角蛋白酶的酶活检测方法

角蛋白酶的酶活检测方法
【专利摘要】本发明涉及生物酶领域，尤其涉及一种新型的角蛋白酶检测方法。角蛋白酶的检测方法，包括下述的步骤：（1）溶液配制：配制甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、二硫苏糖醇溶液；（2）检测：取底物天青角蛋白，剪成段，使其长度小于2mm；反应，将反应体系置于60℃水浴酶解1h，酶解液5000g离心10min，取上清，分别测定样品管和空白管在595nm处的吸光值A1和A0；（3）分析方法：以样品管吸光值A1比空白管A0每上升0.1定义为一个酶活单位U，计算公式如下：X=(A1-A0)×10×n（n为酶液稀释倍数）。
【专利说明】角蛋白酶的酶活检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物酶领域，尤其涉及一种新型的角蛋白酶的酶活检测方法。
[0002]【背景技术】
角蛋白酶(keratinase)是一种可专一地降解角蛋白的蛋白酶类，也是一种诱导酶，只有当环境中出现诱导子(角蛋白)时才会合成。目前已发现30余种微生物可分泌角蛋白酶，这些微生物主要来自于真菌、放线菌和细菌，如真菌中的皮肤癣菌(Dermatophytes)和白色假丝酵母(Candida albicans),放线菌中的链霉菌(Streptomyces),细菌中的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)等等。
[0003]早在19世纪初人们就发现一些生物能降解角蛋白，自那时以来分离此类菌株的工作一直在进行。目前发现可降解角蛋白的微生物已有30多种，其中有细菌、放线菌和真菌。细菌中主要是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),放线菌中主要是高温单胞菌属(Thermmonospora),真菌中主要是白色假丝酵母和链霉菌(Streptomyces)。不同微生物产生的角蛋白酶具有一定的差异，主要表现在酶的存在方式以及酶的结构、组成、稳定性、最适反应温度、PH值等方面。例如角蛋白酶的存在形式，有的主要存在于胞内，有的主要分泌至胞外，而霉菌的角蛋白酶既可见于胞内又可分泌至胞外。
[0004]角蛋白酶可由多种微生物产生，能特异性地降解角蛋白，在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。
[0005]微生物中纯化的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白类，如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。因此角蛋白酶具有广泛的应用前景。
[0006]1、在农业上，微生物产生的角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，可以用于制造有机肥料，这种有机肥料不仅解决了国内能源紧缺的难题，还降解了污染源，大大改善了环境。在这方面，对于农业资源和畜牧业资源紧缺的中国来说，无疑是一个巨大的资源宝库。
[0007]2、在饲料产业中，羽毛等的主要成分是角蛋白，其粗蛋白成分在80%以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源。我国平均每年产羽毛达数10万吨，绝大部分未得到合理利用。因此，对废弃羽毛的开发、利用具有重要的应用前景，它一方面解决了当前饲料工业中蛋白资源不足的问题，另一方面又可解决环境污染问题。
[0008]3、角蛋白酶还可用于化妆品、工业生产及医药方面。在当今生物处理日益受到关注的形势下，开发有发展潜力的角蛋白降解酶以实现角蛋白的高效生物降解已成为大势所趋。角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，因此，能否利用角蛋白酶抑制剂或者角蛋白酶单克隆抗体抑制角蛋白酶的作用，削弱皮肤真菌的侵袭性，从而达到治疗皮肤真菌感染的目的，是今后研究角蛋白酶与皮肤 真菌感染相互关系的一个重要方向。角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，利用角蛋白酶改善药物在角蛋白中的通透性，可提高皮肤外用药物的疗效。特别是在银屑病、角化过度性皮肤病(神经性皮炎、慢性湿疹等)的治疗应用方面非常值得研究。[0009]角蛋白酶也可应用于美容护肤品，帮助活性因子透过皮肤屏障，去除皮肤多余角质，实现皮肤的深层护理。角蛋白酶能水解毛发角蛋白，利用角蛋白酶进行脱毛，治疗多毛症也可能具有良好的应用前景。
[0010]角蛋白不溶性于水及大部分有机溶剂，使得角蛋白酶活性测定比一般蛋白酶困难。常用测定角蛋白酶的原理是以底物水解后释放的氨基酸的量来确定角蛋白酶的活性。
[0011]关于角蛋白酶的检测，目前多采用碱性蛋白酶的通用方法(酪蛋白为底物)，但角蛋白酶虽然在分类上属于碱性蛋白酶的范畴，但它特异作用于角蛋白，采用上述方法检测的专属性不强，因此开发以角蛋白为底物的检测方法更能准确反映出酶活力的高低。
[0012]测定角蛋白酶的酶活，一种方法是直接以角蛋白粉作为底物进行测定，涂国全等曾以羽毛粉作为测定角蛋白酶的底物，进行测定；另外一种方法是以可溶性的羽毛角蛋白作为底物表征角蛋白酶的活性，该方法由Wawrzkiewicz提出，它是利用二甲基亚砜溶解羽毛角蛋白，再用异丙醇经行沉淀，干燥后的可溶性角蛋白溶解于相应的缓冲液中作为底物。但上述方法经过验证都存在重复性差，测定偏差较大的问题。
[0013]本发明所使用的天青角蛋白是经过化学修饰，连接上了一些惰性发色基团的角蛋白，通过测定角蛋白酶对修饰底物的水解作用释放出的发色物质的含量来判断酶的活性，大大提高了分光光度法的精确度。

【发明内容】

[0014]为了解决上 述的技术问题，本发明提供了一种特异性更强的角蛋白酶检测方法。
[0015]角蛋白酶在一定温度和pH条件下，将天青角蛋白水解，生成产物可于595nm下进行比色测定。酶活力与吸光值成比例，由此可以计算角蛋白酶的酶活力。本发明以天青角蛋白为底物，进行角蛋白酶活力检测，确定了一种新的角蛋白酶检测方法。
[0016]本发明提供的一种以天青角蛋白为底物的角蛋白酶的酶活的检测方法具体步骤如下:
溶液配制:
角蛋白酶的酶活检测方法，包括下述的步骤:
(1)溶液配制
配制甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，使该缓冲液的浓度为0.05mol/L, ρΗΙΟ.5 ；
配制方法:取甘氨酸溶液，先加水，再加入氢氧化钠溶液调节至ρΗΙΟ.5,定容至100ml,
室温保存两周；
配制乙酸-乙酸钠缓冲液，使该缓冲的浓度为0.01mol/L, pH5.2 ；
配制方法:取乙酸钠溶解于纯水中，用冰醋酸调节PH5.2，定容至250ml。室温保存两
周;
配制二硫苏糖醇溶液，使其浓度为lmol/L，二硫苏糖醇固体为分析纯；
配制方法:取二硫苏糖醇固体，溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液中，过滤除菌后分装于
1.5ml离心管中，_20°C保存；
(2)检测
取底物天青角蛋白，剪成段，使其长度小于2_ ；
反应体系如下:天青角蛋白3mg/ml, 二硫苏糖醇0.01mol/L,用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液将酶液稀释至1.5-3.0U/ml，空白管不加酶液；在此过程中，可加入0.01mol/L的氯化钙增加其稳定性，4°C保存72h;
将反应体系置于60°C水浴酶解lh，酶解液5000g离心lOmin，取上清，分别测定样品管和空白管在595nm处的吸光值A1和A。；
(3)分析方法:
以样品管吸光值A1比空白管Atl每上升0.1定义为一个酶活单位U，计算公式如下:
X=(A1-Ao)^ IOX B
η为酶液稀释倍数；
X为角蛋白酶酶活。
[0017]角蛋白酶的酶活检测方法中，步骤(1)中溶液配制具体为:
配制甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，使该缓冲液的浓度为0.05mol/L, ρΗΙΟ.5 ；
配制方法:取0.2mol/L的甘氨酸溶液25ml，先加适量水，再加入0.2mol/L的NaOH溶液调节至ρΗΙΟ.5，定容至100ml，室温保存两周；
配制乙酸-乙酸钠缓冲 液，使该缓冲的浓度为0.01mol/L, pH5.2 ；
配制方法:取0.205g乙酸钠溶解于约200ml纯水中，用冰醋酸调节pH5.2，定容至250ml。室温保存两周；
配制二硫苏糖醇溶液，使其浓度为lmol/L ；
配制方法:取3.09g 二硫苏糖醇固体，溶解于20ml乙酸-乙酸钠缓冲液中，过滤除菌后分装于1.5ml离心管中，-20°C保存。
[0018]先将酶样品稀释至150_300U/ml，测定时再稀释100倍使用。
[0019]在酶解反应体系中添加终浓度为0.01mol/L的二硫苏糖醇，可显著提高595nm处的吸光值，增加测定结果的稳定性。
[0020]本发明的有益效果在于，本发明所提供的角蛋白酶的检测方法其操作步骤简单，选择性好，测定过程中的稳定性好。相对于【背景技术】中的其它两种方法，本发明所提供的测定方法其优点是平行性、重复性好，精确度大大提高。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
[0022]实施例1
(I)溶液配制
配制甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，使该缓冲液的浓度为0.05mol/L, ρΗΙΟ.5 ；
配制方法:取0.2mol/L的甘氨酸溶液25ml，先加适量水，再加入0.2mol/L的NaOH溶液调节至ρΗΙΟ.5，定容至100ml，室温保存两周；
配制乙酸-乙酸钠缓冲液，使该缓冲的浓度为0.01mol/L, pH5.2 ；
配制方法:取0.205g乙酸钠溶解于约200ml纯水中，用冰醋酸调节pH5.2，定容至250ml。室温保存两周；
配制二硫苏糖醇溶液，使其浓度为lmol/L ；配制方法:取3.09g 二硫苏糖醇固体，溶解于20ml乙酸-乙酸钠缓冲液中，过滤除菌后分装于1.5ml离心管中，-20°C保存。
[0023](2)检测
取底物天青角蛋白，剪成段，使其长度小于2_ ；
反应体系如下:天青角蛋白3mg/ml, 二硫苏糖醇0.01mol/L,用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液将酶液稀释至1.5-3.0U/ml，空白管不加酶液；
将反应体系置于60°C水浴酶解lh，酶解液5000g离心lOmin，取上清，分别测定样品管和空白管在595nm处的吸光值A1和A。；
(3)分析
以样品管吸光值A1比空白管Atl每上升0.1定义为一个酶活单位U，计算公式如下: X=(A1-A0)XIDXb
η为酶液稀释倍数；
X为角蛋白酶的酶活。
[0024]每个试样应取两份平等样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留整数位)。
[0025]取角蛋白酶样品1， 采用实施例1的方法测定，吸光值及计算结果如下:
【权利要求】
1.角蛋白酶的酶活检测方法，包括下述的步骤: (1)溶液配制 配制甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，使该缓冲液的浓度为0.05mol/L, ρΗΙΟ.5 ； 配制方法:取甘氨酸溶液，先加水，再加入NaOH溶液调节至ρΗΙΟ.5，定容至100ml，室温保存两周； 配制乙酸-乙酸钠缓冲液，使该缓冲的浓度为0.01mol/L, pH5.2 ； 配制方法:取乙酸钠溶解于纯水中，用冰醋酸调节PH5.2，定容至250ml ； 室温保存两周； 配制二硫苏糖醇溶液，使其浓度为lmol/L ； 配制方法:取二硫苏糖醇固体，溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液中，过滤除菌后分装于1.5ml离心管中，_20°C保存； (2)检测 取底物天青角蛋白，剪成段，使其长度小于2_ ； 反应体系如下:天青角蛋白3mg/ml, 二硫苏糖醇0.01mol/L,用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液将酶液稀释至1.5-3.0U/ml，空白管不加酶液； 将反应体系置于60°C水浴酶解lh，酶解液5000g离心lOmin，取上清，分别测定样品管和空白管在595nm处的吸光值A1和A。； (3)分析 以样品管吸光值A1比空白管Atl每上升0.1定义为一个酶活单位U，计算公式如下: X= (A1- A0) XlOXn η为酶液稀释倍数； X为角蛋白酶的酶活。
2.如权利要求1所述的角蛋白酶的酶活检测方法，其特征在于，所述的二硫苏糖醇固体为分析纯。
3.如权利要求1所述的角蛋白酶的酶活检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)中溶液配制具体为: 配制甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，使该缓冲液的浓度为0.05mol/L, ρΗΙΟ.5 ； 配制方法:取0.2mol/L的甘氨酸溶液25ml，先加适量水，再加入0.2mol/L的NaOH溶液调节至ρΗΙΟ.5，定容至100ml，室温保存两周； 配制乙酸-乙酸钠缓冲液，使该缓冲的浓度为0.01mol/L, pH5.2 ； 配制方法:取0.205g乙酸钠溶解于约200ml纯水中，用冰醋酸调节pH5.2，定容至250ml ； 室温保存两周； 配制二硫苏糖醇溶液， 使其浓度为lmol/L ； 配制方法:取3.09g 二硫苏糖醇固体，溶解于20ml乙酸-乙酸钠缓冲液中，过滤除菌后分装于1.5ml离心管中，-20°C保存。
【文档编号】C12Q1/37GK103627778SQ201310557807
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】杨雨, 潘明, 高立 申请人:济南诺能生物工程有限公司