UCP1在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用的制作方法

本发明属于解偶联蛋白1(ucp1)应用技术领域，具体涉及一种ucp1在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用。

背景技术：

肥胖和2型糖尿病相关的药物研发一直是科研与开发领域的热点。在肥胖和2型糖尿病模型小鼠以及人类患者的研究发现，fgf21重组蛋白可减轻体重、降低血脂、降低血糖、显著减轻肥胖和2型糖尿病及其并发症。因此，在肥胖和2型糖尿病相关药物研发的众多候选分子中，成纤维细胞生长因子21(fgf21)是一个研发热点。

建立一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物的关键。一个客观评价fgf21重组蛋白治疗糖尿病效果的检测指标对于fgf21研发至关重要。目前，脂肪细胞的葡萄糖摄取量的测定是目前普遍采用的fgf21活性检测方法：该方法一般是测定葡萄糖的类似物2-脱氧葡萄糖，2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖无法进入后续代谢步骤，因而会在细胞中聚集，可反映细胞的葡萄糖摄入水平。该方法检测过程中一般使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖，这对于实验防护和环境保护要求较高；另外，检测过程中还可以使用荧光方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平，该方法价格昂贵，不利于高通量筛选使用，同时葡萄糖摄取检测还受到己糖激酶活性的影响，在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。

因此，研发新的fgf21功能检测的体系不仅可弥补葡萄糖摄取测定的不足，而且能够获得给为简便可靠的检测方法，这对于客观评价人重组fgf21蛋白效果具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种ucp1在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用，为判断人重组fgf21蛋白活性提供了新的思路，解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。

本发明所采用的技术方案是，ucp1在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用。

本发明的特点在于，

ucp1与人重组fgf21蛋白的添加浓度的关系为：ucp1基因表达水平随人重组fgf21蛋白的添加浓度的增加而增大。

ucp1基因表达水平通过定量pcr方法检测。

定量pcr方法检测过程中，ucp1的引物序列为：

上游引物：5’-ggttttgcaccacactcctg-3’；

下游引物：5’-acatggacatcgcacagctt-3’。

本发明所采用的另一个技术方案是，用于判断人重组fgf21蛋白活性的ucp1，ucp1基因表达水平被人重组fgf21蛋白浓度上调，且呈剂量依赖性升高。

本发明的特点还在于，

ucp1为脂肪细胞内的ucp1。

本发明的应用有益效果是：本发明通过不同浓度的人重组fgf21蛋白处理脂肪细胞，采用定量反转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)检测脂肪细胞内的ucp1基因表达水平，从而确定脂肪细胞内ucp1表达水平成为人重组fgf21蛋白活性检测的新指标，操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。

附图说明

图1是本发明细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片；

图2是本发明定量pcr方法中ucp1和beta-actin基因的扩增曲线图；

图3是本发明定量pcr方法中pcr产物的熔解曲线；

图4是本发明的人重组fgf21蛋白处理细胞12h后对ucp1基因表达水平的影响柱状图；

图5是本发明人重组fgf21蛋白浓度与ucp1基因表达水平的量效关系图；

图6是本发明人重组fgf21受体抑制剂对人重组fgf21蛋白作用的抑制效应图。

具体实施方式

本发明公开的脂肪细胞内解偶联蛋白1(ucp1)基在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一、细胞培养和处理

小鼠前体脂肪细胞细胞种植于12孔培养板中，在温度为37℃的孵箱培养，所用培养液为普通培养液即dmem培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清，每2天更换新鲜培养液；当细胞生长至接触抑制2天后，更换到诱导培养液中，诱导培养液为dmem培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清、0.3iu/ml胰岛素、20μmol/l地塞米松和20μmol/l罗格列酮，处理2天后；更换到胰岛素培养液，胰岛素培养液为dmem培养液，其中加入体积分数为10％的新生牛血清和0.3iu/ml胰岛素，继续培养2天后；更换到普通培养液中继续培养，细胞经诱导后可见细胞内脂滴沉积，向脂肪细胞转化，每2天更换新鲜培养液，6天后细胞用于人重组fgf21蛋白处理。如图1所示，细胞经诱导分化后全部出现脂滴沉积，转变为成熟的脂肪细胞。

在脂肪细胞培养液中分别加入不同浓度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml的人重组fgf21蛋白(美国peprotech公司产品)，处理12小时后，脂肪细胞用于rna提取。

二、脂肪细胞rna提取和反转录

将12孔板中的培养板去除干净，每孔加入350μl裂解液rl，用细胞研磨棒研磨裂解，再将所有溶液转移至过滤柱cs中，12000rpm离心2min，收集滤液；再向滤液中加入350μl70％乙醇，混匀并转入吸附柱cr3中12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室温放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；重复向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3置于室温放置5min以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱cr3转入rnase-free离心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到rna溶液。

酶标仪检测rna浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。在八连管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再向其中依次加入1μlgdnaeraser、1μgtotalrna，最后用rnasefreedh2o补足至10μl，混匀，室温反应5min。随后在各管中分别加入以下试剂，4μl5xprimescriptbuffer，4μlrnasefreedh2o，1μlprimescriptrtenzymemixi，1μlrtprimermix，总反应体系为20μl，混匀。反应条件为37℃15min，85℃，5s。反应完成后将cdna存入4℃备用，长期保存时转入-20℃。

三、ucp1基因表达水平的检测

ucp1基因表达水平采用定量pcr方法检测，以beta-actin基因的表达作为参考基因。在八连管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μlucp1引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，总反应体系为20μl，混匀。

反应条件是：第一步是94℃、5min，第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min循环进行40次，第三步是进行加温熔解扩增产物，获得熔解曲线。

ucp1引物序列是：

上游引物：5’-ggttttgcaccacactcctg-3’；

下游引物：5’-acatggacatcgcacagctt-3’。

beta-actin的引物序列是：

上游引物：5’-cgttggcatccacgaaacta-3’；

下游引物：5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

以beta-actin基因表达为参考，对实验结果进行表达水平分析：如图2所示，随着扩增次数的增加，ucp1和beta-actin基因的拷贝数在一定扩增次数后呈指数增加，最后到达平台期；如图3所示，熔解曲线表现单峰，说明扩增产物的特异性强；如图4所示，人重组fgf21(美国peprotech公司产品，浓度100ng/ml)处理细胞12小时可显著增加脂肪细胞内ucp1的表达(**表示统计学分析p<0.01，n＝6)；如图5所示，ucp1表达随人重组fgf21添加浓度的增加而增加，表现为良好的量效关系；如图6所示，进行了4组实验，一组为对照组即空白组，二组加入人重组fgf21蛋白，三组加入人重组fgf21蛋白抑制剂azd4547，四组同时加入人重组fgf21蛋白和抑制剂azd4547，结果表明，人重组fgf21受体抑制剂azd4547(美国mce公司产品，浓度10nmol/l)处理后显著抑制fgf21对ucp1表达的作用(**表示统计学分析p<0.01，n＝6)。

四、扩增特异性的鉴定

把定量pcr扩增产物进行dna测序，ucp1测序结果如下：

“ggttttgcaccacactcctggcctctccagtggatgtggtaaaaacaagattcatcaactctctgccaggacagtacccaagcgtaccaagctgtgcgatgtccatgt”，扩增片段大小为108bp，与美国国家生物技术信息中心报道的ucp1mrna(序号：nm_009463.3)的903-1010碱基序列完全一致。

根据以上实验结果发现，ucp1基因表达水平被人重组fgf21的添加浓度上调，且呈剂量依赖性升高，脂肪细胞内ucp1基因表达水平成为人重组fgf21蛋白活性检测的新指标。