一种促进中性蛋白酶活性的方法及其应用
【专利摘要】本发明属于蛋白酶领域，尤其涉及一种促进中性蛋白酶活性的方法及其应用。本发明将酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮与中性蛋白酶混合添加到豌豆蛋白粉中，对豌豆蛋白粉进行酶解制备豌豆蛋白多肽粉。本发明的中性蛋白酶促进剂提高了中性蛋白酶的活性，缩短了酶解时间，提高了酶解效率；豌豆蛋白粉酶解后经冷冻干燥得到豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高；相比于未添加木瓜蛋白酶促进剂的豌豆蛋白多肽粉，DPPH自由基清除率提高了10％～14％，能够用于抗衰老、抗氧化的功能性食品的开发。
【专利说明】
-种促进中性蛋白酶活性的方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白酶领域，尤其设及一种促进中性蛋白酶活性的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 中性蛋白酶别名沙雷肤酶，分子量为35~40KD，是一种在中性条件下活性较高的 蛋白酶，可用于各种蛋白质水解，作为一种生物催化剂，它具有催化反应速度快，无工业污 染等优点。根据《GB 2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准》的规定，中性蛋白 酶可用作食品工业的加工助剂(酶制剂）。
[0003] 8-( (4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基）-5,7-二径基-3-(4-?基苯基）-4H- 苯并化喃-4-酬是染料木素与1-(2,4-二甲基苯基)赃嗦经化学合成得到的一种染料木素衍 生物。8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基）-5,7-二径基-3-(4-?基苯基）-4H-苯 并化喃-4-酬的分子式为C2祖28N2化，分子量472.52，其结构式如下：
[0004]
[0005] 目前，国内外未见8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基）-5,7-二径基-3- (4-径基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬在促进中性蛋白酶活性方面的应用报道。
【发明内容】
[0006] 本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种促进中性蛋白酶活性的方法及其 应用。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[000引本发明的第一个目的在于提供一种促进中性蛋白酶活性的方法，将中性蛋白酶促 进剂8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基）-5,7-二径基-3-(4-?基苯基）-4H-苯并 化喃-4-酬与中性蛋白酶混合，得到促进活性的中性蛋白酶。
[0009] 其中，所述中性蛋白酶促进剂的添加量为中性蛋白酶质量的2~4%。
[0010] 其中，所述的中性蛋白酶促进剂8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基）-5， 7-二径基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬，为染料木素与1-(2,4-二甲基苯基)赃嗦的 化学合成物，具体制备过程如下:在50mL圆底烧瓶中加入染料木素 Immol、无水乙醇25mL和 37wt%甲醒水溶液0.08血，加热至55~60°C，反应液澄清后，加入1-(2，4-二甲基苯基)赃嗦 0.19mL，2(TC条件下揽拌4她，有固体析出，过滤，固体经重结晶分离纯化，得到中性蛋白酶 促进剂。
[0011] 本发明的促进活性原理为：中性蛋白酶促进剂与中性蛋白酶的一个酪氨酸残基W 一个氨键相互结合，两个η键和一个赖氨酸残基结合，Ξ个31键和一个色氨酸残基结合，运种 结合导致了中性蛋白酶构象的改变，从而提高了中性蛋白酶的活性。
[0012] 本发明的第二个目的在于提供一种上述促进中性蛋白酶活性的方法在制备魏豆 蛋白多肤粉领域的应用。
[0013] 上述魏豆蛋白多肤粉的制备方法，包括如下步骤：
[0014] (1)将中性蛋白酶促进剂8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基)-5,7-二径 基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬与中性蛋白酶混合，得到促进活性的中性蛋白酶；
[0015] (2)将促进活性的中性蛋白酶添加到魏豆蛋白粉中，魏豆蛋白粉进行酶解后，制得 魏豆蛋白多肤粉。
[0016] 进一步，将魏豆蛋白粉溶解于憐酸缓冲溶液中，加入中性蛋白酶和中性蛋白酶促 进剂，经酶解、灭酶、冷却过滤后得到魏豆多肤液，魏豆多肤液再经冷冻干燥得到魏豆蛋白 多肤粉。
[0017] 其中，所述中性蛋白酶促进剂的添加量为中性蛋白酶质量的2~4%，所述中性蛋 白酶的添加量为魏豆蛋白粉质量的10~12%。
[0018] 所述的酶解pH值为6.5~7.0，酶解溫度为40~45°C，酶解时间为2~2.化。
[0019] 所述的灭酶溫度为95~100°C，灭酶时间为5~lOmin。
[0020] 将本发明制得的魏豆蛋白多肤粉Wll.9~13.8mg/mL的浓度添加到饮料中，能够 制成抗氧化、抗衰老的功能性饮料。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1、本发明的中性蛋白酶促进剂提高了中性蛋白酶的活性，其与中性蛋白酶一起添 加到魏豆蛋白粉中，具有协同作用，缩短了酶解时间，提高了酶解效率。
[0023] 2、魏豆蛋白粉酶解后经冷冻干燥得到魏豆蛋白多肤粉，清除自由基效率更高；相 比于未添加中性蛋白酶促进剂的魏豆蛋白多肤粉，DPPH自由基清除率提高了 10~14%，能 够用于抗衰老、抗氧化的功能的功能性食品开发。
【具体实施方式】
[0024] W下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0025] 实施例1
[0026] (1)将魏豆蛋白粉溶解于pH值为7.0的憐酸缓冲溶液中，形成魏豆蛋白粉质量浓度 为7 %的分散液；
[0027] (2)向步骤(1)的分散液中加入占魏豆蛋白粉质量12%的中性蛋白酶，同时加入占 中性蛋白酶质量2%的中性蛋白酶促进剂8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基)-5， 7-二径基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬；
[002引（3)在抑值为7、溫度为45 °C的条件下水浴震荡2.化，酶解结束后，酶解液在95 °C维 持lOmin灭酶，然后冷却至20-25°C，过滤得到魏豆蛋白多肤液。
[0029]检测发现，加入中性蛋白酶促进剂后，魏豆蛋白的水解度提高28%，水解时间缩短 了23%。
[0030] 将魏豆蛋白多肤液经真空冷冻干燥得魏豆蛋白多肤粉，将魏豆蛋白多肤粉W 12.8mg/mL的浓度添加到饮料中，得到具有抗氧化、抗衰老等的功能性饮料，其DPPH自由基 清除率达93%，与未使用中性蛋白酶促进剂相比，清除率提高了 14%。
[0031] 实施例2
[0032] (1)将魏豆蛋白粉溶解于pH值为6.7的憐酸缓冲溶液中，形成魏豆蛋白粉质量浓度 为7 %的分散液；
[0033] (2)向步骤(1)的分散液中加入占魏豆蛋白粉质量10%的中性蛋白酶，同时加入占 中性蛋白酶质量4%的中性蛋白酶促进剂8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基)-5， 7-二径基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬；
[0034] (3)在pH值为6.7、溫度为40°C的条件下水浴震荡酶解化，酶解结束后，酶解液在 100°C水浴维持5min灭酶，然后冷却至20-25°C，过滤得到魏豆蛋白多肤液。
[0035] 用甲醒滴定法测定水解度，发现加入中性蛋白酶促进剂后，魏豆蛋白的水解度提 高17 %，水解时间缩短了 10 %。
[0036] 将魏豆蛋白多肤液经真空冷冻干燥得魏豆蛋白多肤粉，将魏豆蛋白多肤粉W 11.9mg/mL的浓度添加到饮料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性饮料，其DPPH自由 基清除率达85%，与未使用中性蛋白酶促进剂相比，清除率提高了 4.9%。
[0037] 实施例3
[0038] (1)将魏豆蛋白粉溶解于pH值为6.5的憐酸缓冲溶液中，形成底魏豆蛋白粉质量浓 度为7 %的分散液；
[0039] (2)向步骤(1)的分散液中加入占魏豆蛋白粉质量11%的中性蛋白酶，同时加入占 中性蛋白酶质量3%的中性蛋白酶促进剂8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)赃嗦-1-基）甲基)-5， 7-二径基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬；
[0040] (3)在抑值为6.5、溫度为42°C的条件下水浴震荡2.化，酶解结束后，酶解液在100 °C维持5min灭酶，然后冷却至20-25°C，过滤得到魏豆蛋白多肤液。
[0041] 用甲醒滴定法测量水解度，发现加入中性蛋白酶促进剂后，魏豆蛋白的水解度提 高22 %，水解时间缩短了 16 %。
[0042] 将魏豆蛋白多肤液经真空冷冻干燥得魏豆蛋白多肤粉，将魏豆蛋白多肤粉W 13.8mg/mL的浓度添加到饮料中，得到具有抗氧化、抗衰老等的功能性饮料，其DPPH自由基 清除率达89%，与未使用中性蛋白酶促进剂相比，清除率提高了 10%。
[0043] W上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种促进中性蛋白酶活性的方法，其特征在于，将中性蛋白酶促进剂8-((4-(2,4-二 甲氧基苯基)哌嗪-1-基）甲基)-5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)-4H-苯并吡喃-4-酮与中性蛋 白酶混合，得到促进活性的中性蛋白酶。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶促进剂的添加量为中性蛋 白酶质量的2~4%。3. -种权利要求1所述的促进中性蛋白酶活性的方法在制备豌豆蛋白多肽粉领域的应 用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将中性蛋白酶促进剂8-((4-(2,4_二甲氧基苯基)哌嗪-1-基）甲基）-5,7_二羟基-3-(4-羟基苯基)-4H-苯并吡喃-4-酮与中性蛋白酶混合，得到促进活性的中性蛋白酶； (2) 将促进活性的中性蛋白酶添加到豌豆蛋白粉中，豌豆蛋白粉进行酶解后，制得豌豆 蛋白多肽粉。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将豌豆蛋白粉溶解于磷酸缓冲溶液中，加 入中性蛋白酶和中性蛋白酶促进剂，经酶解、灭酶、冷却过滤后得到豌豆多肽液，豌豆多肽 液再经冷冻干燥得到豌豆蛋白多肽粉。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述中性蛋白酶促进剂的添加量为中性蛋 白酶质量的2~4%，所述中性蛋白酶的添加量为豌豆蛋白粉质量的10~12%。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，酶解pH值为6.5~7.0，酶解温度为40~45 °C，酶解时间为2~2.5h。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，灭酶温度为95~100°C，灭酶时间为5~ 10min〇
【文档编号】C12N9/96GK106011121SQ201610646753
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月8日
【发明人】张树成, 臧庆佳, 杨进洁
【申请人】烟台双塔食品股份有限公司