具有蛋白酶活性的多肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及生产这些多肽及在例如动物饲料和洗涤剂中使用这些多肽的方法。
【专利说明】具有蛋白酶活性的多肽
[0001 ] 对序列表的引用
[0002]本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003]发明背景
发明领域
[0004]本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包括这些核酸序列的核酸构建体、载体、和宿主细胞(包括植物和动物细胞)，以及用于生产及使用这些 蛋白酶的方法，特别是这些蛋白酶在动物饲料和洗涤剂中的用途。
[0005]发明背景
[0006]在蛋白酶于动物饲料中的用途(体内)和/或此类蛋白酶用于处理植物蛋白的用途(体外)中，应指出的是蛋白质对于动物和人类而言是必需营养因子。大多数牲畜和人类从植物蛋白质来源获得必要的蛋白质。重要的植物蛋白质来源是例如油籽作物、豆类以及谷类。
[0007]当例如大豆被包括在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆粉固体不能被有效地消化(在小猪、生长中的猪以及家禽如肉鸡、蛋鸡和公鸡中表观回肠蛋白质消化率仅为大约80%)。
[0008]动物胃肠道由一系列的区段组成，每个区段代表不同的pH环境。在单胃动物例如猪和家禽以及许多鱼类中，胃展现出低到PH1-2的强酸性pH，而肠展现出在pH6-7区中的更加中性的pH。除了胃和肠外，家禽还在胃之前具有嗉囊，在嗉囊中的pH主要由消化的饲料决定并且因此典型地处于PH4-6的范围内。由蛋白酶进行的蛋白质消化可以沿着整个消化道进行，其前提是该蛋白酶是有活性的，并且可在消化道中的条件下存在。因此，对于存在于胃环境中是高度酸稳定的并且同时在目标动物的宽生理PH下具有有效活性的蛋白酶是尤其希望的。
[0009]并且，动物饲料常常被配制为颗粒形式，其中蒸汽应用于造粒过程中。因此，还希望的是用于动物饲料中的蛋白酶能够在暴露于蒸汽处理时依然有活性。
[0010]具有蛋白酶活性的多肽
[0011]具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时也称为肽酶、蛋白酶、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论蛋白酶的特异性有关。
[0012]在此术语“蛋白酶”被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义还适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括任何属于EC3.4组的酶(包括其13个亚类中的每一个)。EC编号参照来自NC-1UBMB，学术出版社(Academic Press),圣地亚哥，加利福尼亚州的《酶命名法》1992，包括分别发表于《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Bio-chem.) 1994, 223, 1-5 ;《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)1995，232，1-6 ;《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.) 1996，237，1-5 ;《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.) 1997, 250, 1-6 ；以及《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)1999, 264,610-650中的增补版1_5。命名法定期被增补并且更新，参见例如万维网(WWW)http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index, html。
[0013]本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成:
[0014]Ca)属于EC3.4.21.酶组的蛋白酶；和/或
[0015](b)肽酶家族SI的丝氨酸蛋白酶，或更确切地为SlA ；
[0016]如在《生物化学杂志》(Biochem.J.) 290:205-218 (1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，发表版(release)，9.4 (2011年I月31日)(www.merops.ac.uk)中所描述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings) , N.D.,巴雷特(Barrett) , A.J.&贝特曼(Bateman) , A.(2010) MEROPS:妝酶数据库(MEROPS: the peptidase database),《核酸研究》(NucleicAcids Res) 38，D227-D233 中。.[0017]更确切地，本发明的蛋白酶是偏爱Pl位置上为疏水性芳香族aa残基的那些。
[0018]为了确定给定蛋白酶是否是丝氨酸蛋白酶以及SlA蛋白酶家族，参考了以上手册和其中指示的原则。可对所有蛋白酶类型进行这种确定，而不论其是天然存在的或野生型的蛋白酶，或经基因工程改造的或合成的蛋白酶。
[0019]SI家族的肽酶包含以下顺序的催化三联体His、Asp和Ser。催化三联体的任何氨基酸的突变将导致酶活性的损失。来自立枯韩国生工菌(Kribbella solani) (SEQ IDN0:2)和明矾韩国生工菌(Kribbella aluminosa) (SEQ ID N0:4)的SI蛋白酶I的催化三联体的氨基酸可能是位置His-138、Asp-168和Ser-250。
[0020]可使用任何测定法测量蛋白酶活性，在`所述方法中使用底物，该底物包括与所讨论蛋白酶的特异性相关的肽键。使测定-PH和测定-温度同样地适配于所讨论蛋白酶。测定-pH值的实例为pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12。测定-温度的实例是5、10、15、20、
25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90、或95°C。蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如天青精-交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)，或suc-AAPF-pNA。适合的蛋白酶测定的实例描述于实验部分中。
[0021]相关技术说明
[0022]分离自韩国生工菌属(Kribbella)和链霉菌属的蛋白酶在本领域中是已知的。来自黄色韩国生工菌(Kribbella flavida)的蛋白酶披露于卢卡斯(Lucas)，S.等人，“黄色韩国生工菌 DSM17836 的全基因组(The complete genome of Kribbella flavidaDSM17836)” 中；提交至(SEP-2009) EMBL/GenBank/DDBJ 数据库(SWISSPROT:C1WJ16 ;在此的SEQ ID N0:6)。该序列具有与成熟蛋白酶的SEQ ID NO:2的序列80.23%的一致性以及与SEQ ID N0:4的序列80.81%的一致性。参照的DNA序列(在此为SEQ ID N0:5)具有与在此的SEQ ID NO:1的序列81.6%的一致性以及与SEQ ID NO: 3的序列85.51%的一致性。
[0023]—种蛋白酶一链霉菌蛋白酶B披露于亨德森(Henderson)，G.克瑞斯曼(Krygsman) , P.刘(Liu)，C.J.戴维(Davey)，C.C.马莱克(Malek)，L.Τ., “来自灰色链霉菌的蛋白酶A和B的基因的表征和结构(Characterization and structureof genes for proteases A and B from Streptomyces griseus)，，，〈〈细菌学杂志〉〉(J.Bacteriol).169:3778-3784 (1987)中。对于此蛋白酶的序列一致性低于以上指示的那些:
[0024]本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是肽酶家族SlA的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现出令人惊讶的pH特性，尤其是pH稳定性和PH-活性特性，这使得它们成为令人感兴趣的用于在动物饲料中使用的候选者。因此本发明的蛋白酶在从PH4-11的宽范围内对Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA是有活性的并且在PH6-11的范围内展现特别高的活性，在从pH3-7的宽生理pH范围内对饲料相关大豆粉-玉米粉底物是有活性的，并且在经受低到2的pH持续2小时之后保持大于80%的活性。
[0025]在动物饲料中使用蛋白酶以改进饲料中的蛋白质的消化是已知的。W095/28850披露了改进植物蛋白溶解性的植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶的组合。W001/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定蛋白酶在动物饲料中的用途。W001/58276披露了与衍生自拟诺卡氏属(Nocardiopsis sp.) NRRL18262 (IOR蛋白酶)的蛋白酶和衍生自白拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba) DSM14010的蛋白酶相关的酸稳定蛋白酶在动物饲料中的用途。W004/07222U W004/111220、W004/111223、TO05/035747、和 W005/123911 披露了与 IOR 蛋白酶相关的蛋白酶以及它们在动物饲料中的用途。并且，W004/072279披露了其他蛋白酶的用途。
[0026]W004/034776披露了来自地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)的枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶PWD-1在家禽饲料中的用途。W004/077960披露了通过施用细菌或真菌蛋白酶增加反刍动物对草料或谷物的消化率的方法。
[0027]包括蛋白酶并且 上市用于动物饲料中的商品包括RONOZYME? ProAct(DSM NP/ 诺维信公司(Novozymes))、Axtra⑩(丹尼斯克公司(Danisco))、Avizyme?(丹尼斯克公司)、Porzyme^ (丹尼斯克公司)、Allzyme?(阿尔泰克公司(Alltech))、Vcrsa/ymciv:(国际生物资源公司(BioResources, Int.))、Pou I try grow? (杰夫公司(Jef0))以及Cibenza? dpioo (诺伟司公司(Novus))。
[0028]发明概述
[0029]本发明涉及选自下组的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该组由以下各项组成:
[0030](a)具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的一种多肽；
[0031](b)由一种具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的成熟多肽编码序列至少86%的序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽；
[0032](C)一种变体，该变体包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
[0033](d) (a)、(b)、或(C)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
[0034]本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包括这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、以及重组宿主细胞，并且涉及生产这些多肽的方法。
[0035]本发明还涉及用于制备供动物饲料使用的组合物、用于改进动物饲料的营养价值的方法，以及处理有待用于动物饲料组合物中的蛋白质的方法。
[0036]此外，本发明还涉及蛋白酶在洗涤剂组合物和此类洗涤剂组合物中的用途。
[0037]序列表综述[0038]SEQ ID NO:1是如从立枯韩国生工菌(Kribbella solani)分离的DNA序列。
[0039]SEQ ID NO: 2是如从SEQ ID NO:1推导出的氨基酸序列
[0040]SEQ ID NO: 3是如从明帆韩国生工菌(Kribbella aluminosa)分离的DNA序列。
[0041]SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导出的氨基酸序列
[0042]SEQ ID NO: 5是来自黄色韩国生工菌(Kribbella flavida)的DNA序列(EMBL:CPOOI736)
[0043]SEQ ID N0:6是来自黄色韩国生工菌(Kribbella flavida)的氨基酸序列(卢卡斯(Lucas)，S.等人“黄色韩国生工菌DSM17836的全基因组(The complete genome ofKribbella flavida DSM17836.)”UNIPR0T:D2Q1F6)
[0044]SEQ ID N0:7 是 10R 蛋白酶的 DNA 序列(W005/035747, SEQID NO:1)
[0045]SEQ ID N0:8 是 10R 蛋白酶的氨基酸序列(W005/035747，SEQID N0:2)
[0046]SEQ ID N0:9是立枯韩国生工菌(Kribbella solani) SI肽酶特异性正向引物。
[0047]SEQ ID NO: 10是立枯韩国生工菌(Kribbella solani) SI肽酶特异性反向引物。
[0048]SEQ ID NO: 11是明矾韩国生工菌(Kribbella aluminosa) SI肽酶特异性正向引物。
[0049]SEQ ID NO: 12是明矾韩国生工菌(Kribbella aluminosa) SI肽酶特异性反向引物。`
[0050]SEQ ID NO: 13上游侧翼片段特异性正向引物。
[0051]SEQ ID NO: 14上游侧翼片段特异性反向引物。
[0052]SEQ ID NO: 15下游侧翼片段特异性正向引物。
[0053]SEQ ID NO: 16下游侧翼片段特异性反向引物。
[0054]SEQ ID: 17是迟缓芽孢杆菌分泌信号。
[0055]序列的一致性矩阵:
[0056]
【权利要求】
1.一种选自下组的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该组由以下各项组成: (a)具有与SEQID N0:2和/或SEQ ID N0:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的一种多肽； (b)由一种在高严格条件下或非常高严格条件下与以下项杂交的多核苷酸编码的一种多肽 (i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列，和/或 (ii)SEQID NO:3的成熟多肽编码序列，或 (iii)(i)或(ii)的全长互补链； (c)由一种具有与SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列至少86%的序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽；和/或 (d)—种变体，该变体包括SEQID N0:2和/或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽由一种在高严格条件下或非常高严格条件下与以下项杂交的多核苷酸编码 (i)SEQID N0:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列， (ii)(i)或(ii)的全长互补链。
3.如权利要求1-2中任一项所述的多肽，包括SEQID N0:2或由其组成。
4.如权利要求1-2中任一项所述的多肽，包括SEQID N0:4或由其组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，该多肽是SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的一种片段，其中该片段具有蛋白酶活性。
6.一种具有蛋白酶活性并且具有与SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:4的成熟多肽至少85%的序列一致性的变体多肽，该变体多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。
7.一种组合物，包括如权利要求1-6中任一项所述的多肽。
8.—种分离的多核苷酸,编码如权利要求1-6中任一项所述的多肽。
9.一种核酸构建体或表达载体,该核酸构建体或表达载体包括如权利要求8所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一种表达宿主细胞内生产的一个或多个(若干个)控制序列。
10.一种重组表达宿主细胞，包括如权利要求8所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的生产的一个或多个控制序列。
11.一种生产如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法,包括: (a)在有益于生产该多肽的条件下，培养一种细胞，该细胞在处于其野生型形式下生产该多肽；并且 (b)回收该多肽。
12.—种生产如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法,包括: Ca)在有益于生产该多肽的条件下，培养如权利要求10所述的宿主细胞；并且 (b)回收该多肽。
13.经一种编码如权利要求1-6中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。
14.一种生产如权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法,包括: Ca)在有益于生产该多肽的条件下，培养如权利要求13所述的转基因植物或植物细胞；并且 (b)回收该多肽。
15.如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽在以下项中的用途 (i)动物饲料； (ii)动物饲料添加剂； (iii)用于在动物饲料中使用的一种组合物的制备； (iv)改进一种动物饲料的营养价值； (ν)增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白质； (vi)增加动物饮食中的蛋白质的水解程度；和/或 (vii)蛋白质的处理。
16.—种用于改进一种动物饲料的营养价值的方法,其中将如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽添加至该饲料。
17.一种动物饲料添加剂，包括 (i)如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽；以及 (ii)至少一种脂溶性维生素，和/或 (iii)至少一种水溶性维生素,和/或 (iv)至少一种痕量矿物质。
18.如权利要求17所述的动物饲料添加剂，进一步包括一种或多种淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶、或其任何混合物。
19.一种动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白质含量并且包括如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽。
20.一种用于蛋白质处理的方法，包 括将如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽添加至至少一种蛋白质或蛋白质来源的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中大豆被包括在该至少一种蛋白质来源之中。
22.如权利要求1-6中任一项所述的至少一种多肽在洗涤剂中的用途。
23.一种洗涤剂组合物，包括如权利要求1至6中任一项所述的至少一种多肽。
24.如权利要求23所述的洗涤剂组合物，其中该组合物包括一种或多种另外的酶。
25.如权利要求24所述的洗涤剂组合物，其中这些另外的酶选自下组，该组包括:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶(xanthanases)、过氧化物酶、卤代加过氧酶(haloperoxygenases)、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物。
【文档编号】C12N9/52GK103764822SQ201280040416
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年8月17日 优先权日:2011年8月19日
【发明者】C.斯乔霍尔姆, P.R.奥斯特加德, T.霍夫, K.庞托普皮丹, R.P.奥林斯基 申请人:诺维信公司