专利名称：一种植物启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物启动子及其应用。
背景技术：
启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间和表达的强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。最常用的启动子是35s基因启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达，因此35s启动子已经被引入许多转基因植物中。35s启动子来源于CaMV，该病毒能够侵染多种十字花科植物，在其复制周期中经历DNA和RNA阶段，与人类免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒以及反转录转座子的繁殖过程相似。与乙型肝炎病毒不同的是，CaMV DNA并不整合到宿主基因组上。35s启动子是CaMV DNA上控制基因组的RNA形式(即35S RNA)合成的区域。
由于35s启动子在植物基因工程中被广泛应用，在谈论转基因植物的安全性时，人们自然要关心该启动子是否存在着潜在风险。有关35s启动子的潜在风险问题最初是源于Kohli等(Kohli，etal.，Plant J.1999，17(6)591-601)的文章。Kohli等使用霰弹法进行水稻的遗传转化，他们的重组DNA分子包括分别由35s启动子控制的3个基因。对转基因植物进行分析后发现，在水稻基因组中存在着多拷贝的紧密相连的外源DNA，在精确定位这些DNA之间的毗连区后，发现确实存在着DNA重组位点。其中，11个重组位点中有4个是35s启动子内的同一位点，该位点是一个长19bp、包括TATA box在内的回文序列。他们认为这一位点就是35S启动子中的重组热点(hot-spot)。Cummins等根据这一工作推论这一热点会使转基因不稳定，从而导致35s启动子较大的移动性，插入到植物基因组的不同位置。在此假说的基础上，Cummins等进一步列出了一系列35s启动子的潜在风险(1)如果35s启动子插入到原来整合到植物基因组中的隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒；(2)与此相似，如果该启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成；(3)当转基因植物被动物或人类食用时，35S启动子可能会通过基因的水平转移插入到某一致癌基因上游、活化并且导致癌症的发生。上述任何一种情况使人们有足够的理由关心35s启动子的安全性。
转基因植物的生物安全性问题是当前转基因技术发展的难题。实现外源基因在转基因植物中的定向、安全、高效表达是解决转基因植物安全性问题的关键之一。解决这个问题的一个重要途径是克隆到调控外源基因在特定器官或特定发育时期表达的启动子，构建高效表达遗传转化载体，实现可控的遗传转化。1，5一二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)是植物光合作用中重要的质体蛋白；由核基因编码的小亚基的基因rbcS具有叶片组织特异性和光诱导特性，叶片组织特异性为实现转基因的定向表达创造了条件，光诱导特性为转基因的定时表达带来了希望。利用rbcS启动子在转基因植物中调控外源蛋白基因使其在叶片中高效表达，而在种子中不表达将是解决转基因安全性的重要技术策略。从而希望能够解决外源毒蛋白对人类健康带来的潜在风险，促进转基因植物实现产业化。另外，外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和通过改造增强其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
发明创造内容本发明的目的是提供一种具有叶片组织特异性、表达强度高的植物启动子。
本发明所提供的植物启动子名称为rbcSc，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由655个碱基组成。
含有rbcSc启动子的表达载体和细胞系也属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体，如植物表达载体pB2(图谱如图1B所示)。
本发明的rbcSc启动子的转录活性是35S启动子的1.3倍；而且是由rbcS基因启动子进行结构上的改造而得到，除了具有较强的表达活性外，还具有叶片组织特异性和光诱导特性，rbcS启动子可在转基因植物中调控外源蛋白基因使其在叶片中高效表达，而在种子中不表达，保证种子等目标器官中不含有外源基因表达的蛋白质等，解决种子等目标器官中含有外源蛋白(如Bt毒蛋白)等生物安全性问题。本发明的rbcSc启动子可代替35S启动子作为植物转基因的工具启动子，广泛用于培育具有较高生物安全性的单子叶和双子叶转基因植物。
图1A为植物表达载体pB9物理图谱图1B为植物表达载体pB2物理图谱图1C为植物表达载体pB8物理图谱图2为TaKaRa Mutan BEST Kit原理示意3为几种启动子的转录活性比较示意4为不同载体在苜蓿植株中的瞬时表达检测结果照片图5为不同载体在水稻愈伤组织中的瞬时表达检测结果照片图6为不同载体在玉米愈伤组织中的瞬时表达检测结果照片图7为不同载体在小麦愈伤组织中的瞬时表达检测结果照片具体实施方式
实施例1、rbcSZm1启动子的克隆根据报道序列(GeneBankS42508)设计引物，且5’端加上HindIII酶切位点，3’端加上XbaI酶切位点，由生工生物技术公司合成引物，序列如下引物0AAAAAG CTTGAT ATT AGT TCA GCC CAA；引物1TTTTCT AGACGA CGA GGC CAT CAT CAC。以玉米基因组DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增获得654bp的目的片段，电泳回收纯化，连接到pGEM-T载体上，筛选鉴定后进行测序，序列如序列表中SEQ ID №2所示，表明在rbcS基因启动子的-118处碱基T突变成C。
用XbaI+HindIII双酶切rbcSZm1，然后电泳回收纯化。同时，也将pBI121质粒(GENBANKAF485783)用XbaI+HindIII双酶切，37℃，充分酶切直至过夜，之后1.0％琼脂糖凝胶电泳回收纯化。酶切体系总共20ulXbaI，2ul；HindIII，2ul；10×buffer，2ul；BSA，2ul；载体DNA；12ul。然后将二者的回收产物用T4DNA连接酶连接，连接体系共10ulT4DNA连接酶，1ul；10×连接buffer，1ul；pBI121，4ul；目的片段，4ul。然后按CaCl2法转化DH5α，进行卡那抗生素筛选，提取重组阳性质粒，以提取的重组阳性质粒为模板按常规方法进行PCR扩增鉴定，引物序列(0和1)如上，结果表明重组质粒结构正确，得到植物表达载体pB9(图1A)。
实施例2、rbcSc启动子的克隆利用Megaprimer PCR的方法，以rbcSZm1作为模板，以引物1GAT ATT AGT TCAGCC CAA和引物2(突变)5’-CCGGGCGCGGCCACG-3’为引物。第一轮扩出了241bp大小的目的片段，回收此片段作为下一轮扩增中的megaprimer。以5’-CGCGCGCGCGCGTG-3’为另一端引物，进行第二轮扩增。经过第二轮扩增，扩增出654bp大小的目的片段，回收纯化，连接到T载体上，筛选出阳性克隆，鉴定后送申友生物技术公司测序。测序结果显示在rbcS基因启动子的GC富含区-118定点将T突变成C，其它的碱基序列与rbcSZm1基因启动子完全一致，命名为rbcSc，其序列如序列表中SEQ ID №1所示。
用XbaI+HindIII双酶切rbcSc，然后电泳回收纯化。同时，也将pBI121质粒用XbaI+HindIII双酶切之后电泳回收纯化，然后将二者的回收产物用T4DNA连接酶连接，转化到DH5α，卡那抗生素筛选，提取阳性质粒，用XbaI和HindIII双酶切重组质粒，结果表明重组质粒结构正确，得到植物表达载体pB2(图1B)，具体步骤参照实例1。
Megaprimer PCR的具体步骤如下第一步反应体系为10×pfu Buffer 5uldNTP 4ul引物1 2ul引物2(突变)2ul模板 1-10ngpfu(5U/ul) 0.5ul灭菌蒸馏水 直到50ul反应程序为 25个循环反应结束之后，1.0％琼脂糖电泳，回收纯化241bp片段为megaprimer。
第二步在PCR小管中加入质粒 1uldNTP 1ul10×buffer5ulTaq plus酶2.5Umegaprimer2ul引物1 8ul突变 16ul补水至48ul进行如下反应 5个循环结束后，72℃取出加入2ul另一端引物，继续进行如下反应 30个循环反应结束之后，1.0％琼脂糖电泳，回收纯化654bp片段。然后把回收的片段连接到T载体上，测序。
实施例3、rbcSo启动子的克隆利用插入突变在rbcSZm1基因启动子的-31位置、TATA框上游插入八核苷酸序列(八聚体ATTTGCAT)。根据宝生物公司TaKaRa Mutan BEST Kit突变试剂盒(原理如图2)的说明合成引物插入序列引物5’端ATT TGCATC ATG GAC ATG GCT CTAT；插入序列引物3’端TCG CTG GAT CCG CGT CCG CC；以rbcSZm1基因启动子为模板，按常规方法进行PCR扩增产物回收纯化，连接到T载体上，筛选出阳性克隆，鉴定后送申友生物技术公司测序，结果发现八核苷酸序列插入到了启动子当中，且位于TATA框上游14bp处。命名为rbcSo，其序列如序列表中SEQ ID №3所示，自5’端155位-162位碱基为插入的八核苷酸序列ATGCAAAT。
用XbaI+HindIII双酶切rbcSo，然后电泳回收纯化。同时，也将pBI121质粒用XbaI+HindIII双酶切之后电泳回收纯化，然后将二者的回收产物用T4DNA连接酶连接，转化到DH5α，卡那抗生素筛选，提取阳性质粒，用XbaI和HindIII双酶切重组质粒，结果表明重组质粒结构正确，得到植物表达载体pB8(图1C)，具体步骤参照实例1。
实施例4、rbcSc、rbcSo启动子的瞬时表达的检测本实施例所用主要溶液的成分(1)W5清洗液(pH5.8高压灭菌)NaCl154mmoll/lCaCl2125mmol/lKCl 5mmol/l葡萄糖 5mmol/l(2)酶溶液纤维素酶R-101.2％离析酶R-10 0.4％用K3AS培养基配制，搅拌30-60分钟溶解之后，3000g，离心5分钟，过滤灭菌，现用现配。
(3)GUS酶提取缓冲液Na3PO4(pH7.0)50mmol/lEDTA10mmol/lNaCl100mmol/lSodium Lauroy Sarcosine 0.1％
Triton X-1000.1％β-巯基乙醇 10mol/lPMSF2mmol/lBSA 0.01％(4)MaMg溶液MgCl215mmol/lMES 5mmol/l甘露醇 0.5mmol/lpH5.8，高压灭菌。
(5)终止缓冲液Na2CO30.2mol/l(6)MUG溶液用GUS酶提取缓冲液配制成2mmol/l。
(7)4-MU溶液用终止缓冲液配成100umol/l，再稀释成工作浓度。
rbcSc、rbcSo启动子的瞬时表达的检测的具体步骤如下1、原生质体的制备(1)采集生长6周的无菌烟草植株上中等大小的叶片。
(2)用8个培养皿，每个培养皿中含有10ml用K3AS调制的酶解液，放4片叶片。
(3)将叶片叠成两层，垂直于中肋切成2mm宽的小条。
(4)用封口膜将培养皿密封，26℃保温16小时。
(5)检查酶解进行的程度，轻轻的搅动，使已分离的细胞释放进酶解液，如果需要，继续将叶片酶解1-3小时。
(6)为了促进原生质体的释放，可用大口径移液管缓慢的将酶解液上下吹吸2-3次。
(7)用100目和200目不锈钢筛的滤器过滤酶解混合液。
(8)将滤得的原生质体置于5ml离心管中，2000rpm离心20分钟，使原生质体漂浮上层。
(9)用大口径移液管将上层原生质体以最小体积转移到新的5ml离心管中。
(10)用4倍体积的W5溶液稀释原生质体悬浮液，温和混匀，以2000rpm，5分钟离心沉淀原生质体。
(11)用W5溶液洗涤并以2000rpm，5分钟离心沉淀原生质体。
2、聚乙二醇介导的转化(1)将烟草原生质体悬浮于5ml MaMg溶液中，用血红细胞计数器测定原生质体的浓度，使每个转化样品大约有1×106-2×106个细胞。
(2)2000rpm，5分钟离心沉淀原生质体，除去上清，再将沉淀悬浮于0.5ml的MaMg溶液中。
(3)对原生质体在45℃水浴中进行热激处理5分钟，取出样品后室温放置10分钟。
(4)向样品中加入用于转化的DNA，通常每个样品(约106个原生质体)大约加10ugDNA。DNA用TE溶解，体积小于30ul。
(5)缓慢加入0.5ml PEG1450，温和混匀，以诱导细胞摄取DNA。
(6)室温下转化25分钟。
(7)用5ml W5溶液稀释样品，温和搅匀后，用2000rpm离心5分钟沉淀原生质体。
(8)按大约每毫升105个原生质体的密度将原生质体再悬浮于K3AM培养液中。
(9)在26℃，将5ml离心管中的原生质体遮光培养20小时，进行瞬时表达。
(10)首先用W5溶液将原生质体稀释3倍，然后2000rpm，7分钟离心收集原生质体。
(11)将沉淀再悬浮于500ul的GUS酶提取缓冲液中并转移到1.5ml的离心管中。交替地将样品在液氮和37℃水浴中进行3次各3分钟左右的反复冻融后，4℃条件下8000rpm离心5分钟沉淀细胞碎片，再分析上清液中酶活性。提取液可在-80℃条件下保存若干星期而不会丧失活性。
(12)用微量Bradford法测定上清部分的蛋白质浓度。在测定蛋白质浓度时，加入到染色试剂中的上清液需20ul。
3、GUS的荧光测定(1)对各样品进行测定时，预先准备200ul，2mmol/l的MUG溶液于微量离心管中，在37℃下水浴5分钟。加入200ul细胞提取液，搅动均匀后，再进行水浴。
(2)15分钟后，从每支待测管中取出200ul转移到预先加有1.8ml终止缓冲液的试管中，摇动均匀。
(3)用荧光计在激发光波长为362nm，发射波长为450nm下所产生的MU浓度作定量分析。用终止缓冲液将MU贮液稀释来配成浓度范围在0-10umpl/l的一系列MU标准液，通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。
(4)根据各稀释样品的荧光强度可计算出初始反应中未稀释产物的浓度。对每一个样品，空白对照(未用DNA做电击转化的样品)值被扣除。
本实施例用烟草原生质体瞬时表达系统，通过PEG介导的转化方法，把载体pB2、pB8、pB9和pBI121分别导入到烟草原生质体中，24小时之后，破碎细胞，离心取上清液，用MUG作为底物测GUS酶的活性。分解生成的4-MU在激发波长362nm，产生发射波长450nm的荧光，由荧光分光光度计可测得相对荧光数值，利用公式相对荧光强度×1.5×10-3umol/l÷蛋白质浓度(mg/ml)计算GUS活性。结果如图3所示，表明rbcSc启动子的转录活性是rbcSZm1的3.5倍，是35S启动子的1.3倍；rbcSo启动子的转录活性是rbcSZm1的1.6倍，是35S启动子的0.6倍。
实施例5、rbcSc启动子在玉米愈伤组织、水稻愈伤组织、小麦愈伤组织、苜蓿植株中的活性将植物表达载体pB2、pBI121和pB9用农杆菌转化的方法在玉米愈伤组织、水稻愈伤组织、小麦愈伤组织、苜蓿植株上进行转化，以检测启动子rbcSc在不同物种中的活性。
农杆菌介导的瞬时表达检测具体步骤如下1、农杆菌感受态的制备及转化(1)挑取LBA4404单菌落于3mlYEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振荡培养过夜。
(2)取过夜培养菌液500ul，接种于50mlYEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振荡培养至OD600＝0.5。
(3)5000rpm离心5分钟。
(4)加10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm离心5分钟。
(5)1ml预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，24小时内使用或分装成200ul，液氮中速冻1分钟，-70℃保存。
(6)取200ul感受态细胞，加入1ug构建好的质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃，5分钟。
(7)加入1mlYEB，28℃慢速培养4小时。
(8)1000rpm离心30秒，弃上清，加入0.1mlYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100ug/ml卡那和100ug/ml Sm的YEB平板上，28℃培养48小时。
2、转化、染色及检测挑取步骤(8)中的单菌落于卡那和Sm抗生素的YEB液体培养基中28℃振荡培养24小时，取50ul菌液加入到3ml新鲜培养基，振荡培养，10小时。转化时取1ml菌液，加入9ml培养基稀释。将植物组织材料浸入提前准备好的农杆菌菌液中5分钟后取出，用无菌滤纸将愈伤上面的菌液吸干，然后放在MS分化培养基(MS+2mg/lBA+0.2mg/l IAA)上，培养三天后放入GUS染色缓冲液(50mmol/l磷酸钠(pH7.0)；1mmol/l EDTA；1mmol/l铁氰化钾；1mmol/l亚铁氰化钾；0.5mg/ml X-gluc(X-gluc溶液；10mg X-gluc溶于1ml N-N-二甲基甲酰胺中)；0.05％ Triton-100)中，37℃染色过夜，观察并照相。结果如图4、图5、图6和图7所示，表明rbcSc启动子在苜蓿、水稻、玉米、小麦中均具有转录活性。图4、图5、图6和图7中，左侧部分为pB9，中间部分为pB2，右侧部分为pBI121。
序列表<160>3<210>1<211>655<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.一种植物启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的植物启动子，其特征在于它的编码序列是序列表中的SEQ ID №1。
3.含有权利要求1所述启动子的细胞系。
4.含有权利要求1所述启动子的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为植物表达载体pB2。
6.权利要求1所述启动子在培育转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物启动子及其应用，本发明所提供的植物启动子rbcSc，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。rbcSc启动子可代替35S启动子作为植物转基因的工具启动子，可广泛用于培育具有较高生物安全性的单子叶和双子叶转基因植物。
文档编号C12N5/10GK1603409SQ03134800
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月30日 优先权日2003年9月30日
发明者王涛, 刘礼兵, 袁媛 申请人:中国农业大学