专利名称：一种使皮肤成纤维细胞永生化的方法
技术领域：
本发明属于遗传工程中对细胞进行修饰的细胞融合技术领域，涉及一种使皮肤成纤维细胞永生化的方法。
背景技术：
人类和动物中那些经过自发的或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖的能力的细胞，称之为“永生化”细胞。自发永生化细胞的几率非常小，啮齿类动物为10-5～10-6，而人的细胞则更为罕见，小于1012。因此，学者们通过基因转染等技术，将外源性基因转入目的细胞，或诱导衰老相关基因突变，以增加永生化的发生机率。随着生物医学工程技术的不断发展，使得永生化成纤维细胞作为细胞生物学的标准细胞或组织工程的种子来源，成为迫切需要解决的当务之急。目前，国内外在此技术领域中也开展了不少的工作，涉及皮肤成纤维细胞永生化的方法主要有以下几种SV40法SV40大T抗原是60年代发现的一种猴肾细胞病毒，人为其自然宿主，它有结构蛋白(VP1，VP2，VP3)和两种抗原LT和st组成。1983年lubbe L等选择三例Lesch-Nyhan患者的皮肤成纤维细胞培养后，利用SV40大T抗原进行转化，成功将其培养到200代以上。转化后的细胞表现对血清的要求降低，呈现复层生长，无接触抑制现象，无锚着依赖性可在软琼脂中生长。以后有人先后将其应用于Wilms瘤等病人皮肤成纤维细胞的转化，细胞寿命明显延长。由于对SV40的认识已比较全面，所以被广泛用于生命期、衰老和永生化机理的研究。但是以上所述的细胞均来源于病体，即所获得的细胞是非正常的。正常体细胞的基因转染相对较难，在少数转染成功的细胞中都是以病毒作为介质。利用病毒转染的细胞只能用于基础研究，若将其作为治疗用细胞或组织工程的种子细胞，则存在诱发肿瘤或其它疾患的可能性。
端粒酶法端粒酶是近年来生命科学研究的新热点。运用端粒酶来延长细胞的生命周期，也是永生化的一个新领域。端粒(telomere)是位于染色体末端具有特殊功能的DNA帽，它在稳定染色体及防止染色体末端融合等方面具有重要的作用。随着细胞分裂次数的增加，端粒进行性缩短，当缩短到一定的限度即不能维持染色体的稳定时，细胞失去分裂增殖的能力，进而衰老死亡。端粒酶(telomerase)则是催化合成并维持端粒一定序列的核糖核蛋白，由RNA和蛋白组成，具有逆转录酶的活性。其中端粒酶的催化亚单位〔被命名为hTERT〕在端粒酶的激活中起关键作用。1996年，Wight等首次发现端粒的缩短会导致细胞的增殖危机。1998年Homayoun等，在正常的缺乏端粒酶活性的人的二倍体成纤维细胞中转入端粒酶催化亚单位，结果表明，由病毒介导的hTERT的表达激活了正常细胞端粒酶的表达，进而导致端粒DNA的增长和细胞生命周期的延伸。端粒酶异位表达的正常人成纤维细胞，其体外培养超过170PD，至今仍在培养中。
放射性因素法1996年，Razmik等从高剂量原子弹辐射后的幸存者身上得到了自发永生化的皮肤成纤维细胞。此后相继产生了X射线、电离辐射、50Co等放射性因素进行细胞永生化的方法，多可使细胞生命周期得到延伸。推测可能是由于放射性元素破环了维持衰老机制的稳定性，促进了与生命延长相关基因的表达。
癌基因、抑癌基因法基于癌基因、抑癌基因的生物学特性，有人用ras，c-myc，N-myc，c-fos，Ab5等原癌基因进行细胞转染，或使抑癌基因突变，进行细胞转化后发现，单独利用癌基因转化原代成纤维细胞永生化的情况非常少见，甚至促进了细胞的衰老。而对于传代细胞有一定的促生殖作用。例如，c-myc的表达恢复了端粒酶的活性，并使P53发生突变，阻断了NK4A/ARF通路，而后两相事件又反过来促进了端粒酶的活性，进而促进永生化。
其他方法此外还有人利用HPV、四硝基喹啉一氧化物、黄曲霉毒素等，或以上几种方法联合使用转化成纤维细胞。
在以上几种转化方式中，虽然所有实验尚不能明确细胞在永生化过程中所发生的变化，但给了我们新的启示，那就是在发挥LT抗原灭活P53和PRb两种蛋白的基础上，再转入外源性的hTERT，恢复端粒酶的活性，有可能使细胞发生永生化转变或提高永生化转变率。
发明内容
根据上述现有技术状况，本发明的目的在于，继前人已经进行的研究工作，提出一种在猴肾细胞病毒(SV40大T抗原)转染人皮肤成纤维细胞的基础上，再对其进行端粒酶催化亚单位(hTERT)的转染，以期获得具有稳定生物学性状并能够长期传代的皮肤成纤维细胞系方法，使该细胞的获得可对皮肤组织工程的体外实验提供标准化的细胞，有利于组织工程皮肤构建标准的建立。并力求使该细胞应具有如下特征(1)与正常细胞相比，永生化细胞系可在体外长期传代，至少在50代以上。
(2)具有相对稳定的，与正常细胞接近的生物学性状。无致瘤性，可在体外合成分泌I型、III型胶原，并有能力修复病损的组织。
根据上述构思和所设计永生化成纤维细胞特征的要求，本发明使皮肤成纤维细胞永生化的方法，其特征在于将猿猴病毒40大T抗原LT的互补脱氧核糖核酸cDNA和带有荧光蛋白表达基因的人端粒酶催化亚单位hTERT的cDNA，共同转染皮肤成纤维细胞，以建立永生化细胞系，包括以下步骤步骤l培养原代皮肤成纤维细胞；步骤2分别用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亚单位hTERT转染成纤维细胞，并进行转染后鉴定；步骤3带有荧光蛋白表达基因和端粒酶催化亚单位hTERT cDNA的载体pIRES2-EGFP-hTERT的构建；步骤4LT、hTERT共转染成纤维细胞取已转染LT的细胞进行pIRES2-EGFP-hTERT的转染，利用荧光显微镜分离获得阳性克隆，并进行扩大培养。
所述的步骤1原代皮肤成纤维细胞培养的过程为；应用酶消化法获取正常人皮肤成纤维细胞，使细胞贴壁后呈典型的纤维细胞样生长，用抗波形丝蛋白Vimentin抗体免疫组织化学染色，确定皮肤成纤维细胞。
所述的步骤2用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亚单位hTERT转染成纤维细胞的过程为(1)将传至第16代的皮肤成纤维细胞，接种含有LT和hTERT的质粒，用氨基甙类药物筛选后扩大培养；(2)双酶切含有LT和hTERT cDNA的质粒psv3-neo和pCl-Neo-hTERT；(3)将酶切后所得片段进行地高辛标记，将其作为脱氧核糖核酸DNA探针；
(4)取标记好的探针对转染后第3代和第16代细胞进行原位杂交检测，解剖显微镜下观察LT、hTERT信使核糖核酸mRNA的表达情况。
所述的步骤3构建的有荧光蛋白表达基因和端粒酶催化亚单位hTERTcDNA的载体pIRES2-EGFP-hTERT的过程为(1)pIRES2-EGFP质粒和PCL-Neo-hTERT质粒同时用内切酶进行双酶切；(2)将上述酶切后的产物在琼脂糖凝胶上电泳，用DNA回收试剂盒进行回收；(3)DNA片断水浴连接；(4)取感受态细菌融化后，加入连接产物，进行转化；(5)克隆扩大培养后进行质粒提取，提取的质粒进行双酶切和单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带，确定构建成功的载体。
所述的步骤4取已转染LT的细胞进行pIRES2-EGFP-hTERT的转染，实现LT和hTERT cDNA的共转染，过程为(1)以时间为横轴，细胞倍增次数(即PD)为纵轴绘制细胞生长曲线；(2)采取有限稀释法，获得单个细胞克隆；(3)核型分析取转染并筛选后的处于对数生长期的转化细胞，进行核型分析检测；(4)取转染后的细胞注入到裸鼠皮下，进行致瘤性检测；(5)利用图象分析系统进行胶原分泌能力检测。
图1以时间为横轴、细胞倍增次数(即PD)为纵轴绘制的细胞生长曲线。
图2转染并筛选后的处于对数生长期的转化细胞核型分析图例。
图3三种转染细胞胶原分泌能力比较图。
上述附图结合下述具体实施例可对本发明做进一步了解。
具体实方式1.原代皮肤成纤维细胞的培养具体过程为应用酶消化法获取正常人皮肤成纤维细胞。细胞贴壁后呈典型的纤维细胞样生长。抗波形丝蛋白(即Vimentin)抗体免疫组织化学染色，结果显示，细胞浆为棕黄色，胞核不着色，呈阳性表达。对照组细胞中无着色，均为阴性，确定该细胞为皮肤成纤维细胞。
2.分别用LT、hTERT转染成纤维细胞并进行转染后的鉴定方法为1)将传至第16代的皮肤成纤维细胞，接种到六孔板，每孔细胞数为2×105，次日进行转染。转染前将培养液换为无血清的DMEM培养液。取50μl无血清DMEM培养液，分组加入0.8-1.0μg含有LT cDNA的质粒psv3-neo和含有hTERT cDNA的质粒pCl-Neo-hTERT，再吸取50μlDMEM培养液，加入脂质体1-3μl，室温孵育5分钟后.将两者混合，继续孵育20分钟后直接将混合液加入培养液，轻轻摇匀。将转染细胞放入37℃ CO2孵箱中培养。转染后6小时换为正常培养液，细胞接近汇合时，按1∶10密度传代，继续培养.待密度接近50％～70％时，加0.4g/L的G418进行筛选，未转染细胞作为对照。待出现抗性克隆，滤纸法分离细胞克隆，重新接种培养。分别取转染后第3代和第16代细胞进行检测。
2)EcoRI/PvuII双酶切质粒psv3-neo，EcoRI/SalI双酶切质粒pCl-Neo-hTERT。
酶切反应液为脱氧核糖核酸DNA 3μg10倍浓度的酶切缓冲液 2μl内切酶I 1μl内切酶II 1μl用去离子双蒸水使总体积达 20μl将上述酶切后产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳后，分离片段，按照DNA回收试剂盒说明书进行片断回收，分光光度法测定回收后DNA的含量。
3)吸出(1-3μg)回收后的DNA在沸水中热变性10分钟，放入氯化钠冰中骤冷，按照DNA回收试剂盒说明书进行片断的地高辛标记，将其作为DNA探针。
4)取出标记好的探针离心，推算出标记后可能标记上的探针量，用杂交液稀释，使其浓度为1-2μg/ml。分别取转染后第3代和第16代细胞爬片，滴加探针，进行原位杂交检测，观察LT、hTERT mRNA的表达情况(正常细胞作为阴性对照)。
5)分别取转染后第3代和第16代细胞爬片进行抗LT或抗hTERT抗体的常规免疫组织化学检测(染色的同时用PBS代替一抗作为阴性对照)。
3.带有荧光蛋白表达基因和hTERT cDNA载体pIRES2-EGFP-hTERT的构建过程为1)pIRES2-EGFP质粒(含有荧光蛋白表达基因)和PCL-Neo-hTERT质粒同时用EcoRI、SalI内切酶进行双酶切。
酶切反应液为DNA3μg10倍浓度的酶切缓冲液 2μl内切酶I1μl内切酶II 1μl用去离子双蒸水使总体积达 20μl37℃酶切3小时。
2)将上述酶切后的产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，使载体与外源基因片段充分分离；分别切下含有hTERT的长为3.45kb的目的基因片段和长为5.3kb的载体片段胶条，用DNA回收试剂盒(上海华舜)进行回收。
3)DNA片段连接，其反应液为目的基因片段 0.3μg载体DNA0.1μg10倍浓度的连接缓冲液 2μlT4DNA连接酶1μl用去离子双蒸水使总体积为 20μl16℃水浴反应12-16小时。
4)取DH5α感受态细菌融化后，加入连接产物混匀，冰上放置30分钟，42℃休克90秒；冰上冷却1-2分钟；加入450μl预热的LB培养液，37℃缓慢振荡培养1小时；将培养物转至含卡那霉素的琼脂板上涂匀；待液体被完全吸收后倒置平皿，37℃培养12-16小时。
5)从琼脂板中挑取单菌落接种与含卡那霉素的培养液中，37℃振荡培养过夜。进行质粒提取，提取的质粒进行EcoRI、SalI双酶切，和SalI单酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带，确定构建成功的载体。
4.LT、hTERT共转染成纤维细胞具体过程为取已转染LT的细胞进行pIRES2-EGFP-hTERT的转染(方法同前)，利用荧光显微镜分离获得阳性克隆，并进行扩大培养。
5.三种转染细胞生物学行为的比较的具体方法为1)以时间为横轴，细胞倍增次数(即PD)为纵轴绘制细胞生长曲线(见图1)。可以看出正常细胞在接近60PD时，开始出现增殖缓慢，此后在相当长的时间内，一直处于这种缓慢增殖状态；转染LT的细胞在最初的1-2个月内，迅速扩增，其增殖速度是所有细胞中最快的，但在接近70PD时，速度急速减慢，处于不增殖状态，细胞数量不但没有增加而且逐渐减少，直到最后死亡；转染hTERT的细胞虽然在一段时间内保持类似于正常细胞的增殖速率，与正常组相比，明显地延长了细胞的体外培养寿命，但最终不能逃脱衰老的发生；只有LT-hTERT组细胞一直处于旺盛的增殖状态，至今细胞的总代数已超过50代。
2)收集待检细胞，75％的乙醇4℃固定检测(每份细胞数量为5×105～1×106)。流式细胞仪检测细胞周期结果如下Group G1S G2+MPrI(S+G2+M)P3 N 75 10.814.2 25.0P32 N 80.8 11.87.4 19.2P3 LT 69.9 15.814.3 30.1
P16 LT91.85.8 2.48.2P3 hTERT 74.320.84.925.7P30 hTERT 80.218.21.519.7P30 LT-hTERT 74.815.59.725.2表中，P3 N、P32 N为第3、32代正常细胞；P3 LT、P16 LT为转染LT后第3、16代细胞；P3 hTERT、P30 hTERT为转染hTERT后第3、30代细胞；P30 LT-hTER为共染LT、hTERT后第30代细胞。表中G1、S、G2、M为细胞生长周期的不同阶段。
由表中可见，P3 LT组的细胞增殖指数最大，而P16 LT组的增殖指数又变为最小，其间由大到小依次排列的是P3 hTERT、P30 LT-hTERT和P30 hTERT。这与生长曲线所反映的趋势一致。
3)核型分析 取转染并筛选后的处于对数生长期的转化细胞，于检测前一天消化传代，次日细胞达60-80％，进行核型分析，结果表明核型均属正常。见图2。
4)致瘤性检测取对数生长期的转化细胞，用无血清DMEM制备成单细胞悬液。选8只6周左右的裸鼠，两侧各选一注射点，以107/ml密度的细胞，注射到裸鼠皮下。舌癌细胞系T8113作为对照组。细胞种入裸鼠皮下2月后，进行观察，发现对照细胞组裸鼠背部长出2×2cm大小的肿瘤，而LT组、hTERT组、LT-hTERT均未见肿瘤出现。
5)胶原分泌能力检测取对数生长期的转化细胞消化计数、调节细胞悬液至同一密度，做细胞爬片(正常皮肤成纤维细胞作为对照)。12小时后4％多聚甲醛固定，PBS冲洗。细胞经0.3％Triton X-100/PBS、H2O2/PBS处理后，将LT、hTERT、LT-hTERT和正常细胞分别分为两组，每组含10个标本。第一组滴加抗I型胶原抗体，第二组滴加抗III型胶原抗体，4℃过夜；37℃复温1小时，滴加生物素化二抗37℃温育1小时(上述各步之间均经PBS缓冲液充分漂洗)；显色液(终浓度为0.5g/L DAB)用0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液(PH7.6)与DAB和新鲜的H2O2配制，进行显色。(染色的同时用PBS代替一抗作为阴性对照)。染色后的标本应用图像分析系统做蛋白灰度值测定。将测得数值进行统计学分析，四组标本之间无显著性差异P＞0.05。说明转染后的细胞其胶原分泌同正常细胞无显著性差别，见图3。
本实验中采用较为安全的脂质体作为介质结合含有目的基因的质粒，针对SV40T抗原和hTERT cDNA单独转染成纤维细胞效果不佳，很难获得长期稳定传代细胞的情况，在本实验中采用SV40T抗原和hTERT cDNA联合转染的方法。而且有人用SV40T和hTERT联合用于乳房腺上皮细胞，并有实验已证明，两者联合转染的效果远远优于单独转染的效果，间接地证实了该方法和可行性。为了避免两种带有相同筛选基因的质粒转染后出现的假阳性结果(若细胞只转染了SV40T或只转染了hTERT，都可存在抗药性而存活)，我们将原有质粒的hTERT cDNA接合到新的带有荧光蛋白表达基因的载体上，建立了完全不同的筛选系统，达到SV40T和hTERT cDNA联合转染成纤维细胞的目的。
本发明方法建立的细胞系可在体外长期传代，与单独转染LT cDNA或hTERT cDNA的皮肤成纤维细胞相比，显著延长了皮肤成纤维细胞的体外培养寿命，目前为止无衰老表征出现。转化细胞的蛋白分泌功能与正常细胞无明显差异，其核型和分泌功能类似正常细胞。与其它方法相比，该方法获得的细胞具有与正常细胞接近的生物学性状、核型正常、无致瘤性，可在体外正常合成分泌I型胶原。本方法获得的细胞不仅有助于进一步研究细胞永生化发生的机理，而且可以成为解决组织工程中种子细胞来源的行之有效的方法。
权利要求
1.一种使皮肤成纤维细胞永生化的方法，其特征在于将猿猴病毒40大T抗原LT的互补脱氧核糖核酸cDNA和带有荧光蛋白表达基因的人端粒酶催化亚单位hTERT的cDNA，共同转染皮肤成纤维细胞，以建立永生化细胞系，包括以下步骤步骤1培养原代皮肤成纤维细胞；步骤2分别用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亚单位hTERT转染成纤维细胞，并进行转染后鉴定；步骤3带有荧光蛋白表达基因和端粒酶催化亚单位hTERT cDNA的载体pIRES2-EGFP-hTERT的构建；步骤4LT、hTERT共转染成纤维细胞取已转染LT的细胞进行pIRES2-EGFP-hTERT的转染，利用荧光显微镜分离获得阳性克隆，并进行扩大培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1原代皮肤成纤维细胞培养的过程为应用酶消化法获取正常人皮肤成纤维细胞，使细胞贴壁后呈典型的纤维细胞样生长，用抗波形丝蛋白Vimentin抗体免疫组织化学染色，确定皮肤成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2用猿猴病毒40大T抗原LT、人端粒酶催化亚单位hTERT转染成纤维细胞的过程为(1)将传至第16代的皮肤成纤维细胞，接种含有LT和hTERT的质粒，用氨基甙类药物筛选后扩大培养；(2)双酶切含有LT和hTERT cDNA的质粒psv3-neo和pCl-Neo-hTERT；(3)将酶切后所得片段进行地高辛标记，将其作为脱氧核糖核酸DNA探针；(4)取标记好的探针对转染后第3代和第16代细胞进行原位杂交检测，解剖显微镜下观察LT、hTERT信使核糖核酸mRNA的表达情况。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3构建的有荧光蛋白表达基因和端粒酶催化亚单位hTERT cDNA的载体pIRES2-EGFP-hTERT的过程为(1)将pIRES2-EGFP质粒和PCL-Neo-hTERT质粒同时用内切酶进行双酶切；(2)将上述酶切后的产物在琼脂糖凝胶上电泳，用DNA回收试剂盒进行回收；(3)将DNA片断水浴连接；(4)取感受态细菌融化后，加入连接产物。进行转化；(5)克隆扩大培养后进行质粒提取，提取的质粒进行双酶切和单酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带，确定构建成功的载体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将所述的步骤4已取得的LT和hTERT cDNA共转染的成纤维细胞进行生物学鉴定的方法有(1)以时间为横轴，细胞倍增次数为纵轴绘制细胞生长曲线；(2)核型分析取转染并筛选后的处于对数生长期的转化细胞，进行核型分析检测；(3)取转染后的细胞注入到裸鼠皮下，进行致瘤性检测；(4)利用图象分析系统进行胶原分泌能力检测。
全文摘要
本发明属于遗传工程的细胞修饰、融合技术领域，涉及一种使皮肤成纤维细胞永生化的方法。特征是选取猿猴病毒40大T抗原LT和人端粒酶催化亚单位hTERT对皮肤成纤维细胞进行联合转染，最终得到与正常成纤维细胞生物学行为接近、性状相对稳定的永生化皮肤成纤维细胞系。该细胞的获得可以使其成为皮肤研究的标准细胞或组织工程皮肤的种子细胞来源之一，同时有助于细胞永生化研究的深入发展。
文档编号C12N5/08GK1590539SQ0313454
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者金岩, 王新文 申请人:中国人民解放军第四军医大学口腔医学院