一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型内酰胺类抗生素合成酶，根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列（Genebank：AY919310.1），有如下至少一个位点的突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。本发明还公开了所述新型内酰胺类抗生素合成酶的优化编码基因、含有该编码基因的重组载体和重组菌株以及该酶在合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛合成中的应用。该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低、应用广泛等优点，具有很好的工业化应用前景。
【专利说明】一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和酶工程技术，具体的说涉及一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]β_内酰胺类抗生素主要包括青霉素类和头孢菌素等类抗生素，是目前国内外主要使用的抗生素。该类抗生素在医药产业中占有重要的份额，约占全球抗生素年销售额的65%以上。2012年5月，中国市场调查网对医院头孢类抗菌素用量预测:中国目前医药市场容量约为1200亿元人民币，其中头孢菌素类抗生素约为130亿元左右。国外头孢菌素类抗生素药费占抗感染药费总额的40% (薛雨等，中国抗生素杂志，36 (2):86-92,2011.)。
[0003]国内抗生素制药企业在高端品种和前沿技术方面的创新能力与发达国家相比存在较大差距，特别是酶法氨苄西林、阿莫西林、头孢菌素等需要加快技术创新产业化。目前采用的化学合成法生产成本高，反应条件苛刻，低温反应，能耗大，使用大量的有机溶剂，污染严重。与之相比，酶法能在更为温和的条件下酶促合成半合成青霉素、头孢菌素，在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，被称为绿色工艺，并且经过多年的研究，采用酶法合成阿莫西林、头孢氨苄等品种的工艺已经成熟，产品收率达到或超过了传统的化学合成法，随着各国对环保问题的重视，要求的提高，酶法技术替代化学法制备抗生素已经势在必行。
[0004]酶法合成内酰胺类抗生素目前应用主要为青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11)，又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。应用最广的为青霉素G酰化酶，即PGA，主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶获得，该酶已大规模应用于工业生产内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成β -内酰胺类抗生素(Chandel, Α.K.et al.Enzyme andMicrobial technology, 42, 199-207,72008)。
[0005]青霉素酰化酶最早是利`用其催化水解反应得到中间体6-APA和7-ACA，而该反应为可逆反应，所以可以利用该特性进行半合成青霉素和头孢菌素，具体的是利用青霉素酰化酶催化酰基侧链和内酰胺核的缩合反应。
[0006]酶法合成β -内酰胺类抗生素的产量取决于三方面::(I) β -内酰胺类化合物的合成反应；(2)活化的酰基供体(侧链)的水解反应；(3)合成的抗生素(产物)的水解反应。这三方面的反应决定了最终的反应收率和产率。内酰胺类抗生素的水解反应和合成反应的相对速率，一方面可以通过合成反应条件的调整进行调节，另一方面可以通过改进合成用酶从而实现有利合成反应的方面。
[0007]Alkema等将Ε.coli PGA进行突变，结果E.coli PGA的β亚基24位上的苯基丙氨酸突变为丙胺酸，该酶在合成氨苄青霉素及头孢菌素的过程中，表现出较高的合成/水解相对速率。但该酶的酶活活性较低，不具有工业化的效果(Alkema W B L, et al.EurJ Biochem, 269:2093-2100, 2002)。专利 CN101177688 提供了一种巨大芽孢杆菌 PGA 的突变体，该酶可以促进合成反应但其合成活性较低，也不具备工业化潜力。专利CN提供了一种大肠杆菌青霉素酰化酶突变体，该酶具有一个或者多个突变位点，该酶可以用于阿莫西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄或者头孢拉定的合成，其在阿莫西林合成中6-APA和HPGME的摩尔比最优可以达到≤1.02，而6-APA的转化率更优选的可以达到≥99%，但该酶的活性不得而知。
[0008]相对与大肠杆菌青霉素酰化酶，无色杆菌属青霉素酰化酶具有更高的合成/水解比，而且该酶特性稳定，耐受较高温度，最高可以耐受65°C，具有很好的工业化应用前景(K.Plhackova et al.Applied Microbial Technology, 32:507-516, 2001 ；Skrob etal.Enzyme Microbial Technology32:738-744，2003 ; Beck a.S, et al.Appl MicrobiolBiotechnol May 15[Epub ahead of print]，2013)。专利 CN101563459 提供一种由无色杆菌属CCM4824克隆到的青霉素酰化酶基因，将其转化到了大肠杆菌中，构建成为工程菌。通过后期专利CN101802212提供工程菌制备青霉素酰化酶的方法，该酶可以用于阿莫西林、头孢氨苄的合成，其在阿莫西林合成中6-APA和HPGME的摩尔比更优可以达到1.5-1.8之间，头孢氨苄合成中7-ADCA和PGME的摩尔比更优的在1.5-1.7之间；相应转化率未提及，其与CN102264904提及的大肠杆菌青霉素酰化酶存在一定差距，并且目前对于无色杆菌属青霉素酰化酶的改造工作尚未见到相关报道，人们希望能够对原始无色杆菌属青霉素酰化酶进行分子改造优化，以构建一种性能更好并具有好的工业化应用前景的内酰胺类抗生素合成用酶。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种新型内酰胺类抗生素合成酶、其编码基因、含有该编码基因的重组载体和重组菌株以及该酶的应用，该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低等优点，具有很好的工业化应用前景。
[0010]本发明的目的之一是按如下的技术方案实现的:
[0011]一种新型内酰胺类抗生素合成酶的编码基因，其特征是，其为下述核苷酸序列之
[0012](a)具有 SEQ ID NO: 3 所示的 DNA 序列；
[0013](b)与SEQ ID NO: 3所示DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列，且编码具有内酰胺抗生素合成酶活性的蛋白质；
[0014](C)在高严谨条件下可以与SEQ ID NO: 3所限定的DNA序列杂交，且编码具有内酰胺抗生素合成酶活性的蛋白质的DNA序列。
[0015]SEQ ID NO: 3所示DNA序列是按如下步骤设计的:
[0016]I)根据Genebank提供的无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶的氨基酸序列(SEQ IDNO:l,Genebank:AY919310.1)，在该序列中引入3个突变位点(将330位的苯丙氨酸替换为丙氨酸、将415位的赖氨酸替换为精氨酸、将770位的亮氨酸替换为苯丙氨酸)，得到如SEQID NO:2所示氨基酸序列；
[0017]2)根据SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，使用在线设计工具Jcat反向设计出核苷酸序列，然后根据宿主大肠杆菌内基因高效表达所需的优选密码子和G+C碱基含量，对设计出的核苷酸序列进行优化，优化后的核苷酸序列(如SEQ ID N0:3所示)与无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO:4所示)相比，SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列中稀有密码子的数量从55个降低到了 2个，G+C碱基含量从68.75%下降到了57.25% ;同时SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列去除了原有序列中间的BamHI酶切位点。
[0018]本发明的目的之二是按如下的技术方案实现的:
[0019]一种新型内酰胺类抗生素合成酶，其是在如SEQ ID NO:1所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下至少一个位点的突变:第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。
[0020]优选的，所述新型内酰胺类抗生素合成酶，其是由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成。
[0021]所述SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列是在SEQ ID NO:1所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下三个位点的突变:第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸。
[0022]更优选的，所述新型内酰胺类抗生素合成酶，其是在所述SEQ ID N0:2所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下至少一个位点的突变--第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。
[0023]本发明的目的之三是按如下的技术方案实现的:`[0024]含有所述新型内酰胺类抗生素合成酶编码基因的重组载体。
[0025]进一步的，所述重组载体所用到的质粒为PET系列诱导型载体，优选PET28质粒。
[0026]所述重组载体是按如下步骤获得的:
[0027]I)将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行全基因合成，获得ASPGA基因；
[0028]2)将所述PET28质粒和所述ASPGA基因分别使用BamH I和Hind III双酶切体系进行酶切，分别得到ASPGA基因片段和PET28质粒片段；
[0029]3)使用T4连接酶对ASPGA基因片段和PET28质粒片段进行连接，将连接后的产物转化到宿主菌中，然后涂布到LB培养抗性平板，然后挑取生长出的阳性克隆接种到LB液体培养基培养后，提取质粒即得到所构建的重组载体——表达载体PET28-ASPGA。
[0030]本发明的目的之四是按如下的技术方案实现的:
[0031]含有所述内酰胺类抗生素合成酶编码基因的重组菌株。
[0032]进一步的，构建所述重组菌株所用到的宿主菌为E.coli BL21(DE3)或E.coliJM109(DE3)。
[0033]在E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109 (DE3)感受态细胞悬液中加入所述重组载体混匀，然后经过冷却、热激、冷却、复苏等步骤，完成转化，吸取转化后的细胞涂布加有抗生素的平板，倒置培养，生长出的菌株即为重组菌株——转化体BL21 (DE3)/PET28-ASPGA或转化体 JM109 (DE3) /PET28-ASPGA。
[0034]本发明的重组菌株经诱导表达后，采用离心、超声破壁、加热、pH调整、盐析等步骤进行纯化，之后进行固定化，即得到固定化酶。
[0035]本发明的目的之五是按如下的技术方案实现的:[0036]本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在内酰胺类抗生素合成中的应用。
[0037]本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在阿莫西林合成中的应用。
[0038]本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在头孢菌素合成中的应用。
[0039]本发明所述新型内酰胺类抗生素合成酶在头孢克洛合成中的应用。
[0040]本发明所述新型内酰胺抗生素合成酶经上述处理后用于内酰胺抗生素的酶法合成中，主要优点:该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低等优点，具有很好的工业化应用前景。
[0041]主要表现在:
[0042](I)在阿莫西林合成中:使用6-APA和HPGME -HCL为原料进行合成，其中6-APA与HPGME.HCL的摩尔比范围为1.0-3.0之间，最优的在1.0-1.02,6-APA转化率≥98%，最优的≥99%。
[0043](2)在头孢氨苄合成中:使用7-ADCA和PGME.HCL为原料进行合成，其中7-ADCA和PGME.HCL的摩尔比范围为1.0-3.0之间，最优的在1.05-1.2，7_ADCA转化率≥97%，最优的≥98%。
[0044](3)在头孢克洛合成中:使用7-ACCA和PGME.HCL为原料进行合成，其中7-ACCA和PGME.HCL的摩尔比范围为1.1-3.0之间，最优的在1.2-1.3,7-ADCA转化率≥97%，最优的≥98%。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶编码基因的重组载体
[0046]图2是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶催化阿莫西林合成的HPLC谱图。
[0047]图3是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶催化头孢氨苄合成的HPLC谱图。
[0048]图4是本发明新型内酰胺类抗生素合成酶催化头孢克洛合成的HPLC谱图。
【具体实施方式】
[0049]以下通过具体实施例对本发明做进一步说明，但并不意味着以任何方式作为对本发明的限制。
[0050]缩写说明:PGA:青霉素G酰化酶；6-APA:6_氨基青霉烷酸；7_ADCA -J-氨基去乙氧基头孢烷酸；7-ACCA:7-氨基-3-氯-3-头孢环-4-羧酸；HPGME -HCL:D-对羟基苯甘氨甲酯酸盐酸盐；PGME.HCL:D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐。
[0051]实施例1:基因设计及基因合成
[0052](1)基因设计:
[0053](1.1)根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列(SEQ IDNO:l,Genebank:AY919310.1)，将其第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第415位赖氨酸替换为精氨酸，第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸，这些位点引入突变位点后，得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，然后利用在线设计工具Jcat (http://www.jcat.de/)反向设计出核苷酸序列；
[0054](1.2)根据宿主大肠杆菌基因表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G +C碱基含量,优化上述反向设计出的核苷酸序列,优化后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，该序列与无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶核苷酸序列(如SEQ ID NO: 4所示)相比:①大肠杆菌稀有密码子从55个降低到了 2个；②G + C碱基含量由68.75%下降到57.25%;③优化设计过程中去除了序列中间出现的BamH I酶切位点，有利后期基因操作。通过上述优化设计后，有利于宿主菌大肠杆菌闻效表达该基因。
[0055](2)基因合成:根据SEQ ID NO:3所示基因序列进行全基因合成(由生工生物工程(上海)有限公司完成)，获得ASPGA基因。
[0056]实施例2:表达载体PET28-ASPGA (即重组载体)的构建
[0057](1)对实施例1获得的ASPGA基因使用BamH I和Hind III双酶切，酶切体系如下:
[0058]
【权利要求】
1.一种新型内酰胺类抗生素合成酶的编码基因，其特征是，其为下述核苷酸序列之 Ca)具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； (b)与SEQID NO: 3所示核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列，且编码具有内酰胺抗生素合成酶活性的蛋白质； (c)在高严谨条件下可以与SEQID NO:3所限定的核苷酸序列杂交，且编码具有内酰胺抗生素合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的新型内酰胺类抗生素合成酶，其特征是，其是在如SEQID ΝΟ:1所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下至少一个位点的突变--第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。
3.根据权利要求2所述的新型内酰胺类抗生素合成酶，其特征是，其是由SEQID NO:2所示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求3所述的新型内酰胺类抗生素合成酶，其特征是在所述SEQID NO:2所示青霉素酰化酶的氨基酸序列基础上，有如下至少一个位点的突变--第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。
5.含有权利要求1 所述编码基因的重组载体。
6.含有权利要求1所述编码基因的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征是，构建所述重组菌株所用到的宿主菌为B.co7iBL21 (DE3)或万.co7i JM109 (DE3)。
8.权利要求2~4所述新型内酰胺类抗生素合成酶在内酰胺类抗生素合成中的应用。
9.权利要求2~4所述新型内酰胺类抗生素合成酶在阿莫西林、头孢菌素和头孢克洛合成中的应用。
【文档编号】C12N9/84GK103695447SQ201310557812
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】刘力强, 牛昆, 吕娜, 贾娟娟, 范俊辉, 石晨光, 王召业, 武芳, 王欢, 杨丽萍, 邸胜苗, 刘 东 申请人:华北制药河北华民药业有限责任公司