专利名称：人表皮干细胞的分离与培养方法
技术领域：
本发明属生物细胞技术领域，涉及一种人表皮干细胞的分离和体外培养方法。
背景技术：
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的原始细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞具有自我更新及无限增殖能力、能够产生高度分化的功能细胞。由于干细胞的特性，为人类在制备自体细胞、组织、器官，及在治疗癌症、先天免疫性疾病等疑难杂病的领域中提供一种新的思路。目前国际上干细胞的研究主要集中于胚胎干细胞建系及向成熟组织细胞诱导的机理；成体干细胞横向分化的诱导；各种组织成体干细胞库的建立；干细胞的临床试验及细胞移植的免疫排斥的研究。
最近研究表明，在成体组织及器官中普遍存在着特异的成体干细胞，问题是如何寻找和分离各种特异性成体干细胞。且成体干细胞经常位于特定的微环境中，该环境内存在一系列的生长因子或配体，使干细胞与邻近细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。
表皮干细胞存在于皮肤与粘膜的基底层中，在维持皮肤与粘膜正常组织结构和细胞内环境稳定中起重要作用。目前，基因治疗成为热点，在遗传性皮肤病的治疗中，要达到基因治疗目的，必须把目的基因导入表皮干细胞中，才能在患者整个机体皮肤中得到该基因的产物。另外随着发育生物学的发展，发现在受损皮肤和粘膜功能与结构的重建方面，表皮干细胞也有着极其重要的作用。
研究表明，表皮干细胞在体外培养中仍然存在，且性质与在体内时相类似。表皮干细胞目前虽无特异性标识分子，但相对特异性表达角蛋白19并高表达β1整合素。该类细胞对IV型胶原、纤维粘连素及细胞外基质的粘附速度要比表皮中其它类型细胞快，现在对表皮干细胞的鉴别多利用β1整合素的高水平表达，及对细胞外基质的快速粘附特性的特点进行。Graziella P等利用纤维蛋白原及凝血酶作为底物分离人表皮干细胞(J Transplan，1999，68(6)1-12)，Jone PH等利用上述方法从人包皮(Cell，1993，73713-724)或尸体皮(Cell，1995，8083-93)中，利用IV型胶原做底物分离表皮干细胞，所选用底物价格昂贵，不适合大规模或长期培养；Van Rossum MM等(JImmunol Methods，2002，267109-17)从人的小块活检组织中得到角朊细胞(也称表皮细胞)，利用流式细胞仪分离，选用方法复杂且技术要求高，不便于推广，且培养中都使用鼠的3T3细胞作为滋养层，由于两种细胞不同种属，不能很好保证人表皮干细胞所处的微环境，并有可能为以后的应用增加外源性危险因素。另外，在长期培养小鼠的表皮干细胞方面，Hagar B等人(JInvest Dermatol，1999，112971-976)及Dunnwald M等人(Exp Dermatol，2001，1045-54)利用50％DMEM、50％低钙离子鼠成纤维细胞条件培养液作为培养基，不用滋养层细胞。但有研究发现若表皮干细胞与基底膜脱离，则会进入分化周期，分化为过渡性扩充细胞，因而对基底膜的高粘附性有可能是维持表皮干细胞特性的基本条件之一。所以如果不利用滋养层，有可能不能保证长期培养过程中表皮干细胞的干细胞特性。迄今为止，体外长期培养的人表皮干细胞在国内外鲜见报道。而表皮干细胞生物学性能，可以做到增进功能、避免潜在有害基因及对表皮干细胞不同分化方向选择，在基因治疗及损伤粘膜和皮肤修复、组织工程皮肤的构建方面等均有重要的指导意义。
发明内容
针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种人表皮干细胞分离和体外培养的方法，并使获得的表皮干细胞克服以上缺陷。
本发明方法包括有细胞外基质覆盖平皿的预备，表皮细胞的分离，滋养层细胞的制备，表皮干细胞的筛选及培养；上述细胞外基质、表皮干细胞中所需的表皮细胞以及用作滋养层细胞的成纤维细胞都来源于同一个体的皮肤；表皮细胞是将所得皮肤用酶消化和机械分离方法获得。具体过程是将皮肤组织用含抗菌素的磷酸盐缓冲液清洗；置蛋白酶液中消化；剥离表皮与真皮层；收集表皮皮片，置0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液中消化，终止消化后，稍加吹打，过滤后收集表皮细胞悬液，所得表皮细胞一部分用作制备细胞外基质，一部分用于筛选表皮干细胞。成纤维细胞的获取是同时收集真皮皮片，置于胶原酶液中，消化后收集成纤维细胞悬液，用于滋养层细胞的培养；本发明的特征在于1.所述细胞外基质覆盖平皿预备的具体步骤为将所得表皮细胞接种于平皿内，培养至汇合，吸去培养液；加入乙二胺四乙酸(EDTA)和三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris HCL)和曲拉通(Triton)混合液，置37℃孵育至镜下可见细胞裂解；用PBS缓冲液清洗平皿；加入变性后的牛血清白蛋白，置37℃孵箱60-90分钟，以封闭非特异性粘附；PBS清洗平皿，加入无血清培养液，置孵箱中直至应用；
2.所述滋养层细胞的制备的具体步骤为取同一个体皮肤的成纤维细胞培养至汇合，加丝裂霉素C至终浓度为10-6mol/L，37℃孵育过夜，用0.25％胰酶消化，终止消化，离心弃上清，重悬细胞，备用；3.所述表皮干细胞的筛选及培养的具体步骤为取准备好的覆盖有细胞外基质的平皿，加入新鲜分离的表皮细胞悬液(浓度0.5～2×103/ml)，置37℃孵箱10-30分钟，吸弃液体，PBS清洗至无细胞悬浮，其中贴壁细胞为表皮干细胞；加入滋养层细胞(密度0.3～1×104/cm2)和KSC培养液培养，第2天换液，以后每3天换液一次；细胞长至汇合，以0.25％胰酶/0.02％EDTA消化传代。其中KSC培养液含有胎牛血清和碱性成纤维生长因子。
4.检测表皮干细胞的特征体外培养观察到细胞呈克隆性生长，生长周期长，有明显的接触生长抑制；流式细胞仪检测其细胞周期，结果表明大部分细胞在G0/G1期，处于相对静止状态，符合干细胞特性。最后需要进行的是免疫组化检测，其方法是取筛选的细胞及稳定培养10、20、60、120 PD的细胞做甩片，分别滴加一抗(角蛋白19单抗、β1整合素单抗、角蛋白10单抗、抗波形丝蛋白单抗)，结果显示β1整合素单抗100％阳性、角蛋白19单抗约为94％-97％阳性，角蛋白10单抗、抗波形丝蛋白单抗均为阴性，呈现表皮干细胞特征。
上述方法中所述的KSC培养液所含有的必须成份有商用最低必需培养液DMEM、商用培养液Ham’s F12、胎牛血清、氢化可的松、霍乱毒素、腺嘌呤、青霉素或链霉素、碱性成纤维细胞生长因子。所述的KSC培养液可以添加的成份有氯化钙、转铁蛋白。
图1为本发明的人表皮干细胞体外培养过程中形成的克隆显微照片。
图2为本发明的人表皮干细胞流式细胞仪检测结果图。
附图1表示本发明的人表皮干细胞在体外培养过程中形成的细胞克隆，图中右上部分是形成的细胞克隆，可见细胞排列紧密，细胞胞体较小，呈多角形；而周边较稀疏的呈长梭形者是滋养层细胞。
附图2是本发明的人表皮干细胞经流式细胞仪检测的结果，表明大部分的细胞处于G0/G1期，具慢周期性特点。
具体实施例方式
取(人)健康男性包皮环切术后的包皮皮肤，制备表皮细胞和成纤维细胞。
1.表皮细胞(角朊细胞)的分离取1-2cm长、2mm左右宽的皮肤，以含抗菌素的PBS清洗3次；置蛋白酶液中，4℃消化16小时；取出皮肤，剥离表皮与真皮层；收集表皮皮片，置0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液中，37℃消化10-15分钟，终止消化，稍加吹打后过滤，收集细胞悬液，离心弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，调整细胞浓度至1×103/ml。
2.滋养层细胞的制备收集上述表皮与真皮层剥离后的真皮皮片，置于625U/ml胶原酶液中，消化后收集成纤维细胞悬液，将成纤维细胞培养至铺展80％左右，加丝裂霉素C至终浓度为10-6mol/L。37℃孵育12小时取出，用0.25％胰酶37℃消化3-5分钟，终止消化，离心5分钟(800-1000r/分钟)，弃上清，重悬细胞，备用。
3.细胞外基质覆盖平皿的预备在平皿内将上述表皮细胞(也称角朊细胞)培养至汇合(约10-14天)；表皮细胞汇合后，吸去培养液，用无菌PBS清洗；加入乙二胺四乙酸(10mmol/L)和三羟甲基氨基甲烷盐酸(25mmol/L)和曲拉通(1％(w/v))混合液，37℃孵育(30分钟)至镜下可见细胞裂解；用PBS清洗；再加入0.5mg/ml变性的牛血清白蛋白，置37℃孵育1小时，以封闭非特异性粘附；PBS清洗，加入无血清培养液，置37℃孵箱至应用。
4.表皮干细胞的筛选及培养取预备好的覆盖有细胞外基质的平皿，加入2ml表皮细胞悬液，37℃培养10分钟取出，吸弃液体，PBS清洗至无细胞悬浮，贴壁细胞为表皮干细胞。加入滋养层细胞(4×103/cm2)，用KSC培养液培养，第2天换液，后每3天换液一次。其中KSC培养液含5％胎牛血清和1ng/ml碱性成纤维生长因子。本发明中，表皮干细胞的培养在不同阶段中，所用KSC培养液中胎牛血清的含量可以调整，并添加不同的生长因子。
5.传代培养上述表皮干细胞长至汇合，以0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液，37℃消化3-6分钟，终止消化；收集细胞悬液入离心管，离心5分钟，弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，以2×105/ml的密度接种于预先铺加有滋养层细胞的培养瓶中，置37℃、5％CO2孵箱中培养。
6.细胞检测免疫组化检测结果细胞甩片β1整合素100％表达、角蛋白19有95％表达，角蛋白10、抗波形丝蛋白阴性；透射电镜结果培养的细胞，胞体较小，核浆比大，核仁明显，游离核糖体多，细胞器发育不成熟，相对稀少；流式细胞仪检测结果表明G0/G1期细胞所占比例为77.2％。将表皮干细胞以1×107/ml的浓度种植在含有同一个体成纤维细胞的胶原凝胶的表面，进行器官培养，病理切片观察证实可以形成全层分化表皮。在动物体内实验中，以2×107细胞接种于裸鼠皮下4-8周，无肿瘤形成。
本发明的表皮干细胞及其制备方法具有以下优点(1)特异性强，通过免疫组化检测、透射电镜观察及流式细胞仪检测，结果表明本发明的表皮干细胞纯度较高；(2)实用有效，利用同一个体角朊细胞裂解，产生以纤维粘连素为主要成分的细胞外基质对表皮干细胞进行筛选，方法简单经济；利用筛选的表皮干细胞在器官培养中可以形成成熟的全层分化表皮。另外，利用同一个体成纤维细胞作为滋养层，分泌生长因子及细胞间的相互作用，可以创造一更近似于体内的微环境，同时避免了以后应用于临床的异源性危险因素。
表皮干细胞由于其自身特性，具有多方面的应用前景，其中包括(1)、组织工程皮肤构建中的应用皮肤直接与外界环境接触，是人体的屏障，由外伤、严重烧伤、大面积瘢痕切除等所致大面积缺损时，致机体不能保持正常自稳状态，甚至能导致死亡，因此需要其类似物早期覆盖创面，恢复皮肤的屏障功能。随着组织工程学的兴起，可利用培养的表皮细胞进行自体或异体皮片覆盖创面，但目前培养的皮片有耗时、抗拉力差、抗感染力差以及费用高等缺点影响临床应用，且同时由于角朊细胞增殖能力有限，会影响到愈后皮肤的正常功能并以受到外界因素的损伤。如果利用表皮干细胞培养产生皮片，其中的表皮干细胞可仍保持自我更新能力，维持更新，并有一定的分化潜能(可向全层分化表皮、毛囊、皮脂腺方向分化)，有利于促进更好的修复。
(2)、创伤修复中的应用由于表皮干细胞具有自我更新能力和强的增殖能力，也可直接应用于皮肤及口腔粘膜创面，促进创伤的愈合修复；另外，由于角膜细胞是由角膜干细胞(属于表皮干细胞)分化而来，在维持角膜的形态及功能中起重要作用，因而表皮干细胞在对角膜的创伤修复中也可能会起到一定的作用。
(3)、在基因研究方面由于表皮干细胞的终生存在性，在研究基因的作用及某些皮肤病的基因机制方面，可起到重要作用。
(4)、遗传性疾病的治疗可利用基因转染表皮干细胞，对其进行基因水平的改造，对遗传性皮肤病进行基因治疗。另外在某些全身遗传性疾病的治疗中，也会起到一定作用，比如糖尿病的治疗，转基因后构建组织工程皮肤应用于糖尿病溃疡的覆盖治疗，同时可释放一定的治疗因子，对糖尿病起到一定的治疗作用。
(5)、细胞谱系的研究表皮干细胞首先向过渡扩充性细胞分化，继而分化为分裂后细胞、终末分化细胞，可为研究细胞谱系提供便利的模型。
上述结果表明，本发明的人表皮干细胞具有强的增殖能力，并可形成全层分化表皮。随着对表皮干细胞认识的进一步深入，通过不断的探索研究，其应用前景将更加广阔。
权利要求
1.一种人表皮干细胞的分离及体外培养方法，包括有细胞外基质覆盖平皿的预备，表皮细胞的分离，滋养层细胞的制备，表皮干细胞的筛选及培养。所述细胞外基质、表皮干细胞中所需的表皮细胞以及用作滋养层细胞的成纤维细胞都来源于同一个体皮肤；表皮细胞是将所得皮肤用酶消化和机械分离方法获得，其特征在于所述细胞外基质覆盖平皿预备的步骤为将表皮细胞接种入平皿内，培养至汇合，换液加入乙二胺四乙酸EDTA和三羟甲基氨基甲烷盐酸和曲拉通混合液孵育；再换液加入变性的牛血清白蛋白孵育60-90分钟，清洗后备用；所述滋养层细胞制备的步骤为取同一个体皮肤的成纤维细胞培养至汇合，加丝裂霉素C孵育；所述表皮干细胞的筛选及培养具体步骤为预备好的覆盖有细胞外基质的平皿中，加入表皮细胞悬液，孵育后吸弃液体，用磷酸盐缓冲液清洗，贴壁细胞为表皮干细胞；用滋养层细胞和KSC培养液进行培养；用胰酶/EDTA混合液消化传代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述表皮干细胞培养时，加入滋养层细胞的密度为0.3～1×104/cm2。
3.根据权利要求1所述的人方法，其特征在于表皮干细胞的筛选过程中，所加入表皮细胞悬液的细胞浓度应达到0.5～2×103/ml，并于37℃孵育10-30分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的KSC培养液所含有的必须成份有最低必需培养液DMEM、商用培养液Ham’s F12、胎牛血清、氢化可的松、霍乱毒素、腺嘌呤、青霉素或链霉素、碱性成纤维细胞生长因子；可以添加的成份有氯化钙、转铁蛋白。
全文摘要
本发明属生物细胞技术领域，涉及一种人表皮干细胞的分离与培养方法。方法特征包括细胞外基质覆盖平皿的预备；表皮细胞的分离；滋养层细胞的制备；表皮干细胞的筛选及培养。目前用该法在体外已稳定培养传代超过120PD，经体内外实验证实该细胞无致瘤性，具有强的增殖能力，并可以形成成熟的全层分化表皮，为有关表皮干细胞在科研、教学及临床的应用起到不可估量的作用，同时孕育着巨大的社会效益和经济效益。
文档编号C12N5/08GK1590538SQ03134538
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者金岩, 董蕊 申请人:中国人民解放军第四军医大学口腔医学院