等人(Gelvin等人编(1994)、Plant Molecular Biology Manual(Kluwer Academic PressPublishers))的方法将转化的农杆菌导入植物细胞。将植物表达载体直接导入细胞的方法有电穿孔法(参照Shimamoto等人(1989)、Nature、338274-276；和Rhodes等人(1989)、Science、240204-207)、粒子枪法(参照Christou等人(1991)、Bio/Technology 9957-962)以及聚乙二醇(PEG)法(参照Datta等人(1990)、Bio/Technology 8736-740)。这些方法是本领域所公知的，可由本领域人员适当选择适合所转化的植物的方法。
导入了植物表达载体的细胞首先通过卡那霉素抗性等抗药性来选择。接着可按照本领域公知的方法再分化成植物组织、植物器官和/或植物体。并可由植物体获得种子。导入的基因的表达可通过RNA印迹法或PCR法检测。可根据需要通过例如蛋白质印迹法确认基因产物——蛋白质的表达。
作为载体的导入方法，只要是向植物细胞中导入DNA的方法即可，可以使用任意的方法。例如有转染、转导、使用下述菌体的转化等农杆菌(Agrobacterium)(日本特开昭59-140885、日本特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(日本特开昭60-251887)、使用粒子枪(基因枪)的方法(日本特许第2606856、日本特许第2517813)等。
本发明的启动子驱动的表达的“检测”或“定量”例如可使用包含mRNA的测定和免疫学测定方法的适当的方法来实现。分子生物学测定方法的例子有RNA印迹法、斑点印迹法或PCR法等。免疫学测定方法的例子有使用微量滴定板的ELISA法、RIA法、荧光抗体法、蛋白质印迹法、免疫组织染色法等。另外定量方法有ELISA法或RIA法等。
“表达量”是指在目标细胞等中，本发明的蛋白质或mRNA所表达的量。上述表达量的例子有本发明中使用抗体，通过包括ELISA法、RIA法、荧光抗体法、蛋白质印迹法、免疫组织染色法等免疫学测定方法的任意的适当的方法来评价本发明以蛋白质水平表示的多肽表达量；或通过包括RNA印迹法、斑点印迹法、PCR法等分子生物学测定方法的任意的适当的方法来评价的本发明以mRNA水平表示的多肽表达量。“表达量的变化”是指通过包括上述免疫学测定方法或分子生物学测定方法的任意的适当的方法来评价的、本发明以蛋白质水平或mRNA水平表示的多肽表达量的增加或减少。通过观察表达量的绝对量或相对量，可以检测某种启动子是否发生特异性作用。
“转化体”是指通过转化而制备的细胞等生命体的全部或部分。转化体的例子有原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。转化体与其对象有关，也称作转化细胞、转化组织、转化宿主等。
本说明书中，“再分化”是指由个体的一部分复原成整个个体的现象。例如通过再分化，可由细胞及叶或根等组织片形成植物体。
将转化体再分化成植物体的方法是本领域技术人员公知的。这样的方法有Rogers等人.，Methods in Enzymology 118627-640(1986)；Tabata等人.，Plant cell Physiol.，2873-82(1987)；_Shaw，Plant Molecular BiologyA practical approach.IRLpress(1988)；Shimamoto等人.，Nature 338274(1989)；Maliga等人.，Methods in Plant Molecuar BiologyA laboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)等。因此，本领域人员可以根据目标转基因植物适当使用上述公知方法，使其再分化。
再分化的转化体具有希望改变的特性，这可根据该特性的种类，通过适当的测定来验证。例如，可使作为报道基因的GUS基因与启动子融合，导入植物体，制备转化体，通过组织染色检测GUS的活性。这里，可以将荧光蛋白GFP的基因或萤光素酶基因作为报道基因使用。它们可以用于各种启动子的测定。详细内容如后述的实施例所述。另外，试图提供病原性细菌抗性作为应激抗性时，可以将模型菌例如烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)接种于再分化的植物体中，与对照植物体相比，观察接种是否引起变化，由此评价特性的变化。
本说明书中，植物的栽培可以通过本领域公知的任意的方法进行。植物的栽培方法例如如《模型植物的实验方案——水稻、拟南芥篇》细胞工程分册植物细胞工程系列4；水稻的栽培方法(奥野员敏)第28-32页；以及拟南芥的栽培方法(丹羽康夫)第33-40页(监修岛本功、冈田清孝)所示，本说明书不再详述。例如拟南芥的栽培可以进行土培、岩棉培、水培的任意方式。在白色荧光灯(6000勒克斯左右)的连续照明条件下栽培，播种后约4周，最初开花，开花后16天左右，种子成熟。每个穗可获得40-50粒种子，播种后2-3个月至枯死前之间，可获得10000粒左右的种子。种子的休眠期短，成熟种子如果干燥了1周左右，吸水后2-3天内即可发芽。如果在吸水、播种后2-4天期间以4℃进行低温处理，则发芽整齐。水稻的栽培主要以土培进行，在10000勒克斯或以上的光照条件下生长。播种约40天后，改为短光照条件，由此诱导抽穗，诱导抽穗后30天左右开花，开花后40天左右得到成熟种子。
对本发明的启动子表达的分析可通过使用DNA阵列的基因分析方法来进行。关于DNA阵列，(秀润社编、细胞工学分册“DNA微阵列和最新PCR法”)中有全面的概述。另外，最近还使用DNA阵列进行植物的分析(Schenk PM等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9711655-11660)。以下简单地说明DNA阵列以及使用该阵列的基因分析方法。
“DNA阵列”是指使DNA在基板上排成列(阵列)并固定于其上的装置。DNA阵列根据基板的大小或所载DNA的密度，分为DNA宏阵列(DNA macroarrays)和DNA微阵列等。
宏阵列和微阵列的区域分并没有严格界限，通常“DNA宏阵列”是指在膜上将DNA点样形成的高密度滤膜(high density filter)，“DNA微阵列”是指使DNA载于玻璃、硅氧烷等基板表面的装置。根据所承载种类的不同，有cDNA阵列、寡DNA阵列等。
高密度寡DNA阵列之中，应用制造半导体集成电路的照相平版印刷技术(photolithography)，可同时在基板上合成多种寡DNA，由于所得阵列类似半导体芯片，因而特别被称为“DNA芯片”。使用该方法制作的阵列有GeneChip(注册商标)(Affimetrix、CA)等(参照Marshall A等人、(1998)Nat.Biotechnol.1627-31和Ramsay G等人、(1998)Nat.Biotechnol.1640-44)。使用本发明的微阵列进行基因分析时，优选使用该GeneChip(注册商标)。在狭义上DNA芯片如上定义，但也可指DNA阵列或DNA微阵列全体。
DNA微阵列是上述在玻璃基板上将数千-数万或更多的基因DNA以高密度排列的装置，因此通过与cDNA、cRNA或基因组DNA的杂交，可以以基因组规模对基因表达谱或基因多态进行分析。通过该方法，可以进行信号传导系统和/或转录控制路径的分析(Fambrough D等人(1999)，Cell 97，727-741)、组织修复机理的分析(Iyer VR等人、(1999)，Science 28383-87)、药物的作用机理(Marton MJ、(1999)，Nat.Med.41293-1301)、发育、分化过程中基因表达变化的广泛分析、病态中发生表达变化的基因组的鉴定、或与信号传导系统或转录控制有关的新基因的发现等。另外，对于基因多态，也可以将多个SNP在1个DNA微阵列中分析(Cargill M等人、(1999)，Nat.Genet.22231-238)。
以下对使用DNA微阵列进行测定的原理进行说明。DNA微阵列是在表面经适当加工的如载玻片的固相基板上高密度定固定多种不同的DNA探针而制成的。之后在适当的杂交条件下，使标记的核酸(目标)进行杂交，通过自动检测器检测各个探针的信号。将该数据通过计算机进行大量分析。例如在基因监测中，在以寡DNA或cDNA为探针的微阵列中，mRNA通过反转录反应形成掺入了荧光标记物的目标cDNA，使目标cDNA杂交，通过荧光图像分析仪进行检测。此时，可使用T7聚合酶进行cRNA合成反应，或通过该酶促反应进行其他各种信号扩增反应。
Fodor等人将组合化学与半导体制造的照相平版印刷技术结合，开发了在基板上合成聚合物的技术(Fodor SP等人、(1991)Science251767-773)。将其称为合成型DNA芯片。照相平版印刷可以进行极微细的表面加工，因此可以制备10μm2/DNA样品这样集成度高的DNA微阵列。该方法通常可在玻璃基板上合成25-30种左右的DNA。
Lockart等人报告了使用合成型DNA芯片的基因表达(Lockart DJ等人(1996)Nat.Biotechnol.141675-1680)。该方法可以消除原有形式的芯片因可合成的长度短而导致特异性低的缺点。这里，为了看到1个基因的表达，通过制备与十多处对应的完全配对(perfect match，PM)寡核苷酸探针以及制备在PM探针中央的1个碱基处插入突变的错配(mismatch，MM)寡核苷酸探针，解决了该问题。在这里，MM探针作为杂交特异性的指标使用，由PM探针和MM探针的信号比可确定基因表达的水平。PM探针和MM探针的信号比同等时，称为交叉杂交，不能解释为显著的信号。
在所谓的附着式DNA微阵列中，制作DNA附着于载玻片上形式的DNA微阵列，然后进行荧光检测(也可参照http//cmgm.stanford.edu/pbrown)。该方法中，无需大规模的半导体制造仪器，只要有DNA阵列点样仪和检测仪，在实验室内即可测定。该方法具有可以选择附着的DNA的优点。关于是否高密度，例如以100μm的间隔点直径100μm的斑点，则在计算上1cm2可以点样2500个DNA。因此，通常载玻片(有效面积约4cm2)可承载约1万个DNA。
合成型DNA阵列的标记方法例如有双色荧光标记法。该方法是将2个不同的mRNA样品分别用不同的荧光标记，在同一微阵列上进行竞争性杂交，测定两种荧光，通过比较来检测基因表达的不同。荧光色素例如最常采用Cy5和Cy3，但并不限于它们。Cy3和Cy5的优点是荧光波长几乎不重叠。双色荧光标记法不仅在检测基因表达的不同时使用，也可用于检测突变或多态性。
在用DNA阵列进行的测定中，可以使用阵列点样仪。基本上阵列点样仪是与高性能伺服马达组合，在计算机控制下使针头或载玻片架沿XYZ轴方向操作，将DNA样品由微量滴定板运送到载玻片表面上的装置。针头被加工成各种形状。例如，可将DNA溶液存于像鸟嘴一样分开的针头上，对多个载玻片点样。中间夹有洗涤、干燥的循环，然后承载下一次DNA样品，上述步骤循环往复。这里，为防止样品之间的混杂，要注意充分进行针头的洗涤、干燥。这样的阵列点样仪有SPBIO2000(Hitachi Software Engineering；一次点样式)、GMS417Arrayer(宝酒造；环形针式)、Gene Tip Stamping(Nippon Laser&Electronics；笔式)等。
在用DNA阵列进行的测定中，所用的DNA固定方法有各种。作为基板的材质，玻璃与膜相比，有效固定面积小、电荷量也少，因此可在其上进行各种涂层。实际上实施聚L-树脂涂层或硅氧烷化等(参照Schena M等人(1995)Science 270467-470、Schena M等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9310614-10619)。另外也可以使用市售的DNA微阵列专用带涂层的载玻片(例如聚碳化二亚胺(polycarbodiimide)玻璃(日清纺)等)。当为寡DNA时，也可采用使DNA末端氨基化，与硅烷化玻璃交联的方法。
可主要使PCR扩增的cDNA片段载于DNA微阵列上。cDNA的浓度不够时，存在不能充分检测出信号的情况。因此，在PCR中未能获得足够量的cDNA片段时，可重复几次PCR，汇总所得PCR产物并纯化、浓缩。关于探针cDNA，通常多将大量cDNA随机地承载，但根据试验目的，可以承载经选择的一组基因(例如本发明的基因组或启动子组)或由RDA(代表性差异分析)所得的有表达变化的候选基因。优选避免重复克隆。克隆可以从手头的cDNA文库制备，也可以集中购买cDNA克隆。
在使用DNA阵列进行的测定中，用荧光检测器等检测DNA微阵列上杂交的荧光信号。这样的检测器可以利用目前的各种检测器。例如斯坦佛大学的研究小组开发了original scanner，该扫描仪将荧光显微镜与操作步骤结合起来(参照http//cmgm.stannford.edu/pbrown)。只要斑点不是太高密度，以往的凝胶荧光图像分析仪FMBIO(Hitachi Software Engineering)、Storm(Moleular Dynamics)等也可以进行DNA微阵列的读取。其它可利用的检测器有ScanArray 4000、同系列5000(General Scanning；扫描式(共聚焦式))、GMS418 Array Scanner(宝酒造；扫描式(共聚焦式))、Gene Tip Scanner(Nippon Laser&Electronics；扫描式(非聚焦式))、Gene Tac 2000(Genomic Solutions；CCD照相机式)等。
由DNA微阵列得到的数据是庞大的，因此用于进行克隆与斑点的对应管理、进行数据分析等的数据分析软件是很重要的。这样的软件可以采用各种检测系统所附带的软件(Ermolaeva O等人(1998)Nat.Genet.2019-23)。数据库的格式例如有Affymetrix提倡的GATC(基因分析技术联盟)的形式。
本发明的启动子和功能性植物还可以通过采用差异显示(differential display)技术的基因分析法来进行分析。
差异显示技术是用于检测或鉴定表达发生变化的基因的方法。该方法如下从2个或以上的样品中分别制备cDNA，使用任意的primerset，通过PVR进行扩增，然后将生成的多种PCR产物通过凝胶电泳进行分离，形成图谱，然后根据各条带相对信号强度的变化来克隆表达发生变化的基因。
本发明中采用的数据库可以包括DNA芯片的分析结果。另外，使用DNA芯片进行表达频率的分析，根据其结果可以确定本发明的启动子的特异性。
优选实施方案的说明第一方面，本发明提供功能性植物。该功能性植物包含至少一个进行特异性表达的启动子和与该启动子可操作地连接的基因。本发明的功能性植物的启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。表达频率的分析方法为本领域人员所公知，如上所述。
在一个实施方案中，本发明的功能性植物中使用的基因不在果实中表达。在另一实施方案中，其基因在叶中特异性表达。在其他实施方案中，其基因在愈伤组织中特异性表达。
本发明的功能性植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在一个实施方案中，本发明的功能性植物可以是单子叶植物。在一个优选的实施方案中，本发明的功能性植物可以是谷物(例如小麦、玉米、水稻、大麦、高粱)。更优选本发明的功能性植物是水稻。其他优选的实施方案中，本发明的功能性植物可以是食用或嗜好用作物(tastematerial)(例如烟草、青椒、茄子、甜瓜、西红柿、甘薯、卷心菜、葱、嫩茎花椰菜、胡萝卜、黄瓜、柑橘类、白菜、生菜、桃、马铃薯和苹果)。在另外的实施方案中，本发明的功能性植物可以是观赏性植物(例如像蔷薇那样观赏花的植物(矮牵牛、香石竹、菊、洋桔梗、夏堇)、像松树那样的树木)。
在另一实施方案中，本发明中采用的基因可以是抗病基因或抗虫基因(例如防御素、somatin、壳多糖酶、Bt、半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。
本发明的优选的实施方案中，本发明中采用的基因可以是选自维生素合成基因、糖合成基因、脂质合成基因、聚酮合成基因、光学合成基因、功能性成分合成基因和转录因子的基因。
另一方面，本发明涉及进行特异性表达的启动子。该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
在一个实施方案中，本发明的启动子不驱动果实中基因的表达。在另一实施方案中，本发明的启动子特异性驱动叶中基因的表达。在其他实施方案中，本发明的启动子特异性驱动愈伤组织中基因的表达。在另一实施方案中，本发明的启动子只在可利用部位特异性驱动基因的表达。在其它实施方案中，本发明的启动子在叶中特异性驱动基因的表达。在另外的实施方案中，本发明的的启动子在花中特异性驱动基因的表达。在其它实施方案中，本发明的启动子在果实中特异性驱动基因的表达。在另外的实施方案中，本发明的启动子在种子中特异性驱动基因的表达。
其它方面，本发明提供含有进行特异性表达的启动子的表达盒。该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
在一个实施方案中，本发明的表达盒不驱动果实中基因的表达。在另一实施方案中，本发明的表达盒特异性驱动叶中基因的表达。在其他实施方案中，本发明的表达盒特异性驱动愈伤组织中基因的表达。在另一实施方案中，本发明的表达盒只在可利用部位特异性驱动基因的表达。在其它实施方案中，本发明的表达盒在根中特异性驱动基因的表达。在另外的实施方案中，本发明的的表达盒在茎中特异性驱动基因的表达。在其它实施方案中，本发明的表达盒在花中特异性驱动基因的表达。在另外的实施方案中，本发明的的表达盒在果实中特异性驱动基因的表达。在又一实施方案中，本发明的表达盒在种子中特异性驱动基因的表达。
其他方面，本发明提供植物的可利用部位，该植物的可利用部位由包含至少一个进行特异性表达的启动子和与该启动子可操作地连接的基因的植物获得。该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定。优选可利用部位是叶或果实。在优选的实施方案中，可以使该启动子在可利用部位不表达。此时，该基因可以是抗病基因或抗虫基因(例如防御素、somatin、壳多糖酶、Bt、半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。在一个实施方案中，该启动子在可利用部位特异性地驱动表达。此时该基因可以是选自维生素合成基因、糖合成基因、脂质合成基因、聚酮合成基因、光学合成基因、功能性成分合成基因和转录因子的基因。
另一方面，本发明提供培育特异性地表达所需基因产物的方法，该方法包括确定启动子的特异性的步骤，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定；
将该启动子与编码该所需基因产物的核酸分子进行可操作的连接，制备连接混合物的步骤；将该连接混合物导入植物的步骤；使该植物生长的步骤。
本发明还提供生产所需基因产物的方法。该方法包括以下步骤确定启动子的特异性的步骤，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定；将该启动子与编码该所需基因产物的核酸分子进行可操作的连接，制备连接混合物的步骤；将该连接混合物导入植物的步骤；使该植物生长的步骤；以及收集该植物中的该所需基因产物的步骤。
在一个实施方案中，该启动子的特异性可通过DNA芯片分析来确定。
在一个方面，本发明提供由本发明的方法得到的基因产物。基因产物有抗生素等药物、多肽、蛋白质等。基因的二次代谢产物也可由本发明的方法得到。
以下根据实施例说明本发明，但以下实施例只是举例的目的。本发明的范围并不受上述实施方案的限定，只受权利要求的限定。
实施例(实施例1利用cDNA文库鉴定特异性启动子)(由水稻组织提取RNA)由以下的水稻组织中提取RNA苄基腺嘌呤处理的愈伤组织、赤霉素处理的愈伤组织、热休克处理的愈伤组织、繁殖期的愈伤组织、幼根、幼绿叶、幼黄化叶、开花期的穗。简单的办法是在异硫氰酸胍和苯酚存在下使磨碎的植物组织进行蛋白质改性，与水层一起回收总RNA。真核生物的3末端具有polyA序列，因此使其吸附于固定有寡dT的载体上并进行洗脱，由此可特异性分离。
(由提取的RNA构建cDNA文库)使用逆转录酶由提取的mRNA合成互补DNA链(1st Strand)，使RNaseH和DNA聚合酶作用，合成2nd Strand，构建cDNA文库。
(cDNA文库的分析)将构建的cDNA文库与登记于DDBJ的已知序列进行比对，总结出每个相同或类似的基因的表达频率。首先，由同源性检索的结果提取出具有整个序列超过90％的非常高的同源性的克隆。第二，将该克隆相互比对，对其序列中特定位置上是否有碱基水平的差异进行了研究。当特定位置明显有两种或以上的碱基偏差时，则判定有同族的不同的基因；没有偏差时，则判断只是碱基序列自动确定装置的读取误差。将判断为相同的一个例子表示在图1。其结果表示在以下的表中。
这里，CB表示苄基腺嘌呤处理的愈伤组织，CG表示赤霉素处理的愈伤组织，CH表示热休克处理的愈伤组织，CK表示繁殖期的愈伤组织，RA表示幼根，SS表示幼绿叶，ST表示幼黄化叶，EB表示开花期穗，EC表示成熟早期的穗。
根据上表可以选择显示所需表达图谱的启动子。这里，例如选择了脱分化状态(愈伤组织)特异性启动子、叶特异性启动子、组成型表达启动子。
脱分化状态(愈伤组织)特异性启动子由只在选自CB、CG、CH和CK的至少一个部位显示表达、或该部位比其它部位显示更多表达的基因的启动子区获得。这里，在以下的实施例中使用ID属于CG0060_1的克隆。其序列表示为SEQ ID NO.1。
叶特异性启动子由只在选自SS和ST的至少一个部位显示表达、或该部位比其它部位显示更多表达的基因的启动子区获得。这里，在以下的实施例中使用ID属于EB0082_2的克隆。其序列表示为SEQID NO.2。
组成型启动子由在整个部位几乎显示均匀的表达的基因的启动子区获得。这里选择了ID属于RA1583_1的克隆。其序列表示为SEQID NO.3。
(实施例2对所选择的启动子进行特异性确认)通过该实施例确认实施例1中选择的各克隆是否具有目标特异性。具体的步骤如下。
(确定所选择的克隆的碱基序列)首先确认所选择的克隆是否与预想的序列相同。确定序列时，可通过本领域人员公知的双脱氧染色终止法(dideoxy dyetermination)进行。简单地说，通过热变性使要确定序列的DNA链成为单链状态，此时使引物附着于比要确定碱基序列的位置更上游的位置。在每个碱基上都附着了不同荧光色素的三磷酸双脱氧核苷酸和三磷酸脱氧核苷酸的存在下，通过DNA聚合酶进行DNA合成反应。当双脱氧核苷酸三磷酸被掺入时，DNA合成的延伸停止。用丙烯酰胺凝胶将该反应产物进行电泳，按照分子量进行分离，机械判读荧光色素，即可确认碱基序列。
接着将确定的序列与登记在DDBJ的序列进行比对，确认上述各克隆具有目标序列。
(实施例3启动子区的获得)本实施例中，使用已确认具有目标序列的克隆来获得启动子区。可简单地表示为以下的步骤。
首先，以登记于DDBJ的数据为基础设计引物，使用市售的采用PCR基本技术分离已知序列的上游的试剂盒(Genomewalker；Clontech、美国)进行克隆，获得目标基因的启动子区。其方案如图2所示。
这些片段具有0.6kb-2.5kb左右的长度。
(实施例4使用愈伤组织特异性启动子培育功能性植物)(通过绿色荧光蛋白构建表达载体)使用绿色荧光蛋白、来自CG0060_1的克隆的启动子区(SEQ IDNO.1)构建表达载体，其中推测来自CG0060_1的克隆的启动子是驱动在愈伤组织特异性表达的启动子。具体步骤如下。
用限制酶EcoRV完全消化水稻基因组DNA，在所有生成的DNA片段的两端添加GenomeWalker的适配子引物(SEQ ID NO.4)，通过由适配子引物内部的序列和已知序列设计的引物对进行PCR反应，由此获得启动子区。
为了使用方便，在获得的片段的两端添加了限制酶识别序列。在5’末端一侧设计含有适配子引物序列的一部分和限制酶识别序列的引物(SEQ ID NO.5)，3’末端一侧设计含有翻译起始位点之前紧邻的序列和限制酶识别序列的引物(SEQ ID NO.6)，进行PCR反应，制备两端添加了限制酶识别序列的启动子盒(SEQ ID NO.7)。
如下构建双元载体在双元载体pTN1内部的设计的多克隆位点(multi-cloning site)HindIII和EcoRI之间插入下述结构的DNA片段通过启动子盒形式的本发明的启动子来驱动绿色荧光蛋白基因、通过来自农杆菌胭脂碱合成酶基因的转录终止信号序列进行转录终止。
(表达载体导入水稻)用构建的载体转化水稻。其具体步骤如下。
将构建的载体通过电穿孔法导入农杆菌中，得到转化农杆菌。将进行了预培养的水稻在转化农杆菌存在下进行3天共培养，使其被农杆菌感染。用乙醇和次氯酸钠溶液灭菌，在含有2，4-D的培养基上培养5天，用得到的水稻成熟种子培育农杆菌转化的水稻。
(结果)结果，通过该启动子得到了转化水稻细胞。
(感染细胞的选择)转化水稻细胞通过在pTN载体中编码的nptII基因获得了遗传霉素抗性，因此可用含有遗传霉素的N6培养基培养，只筛选转化水稻细胞。
(转化水稻的再分化)接着，由转化水稻再分化。其具体步骤如下。
转化水稻细胞在含有细胞分裂素的培养基上诱导再分化，进一步在不含激素的培养基上培育，直至生长为可土培的个体，然后栽入盆中。
(结果)结果得到了植物的各组织。
(特异性表达的确认)将所得愈伤组织、植物体分成各部位(根、叶、茎、胚乳、胚)，确认表达特性。
(结果)结果如图3-5所示。如图所示，证实来自CG0060_1的启动子在根中不驱动特异性表达。
另外证实驱动在愈伤组织中的特异性表达。还证实在叶和米粒中低于检出下限。
(实施例5使用叶特异性启动子培育功能性植物)(通过绿色荧光蛋白构建表达载体)使用绿色荧光蛋白、来自EB0082_2的克隆的启动子区(SEQ IDNO.2)构建表达载体。其中推测来自EB0082_2的克隆的启动子是驱动叶特异性表达的启动子。
用限制酶DraI完全消化水稻基因组DNA，在所有生成的DNA片段的两端添加GenomeWalker的适配子引物(SEQ ID NO.4)，通过由适配子引物内部的序列和已知序列设计的引物对进行PCR反应，由此获得启动子区。
为了使用方便，在获得的片段的两端添加限制酶识别序列。5’末端一侧设计含有水稻基因组序列的一部分和限制酶识别序列的引物(SEQ ID NO.8)，3’末端一侧设计含有翻译起始位点之前紧邻的序列和限制酶识别序列的引物(SEQ ID NO.9)，进行PCR反应，制备两端添加了限制酶识别序列的启动子盒(SEQ ID NO.10)。
(表达载体导入水稻)用构建的载体转化水稻。简单地说，构建如下双元载体在双元载体pTN1内部的设计的多克隆位点HindIII和EcoRI之间插入下述结构的DNA片段通过启动子盒形式的本发明的启动子来驱动绿色荧光蛋白基因、通过来自农杆菌胭脂碱合成酶基因的转录终止信号序列进行转录终止。
(结果)结果，通过该启动子得到了转化水稻细胞。
(制备转化水稻的愈伤组织)接着，由转化水稻制备愈伤组织。其具体步骤如实施例7所示。
(结果)结果得到了植物组织。
(转化水稻的再分化)接着，使转化水稻再分化。其具体步骤如实施例7所示。
(结果)结果得到了植物体。
(特异性表达的确认)将所得愈伤组织、植物体分成各部位(根、叶、茎、胚乳、胚)，确认表达特性。
(结果)结果如图3-5所示。如图所示，证实来自EB0082_2的启动子在根中不驱动特异性表达(图3)。
另外证实驱动叶中的特异性表达(图4)。还证实该启动子在米粒中驱动的表达低于检出下限(图5)。
(实施例6使用在胚乳中不表达的启动子培育功能性植物)(通过绿色荧光蛋白构建表达载体)使用绿色荧光蛋白、来自RA1583_1的克隆的启动子区(SEQ IDNO.3)构建表达载体。其中推测来自RA1583_1的克隆的启动子是具有在胚乳中不表达的特异性的启动子。
用限制酶PvuII完全消化水稻基因组DNA，在所有生成的DNA片段的两端添加GenomeWalker的适配子引物(SEQ ID NO.4)，通过由适配子引物内部的序列和已知序列设计的引物对进行PCR反应，由此获得启动子区。
为了使用方便，在获得的片段的两端添加限制酶识别序列。5’末端一侧设计含有适配子引物序列的一部分和限制酶识别序列的引物(SEQ ID NO.5)，3’末端一侧设计含有翻译起始位点之前紧邻的序列和限制酶识别序列的引物(SEQ ID NO.11)，进行PCR反应，制备两端添加了限制酶识别序列的启动子盒(SEQ ID NO.12)。
(表达载体导入水稻)用构建的载体转化水稻。简单地说，构建如下双元载体在双元载体pTN1内部的设计的多克隆位点HindIII和EcoRI之间插入下述结构的DNA片段通过启动子盒形式的本发明的启动子来驱动绿色荧光蛋白基因、通过来自农杆菌胭脂碱合成酶基因的转录终止信号序列进行转录终止。
(结果)结果，通过该启动子得到了转化水稻细胞。
(感染细胞的选择)接着，选择感染细胞。其具体步骤如实施例7所示。
(转化水稻的再分化)接着，使转化水稻再分化。其具体步骤如实施例7所示。
(结果)结果得到了植物的各组织。
(特异性表达的确认)将所得愈伤组织、植物体分成各部位(根、叶、茎、胚乳、胚)，确认表达特性。
(结果)结果如图3-5所示。如图所示，证实来自RA1583_1的克隆的启动子区在叶中驱动特异性表达(图4)。该启动子区在根中不驱动特异性表达。
另外证实显著检出作为可利用部位在米粒的胚芽中有特异性表达。
(实施例7驱动愈伤组织特异性表达的克隆的启动子区的有用性验证)下面，对推测为驱动在愈伤组织中特异性表达的启动子——来自CG0060_1的克隆的启动子区的启动子，验证其表达强度的实用性。具体步骤如下。
(启动子区与报道基因的连接)下面，使用表达载体，将抗生素抗性基因——潮霉素磷酸转移酶(HPT)与上述克隆的启动子区连接，确认其表达强度的实用性。其步骤简示如下。
对于具有通过CaMV35S启动子驱动HPT基因的结构的双元载体pTH1，除去其CaMV35S启动子部分，取而代之，构建具有通过本发明的启动子驱动HPT基因的结构的双元载体。根据单子叶植物的超快速转化法(日本特许第3141084号)所述方法导入水稻细胞。
(结果)结果如图6和7所示。
由图6中的电泳图可知由本实施例制备并生长的水稻的愈伤组织中掺入了潮霉素磷酸转移酶。另外，如图7所示，本实施例构建的载体转化的愈伤组织具有潮霉素抗性。结果显示pTH是具有下述结构的载体通过作为阴性对照使用的CaMV35S启动子驱动HPT基因。
还验证插入本实施例中使用的启动子的基因具有潮霉素抗性的足够的表达强度。另外，作为对照使用的野生型则不具潮霉素抗性(图7)。由此证实来自CG0060_1的克隆包含愈伤组织特异性启动子区。
(实施例8在胚乳中不表达的启动子区的有用性的验证)下面，对推测为具有在胚乳中不表达的特异性的启动子——来自RA1583_1的克隆的表达强度的实用性进行研究。具体步骤如下。
(启动子区与报道基因连接)使用表达载体，将抗生素抗性基因与上述克隆的启动子区连接，确认其作为启动子的表达强度的实用性。其步骤如实施例7所示。
(结果)结果如图6和7所示。
由图6中的电泳图可知本实施例制备并生长的水稻的愈伤组织中掺入了潮霉素磷酸转移酶。另外，如图7所示，由本实施例构建的载体转化的愈伤组织具有潮霉素抗性。
还验证插入本实施例中使用的启动子的基因具有潮霉素抗性的足够的表达强度。另外，作为对照使用的野生型则不具潮霉素抗性(图7)。由此证实来自RA1583_1的克隆具有潮霉素抗性的足够的表达强度。
(比较例)作为比较，使用来自CaMV 35S的启动子，进行与实施例7和8的同样的试验。同样该启动子也赋予了潮霉素抗性。
(结论)如上所述，证实了利用具有某种特异性的启动子培育的功能性植物实际上具有目标功能。其中所述特异性是根据含有启动子的基因在cDNA数据库中的表达频率来确定的。
得以设计、培育上述功能性植物，这是现有技术无法实现的，是具有划时代意义的技术，产业上的利用价值难以估量。
本发明提供改变了基因表达图谱的功能性植物，以使其在目标部位特异性表达或不表达、。
工业实用性通过构建本发明的功能性植物的方法，得以构建用于使所需基因在植物的所需部位任意表达的系统。本发明的方法可提供可使基因产物在任意所需部位表达或不表达的功能性植物。这样可以自由自在地提供功能植物，这在产业上非常有用。
序列表SEQUENCE LISTING<110>国立农业研究机构<120>功能性植物、用于培育该功能性植物的启动子、及其应用方法<130>NG001PCT<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1705<212>DNA<213>水稻<400>1atcattaggc caaaagatcc cttattcaca acagtccata agaaattgct ttctccacag 60tacacaccat atttggataa ttgcattgga gcaatagatg gtactcacat ccaagttgtg 120gtgccaaatt cagctgctgt tcaacatagg aatagacata aggagaagag tcagaatgtt 180atgtttgtct gtgactttga tatgagattt actttcgtgc ttgctggctg gcctggttcg 240gttcatgaca tgagggtatt caatgatgca caaactagat ttagtgccaa gtttccaaag 300ccacctccag gaaagtttta tctcgtagac tcgggatacc caaataggct gggttatcta 360gcaccataca agggtataac atatcattcc aagagtacaa cgaaagcaca ttgccaaggg 420gaagaaggga gcactttaat tactgccatt attcgtgtcg gaatgtcata gagaggtcat 480ttggggtctt gaagaacaag tggaggattt tgtttagttt acctagctac tcgcaggaaa 540aacaaagcag aattatccat gcatgcatag cacttcataa tttcattaga gacagtcaaa 600tggctaatac agagttcgac aattgtgacc atgatgaaaa ttatgatcca ttgggtggaa 660cctctgctcc atctagtgaa ccaacaaacg atttggactc gcgtgtcatg aaccaatttc 720gggactgggt tgccgatgga ttgtggtctt tgaaaggaat gtaatgaatg gttcaaattt 780attgtgaatt gtatttggtt taacttgtca attgaaccat gagtgcttgt aatttgtaac 840attgaaactt ctgtgatgta tttcaacaac ttgagatgtg tatgagcttc tttgaatttc 900tgtgattagg ccgtgatatt gatgatgaaa atgatgtggg ggttattgct tgtgattcgg 960cttgctgaag gtgtgtattt gtccaaatta tgatggatta aaacatgtga tgttggggtg 1020aaacattgat ttggcttgca tttggttgtg ctgtcatgca gcaacaatgg ttttgcttgt 1080aaagtgctag cagcggcagc aaacagcatg ctgcagcaag gggcatggtg cagtccactt 1140tgtatggttt tagggggtaa tatggtcatt gtgcagcgca tttaataaac tttagtccct 1200tttagtccct ataaccaaac agttatggac taaaatgatt agtcctaaga ctaaaataag 1260tccctaggac ttatggatcc aaacaccacc atagtagaag ctatgggcgg gggcggcagt 1320ccgggtggca gcatcttcga tagagtggca gccgtccacc ggccgcttca tcgcgcgtgg 1380cggcagtcca cccagtatgc cgtcgtgggt aaccaatcgg catcgagacc tatccgcggg 1440acgaagccaa ccgttcgaat ggtgtgcgcg cgtgcatgca tgcgcgcggt ctcagttaat 1500gcattgcctc tcccgagtca agtggcgtgc tatgtttgca gaggcaaaca tgcatgagca 1560gatggcctgg tgaacttata tactcccggc aggcaagtga agtgcatgcc tgtatagctt 1620
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<223>人工序列的说明引物<400>4gtaatacgac tcactatagg gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggt 48<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>5atgcaagctt tcgacggccc gggctggt28<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>6gcatggatcc tgccttctct gtataacctg c31<210>7<211>1735<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明启动子盒<400>7aagctttcga cggcccgggc tggtatcatt aggccaaaag atcccttatt cacaacagtc 60cataagaaat tgctttctcc acagtacaca ccatatttgg ataattgcat tggagcaata 120gatggtactc acatccaagt tgtggtgcca aattcagctg ctgttcaaca taggaataga 180cataaggaga agagtcagaa tgttatgttt gtctgtgact ttgatatgag atttactttc 240gtgcttgctg gctggcctgg ttcggttcat gacatgaggg tattcaatga tgcacaaact 300agatttagtg ccaagtttcc aaagccacct ccaggaaagt tttatctcgt agactcggga 360tacccaaata ggctgggtta tctagcacca tacaagggta taacatatca ttccaagagt 420acaacgaaag cacattgcca aggggaagaa gggagcactt taattactgc cattattcgt 480gtcggaatgt catagagagg tcatttgggg tcttgaagaa caagtggagg attttgttta 540gtttacctag ctactcgcag gaaaaacaaa gcagaattat ccatgcatgc atagcacttc 600ataatttcat tagagacagt caaatggcta atacagagtt cgacaattgt gaccatgatg 660aaaattatga tccattgggt ggaacctctg ctccatctag tgaaccaaca aacgatttgg 720actcgcgtgt catgaaccaa tttcgggact gggttgccga tggattgtgg tctttgaaag 780gaatgtaatg aatggttcaa atttattgtg aattgtattt ggtttaactt gtcaattgaa 840ccatgagtgc ttgtaatttg taacattgaa acttctgtga tgtatttcaa caacttgaga 900tgtgtatgag cttctttgaa tttctgtgat taggccgtga tattgatgat gaaaatgatg 960tgggggttat tgcttgtgat tcggcttgct gaaggtgtgt atttgtccaa attatgatgg 1020attaaaacat gtgatgttgg ggtgaaacat tgatttggct tgcatttggt tgtgctgtca 1080tgcagcaaca atggttttgc ttgtaaagtg ctagcagcgg cagcaaacag catgctgcag 1140caaggggcat ggtgcagtcc actttgtatg gttttagggg gtaatatggt cattgtgcag 1200cgcatttaat aaactttagt cccttttagt ccctataacc aaacagttat ggactaaaat 1260gattagtcct aagactaaaa taagtcccta ggacttatgg atccaaacac caccatagta 1320gaagctatgg gcgggggcgg cagtccgggt ggcagcatct tcgatagagt ggcagccgtc 1380caccggccgc ttcatcgcgc gtggcggcag tccacccagt atgccgtcgt gggtaaccaa 1440tcggcatcga gacctatccg cgggacgaag ccaaccgttc gaatggtgtg cgcgcgtgca 1500tgcatgcgcg cggtctcagt taatgcattg cctctcccga gtcaagtggc gtgctatgtt 1560tgcagaggca aacatgcatg agcagatggc ctggtgaact tatatactcc cggcaggcaa 1620gtgaagtgca tgcctgtata gcttgagcaa gtatttggca gtttgctgcc aactgctacc 1680ctatttcaaa tctaggtaag atctagctgc aggttataca gagaaggcag gatcc 1735<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的说明启动子盒<400>10aagcttgatc caaggcatca ttcccaacta cagaagtgcg aggaacatat gttccaccct 60tccatgtaaa ttcttgcatg aacttggaaa ataaaatgtt cgttttagaa tgtataatcc 120ctgtcctacg caaatttata actaaagcta actgttcatt gaatctttca ggttgagcta 180tatcgcaacg atcagcaccg cttcaagatt gttgttgatg gtgagagcga agttgacttg 240atggtgcaaa ctcggcacat gcgagacgtc atcattctgg tgattagagg tcttgctcaa 300aagttcaaca gcacatctct caactcactc ctcaagatag aagcatgaag atcgagttgc 360caacctgata taacttacag tatgaaaccg attagaaaag gttgttcagt atcgattcaa 420gttgtttagt ttggaggatg tgtaatattt ataggatttg gagcgtggca gcttttgtgt 480atgggtgtgg ttgagtgtgt taaagttttt ctttttctca aatcaggagc gggttgctct 540tctgaccctg gttttccata ctcacgaaat gtacatagga aagggagggt tggtgatatg 600gtgttgcatt aatatacaag ttgtgtatgc agttctcata ttaggctata tgattgattg 660ggaagatttt ctgttttttc tggctcgtca tcgttggttt catatacaaa attcgaaatg 720gaaatatgta cgagtgatgg ttattgaagt gtccattcta ttttaattct ttgcgcgttg 780tgaggtaatc tcatcgtggt gtaggcttac agcagtaaga tgcgtcgcca ccgttgtttc 840acattgcaaa atccatttct gcaattgcaa gcaatgggct tcaagttctt gattatttca 900gttcatgact cggcatagca ccagcaaagg agcaactggt aaagtggcac atccacttca 960gtgtcgatgc aagcaactca ttccagccta caggaacagt aaatccaggt tcatttactc 1020atttttctgt ggttgaaaaa taccaagatt tccatttttc ttactgctcc acataattcc 1080tatttcccat tctcttgcac ttattccagc ctacagggac agtaaatcca ggttcattta 1140ctcatttttc tgcggttgaa aaaataccaa gatttccatt ttttttactg ctccacataa 1200ttcctctttc ccattctctt gctcactata tatgcctgtc aatttttttg acagaacatg 1260catcaagtca ccaccaacaa catttgcagc tgcatccaag aacattgcat gcagaggtga 1320gcatcttatc cacattggca ggctctaacc aggagatgcc acatcagcag caaggatctg 1380taacctatcc atgagtggcc actgcagtcc acaagctccc cttgtggctc ccattccaca 1440tctcctccaa gaattaaagc ccaatgcatc tccatggtgg cactggacat tatttttttt 1500cctcgaaact cagctgcaag gagaaaggag aaggtagggt ttccagcccg gatcc 1555
<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>11gcatggatcc tcttctctgc ttgggcga28<210>12<211>691<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明启动子盒<400>12aagctttcga cggcccgggc tggtctgaag catcgatgtt tccctgctct catttatctt 60tcttccatgt aagcaaattt gtctaggtga caccagagag agacggtaaa taatagtaaa 120taatagcctt tgtacattcc cttatgtagt tgtgcagtct atttttggtg tgcgagttcg 180gagttcgaag tgttctgaag aatctcttct tgtaatttct agaaatggca ttgaggaaat 240taccagtctt ggcttaaaaa caagtctgtc tcgtcattca ccgtgcttat ttaggacttg 300ttcaactcct gtagaaattc tcgaaaattc ctcgacttta aatggagcct taccattttt 360tagcagatgc aacaactatt atactcctac ctgatgactg atgaggactg tgcagcgatc 420gatatgtgca tgtggccatg tccgaagcta attaaaggac ggaaggacca caagttggtg 480tataataatg gagagggcat tgaatcattg tttcaatatc cccatcagat aatattcaat 540aactcctatg gtgacgtcaa gcatcaatac atgaaggtta cttgttacca ccatcagaca 600agcatataat tgattgctct gatcaagcga tagcaaaaca aaatacaaac cagaacagtc 660tcaaagctcg cccaagcaga gaagaggatc c6919/9NG0019/9
权利要求
1.植物，该植物包含进行特异性表达的至少一个启动子和与该启动子可操作地连接的基因，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
2.权利要求1所述的植物，其中上述基因的表达为组成型表达。
3.权利要求1所述的植物，其中上述基因在叶中特异性表达。
4.权利要求1所述的植物，其中上述基因在愈伤组织中特异性表达。
5.权利要求1所述的植物，该植物为水稻。
6.权利要求1所述的植物，其中上述基因是抗病基因或抗虫基因。
7.权利要求1所述的植物，其中上述基因是选自维生素合成基因、糖合成基因、脂质合成基因、聚酮合成基因、光学合成类基因、功能性成分合成基因和转录因子的基因。
8.启动子，该启动子进行特异性表达，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
9.权利要求8所述的启动子，该启动子不驱动果实中基因的表达。
10.权利要求8所述的启动子，该启动子特异性驱动叶中基因的表达。
11.权利要求8所述的启动子，该启动子特异性驱动愈伤组织中基因的表达。
12.表达盒，该表达盒含有进行特异性表达的启动子，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率而确定。
13.权利要求12所述的表达盒，该表达盒驱动基因的组成型表达。
14.权利要求12所述的表达盒，该表达盒特异性驱动叶中基因的表达。
15.权利要求12所述的表达盒，该表达盒特异性驱动愈伤组织中基因的表达。
16.植物的可利用部位，该植物的可利用部位由包含进行特异性表达的至少一个启动子和与该启动子可操作地连接的基因的植物获得，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定。
17.权利要求16所述的可利用部位，该可利用部位是叶、茎或果实。
18.生产所需基因产物的方法，该方法包括确定启动子的特异性的步骤，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定；将该启动子与编码该所需基因产物的核酸分子进行可操作的连接，制备连接混合物的步骤；将该连接混合物导入植物的步骤；使该植物生长的步骤；以及收集该植物中的该所需基因产物的步骤。
19.培育特异性表达所需基因产物的植物的方法，该方法包括确定启动子的特异性的步骤，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率确定；将该启动子与编码该所需基因产物的核酸分子进行可操作的连接，制备连接混合物的步骤；将该连接混合物导入植物的步骤；使该植物生长的步骤。
20.权利要求19所述的方法，其中上述启动子的特异性通过DNA芯片分析来确定。
21.基因产物，该基因产物由植物获得，该植物是通过权利要求19所述的方法而获得的。
全文摘要
本发明的课题在于构建一种使所需的基因在所需的植物部位任意表达的系统。该课题通过下述植物解决所述植物包含进行特异性表达的至少一个启动子和与该启动子可操作地连接的基因，该启动子的特异性根据含有该启动子的基因所在cDNA数据库中含有该启动子的基因的表达频率来确定。cDNA数据库可以利用基因组计划中发表的内容。
文档编号C07K14/415GK1625331SQ02828968
公开日2005年6月8日 申请日期2002年3月22日 优先权日2002年3月22日
发明者大槻宽, 大岛正弘 申请人:独立行政法人农业·生物系特定产业技术研究机构