植物花药特异表达启动子pTaASG050的鉴定和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体而言，本发明涉及分离的DNA，其能够指导可 操作地连接在其下游的核酸在植物花药中特异转录和/或表达。另外，本发明还涉及包含 该DNA的表达盒和植物等，并涉及该DNA的应用。
【背景技术】
[0002] 植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子 的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，它是位于结构基因5'端上游区域调控基因转 录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效 地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启 动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录； 特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，其中诱导型启动子平时不启动 转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。
[0003] 外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类 型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组 成型的强启动子，比如CaMV35S启动子和玉米Ubiquitin-Ι启动子，然而在利用这些启动 子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间 (发育阶段特异性）或空间（组织器官特异性）不能很好地控制而导致改良效果不明显，或 者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目 前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。
[0004] 此外，在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上的 基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基 因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短 多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化，但是在多 基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉 默。
[0005] 近年来，通过基因工程调控植物花粉育性、创造植物雄性不育系及其恢复系已在 一些作物上获得成功，为作物杂种优势的利用开创了新的前景。目前利用基因工程创造雄 性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植 物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。Mariani等利用烟草花药绒毡层特 异启动子TA29与RNaseT1或Barnase连接构建成嵌合基因，通过农杆菌介导转入烟草 和油菜，获得了稳定的雄性不育的转化株（MarianiC等，Inductionofmalesterility inplantsbyachimaericribonucleasegene，Nature，1990,347 :737-741) 〇 随后， 他们又用TA29驱动Barstar基因，创建了上述雄性不育系的恢复系（MarianiC等， Achimaericribonuclease-inhibitorgenerestoresfertilitytomalesterile plants，Nature，1992, 357:384-387)。此外，其他研究小组利用花药特异启动子启动反义 苯基苯乙烯酮合成酶基因、反义肌动蛋白基因、β-1、3-葡聚糖酶基因等在花药中特异表 达也分别成功地获得了雄性不育植物（Meer等，Promoteranalysisofthechalcone synthasegeneofpetuniahybrid:a67bppromoterregiondirectsflower-specific expression,PlantBiol.，1990, 15:95-109 ;李艳红等，将新的任红雄性不育基因导入 小麦栽培品种的研究初报，农业生物技术学报，1999, 7:255-258 ;Curtis等，Genomic malesterilityinlettuce,abaselinefortheproductionofFihybrid,Plant Sci.， 1996, 113:113-119)。
[0006] 植物花粉或花药启动子的驱动活性和特异性决定了通过基因工程手段调控花粉 育性、创造植物不育系及恢复系的成败。目前已知的驱动活性高且特异性良好的植物花粉 或花药特异启动子还相对较少，而小麦因其基因组较大且结构复杂等原因，在花粉或花药 发育分子机制方面的研究更加匮乏，因此，对小麦花粉特异表达启动子的克隆和功能分析 对于在小麦中利用基因工程调控花粉育性、创造植物雄性不育系，从而为小麦杂种优势资 源在小麦育种中的充分利用打下基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种植物花粉发育晚期花药特异表达的启动子序列及克隆 并应用该启动子的方法。
[0008] 取花粉处于减数分裂期、单核期、双核期和三核期的小麦花药，用 Trizol(Invitrogen)提取总RNA，并进行DNasel(Promega)处理，进而纯化mRNA(Ambion)。 将纯化的mRNA进行反转录（Invitrogen)、超声打断（Fisher)、制备文库（illumina)并扩 增（illumina)，最后在illumina机器上进行测序反应。
[0009] 小麦转录组高通量测序的结果首先通过Trinity软件进行序列拼接，得到的拼接 序列进一步去除冗余以及相似性聚类。对于拼接得到的转录本contig的表达变化分析，各 样品中高通量测序的序列首先通过TopHat(http://tophat.cbcb.umd.edu/)软件与转录 本拼接的结果进行比对。而后Cufflink软件能够计算比对上的转录本contigs的均一化 表达量，用"外显子每百万比对片段的千碱基数（fragmentsperkilobaseofexonmodel permillionmappedfragments，FPKM)'，表不。
[0010] 通过对不同发育时期小麦花药的全基因组表达谱分析，找到花粉处于减数分离 期的花药中不表达而在花粉处于单核、双核和三核期的花药中表达的转录本contig 7187 个。如图1所示，compl81319_c0_seq7(序列如SEQ ID N0:1所示）花粉处于减数分离期 的花药中不表达而在花粉处于单核、双核和三核期的花药中表达。将c〇mpl81319_C〇_Seq7 所对应的基因命名为TaASG050 (Anther Specific Gene 050)。
[0011] 小麦是由A、B、D三套基因组组成的异源六倍体，基因的平均拷贝数为2. 8个，其 中接近一半的基因（46% )有3-4个拷贝，12%的基因有1-2个拷贝，42%的基因拷贝数 彡5个。从compl8m9_c0_seq7的序列（如SEQIDNO: 1所示）出发，利用CerealsDB和 IWGSC(InternationalWheatGenomeSequencingConsortium)公布的普通小麦的测序信 息，以及2013年Nature上发表的小麦祖先乌拉尔图小麦（Triticumurartu，A基因组供 体）和粗山羊草（Aegilopstauschii，D基因组供体）的测序信息进行电子克隆，获得了 3 个TaASG050 基因，分别命名为TaASG050-l，TaASG050-2 和TaASG050-3,其中compl81319_ c0_seq7 对应于TaASG050-l。3 个TaASG050 基因的cDNA序列分别如SEQIDN0:2,SEQ IDN0:3和SEQIDN0:4所示，三者之间的同源性接近90%。分别设计针对TaASG050-l， TaASG050-2和TaASG050-3cDNA的特异性引物，利用RT-PCR方法，对这三个基因在在小麦 根、茎、叶、不同发育时期的花药及除花药以外的其他花器官等多种组织材料中进行表达特 异性分析，结果如图2所示，TaASG050-l、TaASG050-2和TaASG050-3基因均只在花粉处于 单核期、双核期和三核期的花药中特异性表达，在同时期的其他花器官和根、茎、叶及减数 分裂期的穗子等组织器官中都不表达，说明TaASG050-l、TaASG050-2和TaASG050-3基因是 花药特异表达、且只在花粉发育晚期的花药中特异表达的基因。
[0012] 本发明还提供了三个花药特异表达的启动子，所述启动子通过以下方法获得： 从TaASG050-l、TaASG050-2 和TaASG050-3 基因的cDNA序列出发，利用CerealsDB和 IWGSC(InternationalWheatGenomeSequencingConsortium)公布的普通小麦的测序 信息，以及2013年Nature上发表的小麦祖先乌拉尔图小麦（Triticumurartu，A基因组 供体）和粗山羊草（Aegilopstauschii，D基因组供体）的测序信息进行电子克隆，获 得了TaASG050-l、TaASG050-2 和TaASG050-3 基因的启动子，分别命名为TaASG050-l启 动子、TaASG050-2启动子和TaASG050-3启动子，在本发明中所述启动子也可分别称为 pTaASG050-l、pTaASG050-2 和pTaASG050-3,其长度分别为 2015bp、2000bp和 2198bp，序列 分别如SEQIDN0:5、SEQIDN0:6 和SEQIDN0:7 所示。
[0013] 利用PlantCARE数据库和PLACE数据库，对TaASG050-l启动子、TaASG050-2启动 子和TaASG050-3启动子进行顺式元件分析。如图3所示，翻译起始位点ATG用粗体下划线 表示，以翻译起始位点ATG的A定义为"+1"，AGAAA基序用阴影表示，GTGA基序用方框表 示，AGGTCA基序用"
Λ表示，GAAWTTGTGA基序用"
"表示。TaASG050_l启动子中有6 个AGAAA基序、14个GTGA基序和1个GAAWTTGTGA基序，