一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶及其制备方法，属于酶制剂制备【技术领域】。所述生长猪专用酶以枯草芽孢杆菌培养物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶、中草药提取物、保护剂、激活剂科学复配而成，枯草芽孢杆菌培养物可提高动物机体免疫力、促进免疫器官的发育、促进动物肠道结构和机能的成熟、提高动物日增重和改善饲料转化率。为畜禽提供了安全消化酶，有效减轻了消化负担，提高了原料利用率和生长率，保护了环境，同时适量的激活剂可在同等条件下充分发挥酶制剂的效力，节约酶制剂添加量，中草药提取物科学复配既延长复合酶制剂的保质期，又可提高饲养畜禽的免疫力。
【专利说明】一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酶制剂制备【技术领域】，具体是一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]在饲料中添加酶制剂主要有以下4个理由:1.降解在动物饲料中存在的抗营养因子。这些物质不能被动物内源酶降解，从而干扰动物的正常代谢，导致动物消化不良，生产性能下降。2.提高淀粉、蛋白质和矿物质的利用率。这些物质或者被富含纤维的细胞壁包围，或者以某些不能被动物消化的结构形式存在(例如在植物饲料原料中，大量的磷以植酸磷的形式存在。)。3.在原料中降解某些特定的化学键。这些化学键不能被动物自身的酶所降解，加入外源酶以后可以释放更多的营养物。4.由于幼龄动物自身消化系统还不成熟，内源酶不足添加外源酶可以提高饲料消化率，防止出现消化不良症状。除了可以提高日粮的利用率以外，加酶还可以减少饲料原料之间的差异，提高饲料配方的精确性，同时还可以提高动物生长的整齐性，减少管理成本，提高经济效益。使用酶制剂还可以保护环境。由于饲料的利用率提高了，相应的粪便排放量下降了。在效果比较明显的情况下，粪便的排放量可以减少20%左右，猪粪中氮的排放下降15%左右，鸡粪中氮的排放下降20%。对于植酸磷，可以大幅度减少磷对环境的污染。
[0003]目前在饲料工业中应用的酶制剂主要有4大类:分别用来降解纤维素、蛋白质、淀粉和植酸。
[0004]纤维降解酶:对于单胃动物来说，消化的最大阻力是不能产生降解纤维的酶，在含有小麦、大麦、燕麦等组分的日粮中，很大一部分纤维是阿拉伯木聚糖和3—葡聚糖。水溶性的纤维能提高小肠内容物的粘度，阻碍养分的吸收，从而降低动物的生长性能。同时这种状况还和一些由于消化不良引起的疾病有关。如猪的食欲减退、禽的黑趾症和小猪拉稀。由于品种、生长地点和气候条件等因素的影响，大麦和小麦中纤维含量的变化很大，导致含有这些组分的日粮的营养价值差异很大。纤维降解酶、木聚糖酶和3—葡聚糖可以减少这些差异，提高动物的生长性能和整齐度。同时还可以减少某些消化不良的疾病。
[0005]蛋白降解酶:在动物日粮中蛋白质来自各种词料原料，它们最终通过降解的氣基酸存积在瘦肉中。在单胃动物日粮中，添加蛋白酶(不同饲料原料蛋白质和品质和可利用性)除了能充分降解大部分储蛋白质或储藏蛋白质或为动物可利用的小分子肽外，还能够通过降解抗营养因素而改善饲料营养价值。存积的效率差异很大。在植物蛋白源，如豆饼粉中存在着一些抗营养因子，如几鞣质和胰蛋白酶抑制因子，可能会对小肠吸收表面造成损害，影响营养物的吸收。另外，幼龄动物不完善的消化体系使得植物蛋白(如豆饼粉)中的蛋白质不能得到很好的利用。
[0006]淀粉降解酶:许多营养学家认为玉米是饲料原料的“黄金标准”。绝大数营养学家认为玉米不存在消化不良性，消化率超过95%，但是最近Noy和Sklan研究表明(1994年)在理想状态下，4一 12日龄的肉鸡日粮中，淀粉的消化率很少超过85%，添加淀粉酶可以使淀粉在小肠得到更多更快的降解。在仔猪断奶期，由于营养、环境和免疫系统的变化，体重会下降。在日粮中添加淀粉酶和其他一些酶，可以增加动物内源消化酶分泌，进而改进营养的消化吸收，提高饲料转化率和动物生长率。
[0007]植酸降解酶:对于所有的动物来说，磷对于骨骼的矿化、免疫、繁殖、生长都是至关重要的。猪和家禽单胃动物只能里利用植物饲料中30— 40%的磷，其余60— 70%的植酸磷是无法利用的。在许多情况下，饲料日粮中必须补充无机磷来满足动物生长的需要。饲料中一半以上的磷随着粪便排放到环境中，污染环境。添加植酸酶可以降解植酸，释放植酸分子中的磷。这样可以产生2个益处:1.减少了饲料中磷的添加量。2.减少了畜禽粪便对环境的憐污染。
[0008]显而易见:作为饲料酶种的四大主角，他们的作用机理和模式在很大程度决定或推动了动物饲料产业对于酶制剂技术的吸收运用。目前在肉鸡料中添加酶的产出投入比例超过2:1。相对而言，在养猪业领域，酶制剂的使用情况就比较复杂，显得不明朗。集约化程度低，涉及环节比较多，酶制剂的使用效果很难进行商业计算。尽管在20世纪50年代已经有了使用酶制剂的设想，但是直到20世纪80年代才开始懂得如何在饲料工业中发挥酶的力量。饲料谷物，如小麦和大麦都含有比较高的单胃动物不能利用的纤维。如果纤维能够被降解，动物就能更好地利用营养物。在欧洲，大麦比较便宜，禽类营养学家和酶学家投入了大量精力研究了在含有大麦的肉鸡日粮中添加P—葡聚糖酶以减少其负面影响的可能性。其结果被证明是成功的，并得到了一个黄金定律:大麦+0—葡聚糖酶=小麦。受到上述成功的鼓舞，小麦是第二个的研究对象。理论假设是:小麦+木聚糖酶=玉米。这一步的研究也获得了成功。在20世纪90年代中期，酶在饲料工业得到了普遍认可。可以毫不夸张地说:1996年，在欧洲80%的肉鸡料(粘性谷物为能量来源)中含有纤维降解酶。由此强化和加快饲料产业对新技术的应用。从全球范围来看，大约65%的含有能产生粘性谷物的家禽饲料添加了纤维降解酶。而在猪饲料中的应用比例要低得多，接近10%。其主要原因是市场的结构比较复杂，市场呈多元化，甚至无法测算。从地理分布来看，使用纤维素降解酶的地区主要集中在粘性谷物作为主要能量饲料的产区，例如:欧洲、加拿大、澳大利亚和新西兰。另外，在美国、南美和亚太地区，使用情况取决于玉米和小麦之间的比价。从这个意义上讲，欧洲是使用降解纤维素酶的核心细分市场。为了获得全球的认可，饲用酶厂家必须大举进军以玉米一豆柏型日·粮为主的北美和亚太地区。玉米一豆柏型日粮历来被看作是“黄金标准”，尽管许多营养学家认为这些原料的变动性要比原来设想的变动性要大得多。现在，越来越多的证据表明这种黄金日粮也可以通过酶而改善其生产性能，尽管这类日粮与粗纤维或粘度相关的问题不严重。过去10年在研发玉米-豆柏第一代饲料酶上耗费很多，并于1996年开始成功应用，初期应用结果五花八门，但业界正开始变得越来越明白如何才能得心应手，加酶技术获得最大经济回报。据估算，该部分饲料酶市场份额为2千万美元，实际在使用玉米-豆柏日粮的肉鸡饲料只有5%为加酶饲料。1999/2000年一降低粘度和粗纤维为日粮的饲料酶市场价值超过I亿美元。目前，植酸酶已经得到了全球的承认和应用。植酸酶的市场份额大约是每年5000万美元，在全球约有8.0%左右的畜禽饲料添加植酸酶。除了经济利益的原因外，还有一个因素是减少了粪中植酸磷的含量有利于保护环境。
[0009]综上所述，生长猪专用酶的应用有着其广阔的市场空间和巨大的经济价值，但生长猪专用酶的热稳定性、安全性、复配全面性及作用效果的充分发挥仍是酶制剂生产厂家和广大养殖户共同关注的一个重要问题，制备更安全，更全面，酶作用效果更好的生长猪专用酶是本行业技术人员的共同责任和追求。
【发明内容】
[0010]本发明所解决的技术问题是以含高酶活力、作用条件宽泛、稳定性强的中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌培养物为基础，并科学复配中草药提取物、保护剂、激活剂和其它食品级饲料酶，制得的含中性蛋白酶的生长猪专用酶，不但为饲养生长猪提供了安全、全面的消化酶，减轻消化负担，提高原料利用率和生长率，有效保护环境，同时适量的激活剂可在同等条件下充分发挥酶制剂的效力，物尽其用，节约酶制剂添加量，中草药提取物的科学复配既可延长复合酶制剂的保质期，又可提高饲养生长猪的免疫力，从而达到一酶多用的效果。
[0011]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0012]一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成:
[0013]枯草芽孢杆菌培养物30-40份，酸性木聚糖酶30-50份，酸性蛋白酶20_30份，植酸酶20-30份，P -葡聚糖酶15-20份，纤维素酶10-15份，淀粉酶10-15份，^ -甘露聚糖酶10-15份，果胶酶5-10份， 中草药提取物10-15份，保护剂10-15份，激活剂10-15份。
[0014]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、^ -葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、P -甘露聚糖酶、果胶酶均为食品级酶制剂；
[0015]所述枯草芽孢杆菌培养物由产强热稳定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢杆菌1398-2-12经液体深层发酵制备，其成分主要包括中性蛋白酶和枯草芽孢杆菌菌体；
[0016]所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法如下:
[0017]枯草芽孢杆菌1398-2-12经斜面菌种活化和逐级扩大培养(包括一、二、三级种子培养以及一级种子罐培养)获得液体种子；将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36°C，搅拌速度200-700rpm，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10_15h ;然后以1-2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1-2°C /h降温速率缓慢降温至
2-5°C，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1_2°C /h升温速率缓慢升温至10_15°C，恒温培养15-20h ;继续以1-2°C /h升温速率缓慢升温至30-36°C，恒温培养15-20h ;发酵液经孔径IO-1OOOiim过滤纸板粗滤，然后于10_20°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得枯草芽孢杆菌培养物。
[0018]所述斜面培养基组成为:牛肉膏3-10g，氯化钠5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，琼脂 15_20g，中草药粉剂 5-10g,蒸馏水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C灭菌 20min ；
[0019]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0020]以重量份数计，称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径 为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，然后降温至45-60°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节PH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C~78°C保持3~4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。[0021]所述混合酶添加量为混合物料总重量的5_10%。
[0022]所述混合酶的重量份数组成为:内P -葡聚糖酶10-20份，外P -葡聚糖酶10-20份，3 -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，^ -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0023]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
[0024]所述一、二、三级种子培养基重量组成为:
[0025]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.1-0.3%，不足部分纯净水补足，pH 值 7.0-7.2，121-123°c灭菌 30_40min。
[0026]所述一级种子罐培养基重量组成为:
[0027]麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药粉剂1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆 0.1-0.5%，磷酸氢二钾 0.8-1.5%，硫酸镁 0.05-0.1%，柠檬酸钠 0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123°C灭菌30_40min。
[0028]所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0xlO8个/ml ；
[0029]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆饼粉15_25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，柠檬酸钠l_5g，消泡剂0.1-1g,纯净水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C灭菌 20min ；
[0030]所述补料培养基重量组成为`:麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，中草药粉剂5-10%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123°C灭菌30_40min。
[0031]所述发酵培养基的调配方法为:
[0032]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.0-7.2，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温15-30min，然后缓慢升温至90°C保温15_30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.0-7.2，121-123°C灭菌30_40min备用。
[0033]所述中草药提取物的制备方法为:分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，然后降温至45-60°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2_4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C~78°C保持3~4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。
[0034]所述中草药的重量份数组成为:沙棘20-30份，决明子20-30份，枸杞10_15份，山药10-15份，北沙参5-10份，黄荆子5-10份，玉竹3-5份，薏米3-5份，大麦芽3_5份，桂花
3-5份，黄芪3-5份；
[0035]所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10% ；
[0036]所述混合酶的重量份数组成为:内P -葡聚糖酶10-20份，外P -葡聚糖酶10-20份，3 -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，^ -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；[0037]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4)2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份。
[0038]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:氯化锌30-40份，氯化钙10-20份，硫酸钠10-20份，氯化镁5-10份。
[0039]本发明含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法:
[0040]将所述保护剂、中草药提取物分别超微粉碎，确保粒度小于其它酶制剂，然后与枯草芽孢杆菌培养物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、3 -葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、3 -甘露聚糖酶均匀混合，最后加入激活剂，混合均匀后密封包装即得成品含中性蛋白酶的生长猪专用酶。
[0041]所述生长猪专用酶适用于饲料加工厂和养殖场自配饲料，使用时应与饲料中的其它原料混合均匀，可事先将本发明与少量饲料混合均匀，再混合到大批饲料中，直接饲喂。建议每吨全价料添加量为:100-150g ；
[0042]本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12是由实验室保藏的一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1398-2经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得。
[0043]本发明提供的产强热稳定性中性蛋白酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌1398-2-12。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院邮编:430072)，保藏号为CCTCC NO:M2013539，分类命名为:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12。
[0044]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12菌株特点如下:
[0045]所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
[0046]本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12具有所产中性蛋白酶耐受温度高、适用pH值范围宽泛的特点，发酵液粗酶液75°C酶活完全稳定，最适反应温度70°C，pH值4.5-8.5酶活稳定，最适反应pH值7.2。该菌株最适生长PH值7.0-7.2，最适生长温度30-36°C，最适产酶温度32-35 °C。
[0047]按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株产强热稳定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢杆菌菌1398-2-12，发酵液中性蛋白酶酶活可达5500-7000U/mL，对酶的热稳定性进行了分析，将粗酶液分别置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔 10 分钟取样测定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分钟酶活没有下降。60°C与65°C下，30分钟降到原有酶活的95%，60分钟降到85%。70°C下，30分钟降到原有酶活的85%，60分钟降到80%。75°C下，30分钟降到原有酶活的80%,60分钟降到70%。
[0048]有益效果:
[0049]1.本发明枯草芽孢杆菌培养物发酵液中含有的中性蛋白酶酶活可达5500-7000U/mL，在40-70°C之间具有较高的酶活，最适反应温度为70°C;在pH值为4.5-8.5时酶活完全稳定，最适反应pH值为7.2 ;该酶在70°C条件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C条件下保存Ih后保持70%以上酶活。比现有的中性蛋白酶热稳定性强，酶活力较高，酶作用最适PH值范围宽泛，储存稳定性高，更加适合饲养生长猪饲料的添加。
[0050]2.本发明枯草芽孢杆菌培养物中的枯草芽孢杆菌菌体可提高动物机体免疫力、促进免疫器官的发育、促进动物肠道结构和机能的成熟、提高动物日增重和改善饲料转化率，更加适合饲养生长猪饲料的添加。
[0051]3.本发明含中性蛋白酶的生长猪专用酶中的保护剂采用多糖、无机盐和氨基酸科学复配，有效减缓了复合酶制剂的回潮；同时可增强复合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高20-30°C，耐冷冻温度可降低10-15°C，有效防止了复合酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长了复合酶的保质期，达到同样的酶活力，比同类产品保质期可延长2-3年。
[0052]4.本发明含中性蛋白酶的生长猪专用酶添加无机盐作为激活剂，创造了酶催化作用的最佳条件，充分发挥了复合酶各酶组份的活力，彻底有效的分解了饲料中淀粉、蛋白质、纤维素、植酸等大分子物质，大大减轻了生长猪动物的消化负担，提高了原料利用率和生长猪的生长率，同时有效防止了粪便造成的环境污染，保护了饲养环境。
[0053]5.本发明含中性蛋白酶的生长猪专用酶添加的中草药提取物既可延长复合酶制剂的保质期，又可提高饲养生长猪的免疫力，有效防止生长猪流行性疾病的发生。
[0054]6.本发明含中性蛋白酶的生长猪专用酶中枯草芽孢杆菌培养物、保护剂、激活剂、中草药提取物与酶制剂的协同作用，使得复合酶的酶活力和效力最大限度的发挥，并相应的提高了饲料的利用率和动物的生长率，增强了动物的食欲和抗病能力，延长了复合酶的保质期和保护了环境。
【具体实施方式】
[0055]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所`限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0056]实施例1
[0057]—种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成:
[0058]枯草芽孢杆菌培养物35份，酸性木聚糖酶40份，酸性蛋白酶25份，植酸酶25份，^ -葡聚糖酶17份，纤维素酶12份，淀粉酶12份，^ -甘露聚糖酶12份，果胶酶8份，中草药提取物12份，保护剂12份，激活剂12份。
[0059]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、^ -葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、P -甘露聚糖酶、果胶酶均为食品级酶制剂；
[0060]所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法包括如下步骤:
[0061](I)将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，30°C培养24h进行菌种活化，如此活化2次；
[0062]所述斜面培养基组成为:牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,琼脂 15g，中草药粉剂 5g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.0，121°C灭菌 20min ；
[0063]所述中草药粉剂的制备方法如下:[0064]以重量份数计，称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70°C保持2h，然后降温至45°C，加入混合物料总重量5%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1，控制温度至60°C保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0065]所述混合酶的重量份数组成为:内葡聚糖酶10份，外葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普鲁兰酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份。
[0066](2)液体种子扩大培养
[0067]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种I环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30°C，培养时间IOh ；
[0068]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0069]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间IOh ；
[0070]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30°C，搅拌速度200rpm，通风量(V/V) 1:1,罐压0.05Mpa,培养时间IOh ；
[0071]所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0072]酵母粉0.3%，葡·萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，中草药粉剂
1.5%，海藻糖1%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH值7.0,121°C灭菌 30min。
[0073]所述一级种子罐培养基重量组成为:
[0074]麦芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草药粉剂1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米浆
0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%,柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121°C 灭菌 30min。
[0075]所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0xlO8个/ml ；
[0076](3)发酵罐发酵
[0077]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度30°C，搅拌速度200r/m，通风量(V/V)l:l，培养时间IOh ;然后以1°C /h降温速率缓慢降温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h降温速率缓慢降温至2°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h ;最后以1°C /h升温速率缓慢升温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h升温速率缓慢升温至30°C，恒温培养15h ；
[0078]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15% ；
[0079]pH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.0 ；
[0080]补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2_5mg/ml ；
[0081 ] 放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。[0082]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆饼粉15g，中草药粉剂30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，柠檬酸钠lg，消泡剂 0.1g,纯净水 1000mL, pH 值 7.0，121°C灭菌 20min ；
[0083]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草药粉剂5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121°C灭菌30min。
[0084]所述发酵培养基的调配方法为:
[0085]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.0，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温15min，然后缓慢升温至90°C保温15min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.0，121°C灭菌30min备用。
[0086](4)发酵液经孔径10 Pm过滤纸板粗滤，然后于10°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量为20%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得枯草芽孢杆菌培养物。
[0087]所述中草药提取物的制备方法为:分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至53°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节PH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至69°C保持4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。
[0088]所述中草药的重量份数组成为:沙棘25份，决明子25份，枸杞17份，山药13份，北沙参8份，黄荆子7份，玉竹4份，薏米4份，大麦芽4份，桂花4份，黄芪4份；
[0089]混合酶添加量为混合物料总重量的5-10% ；
[0090]所述混合酶的重量份数组成为:内(6-葡聚糖酶15份，外(6-葡聚糖酶15份，3 -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普鲁兰酶25份，P -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；
[0091]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份。
[0092]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:氯化锌35份，氯化钙15份，硫酸钠15份，氯化镁7份。
[0093]含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法:
[0094]将所述保护剂、中草药提取物分别超微粉碎，确保粒度小于其它酶制剂，然后与枯草芽孢杆菌培养物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、3 -葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、
3-甘露聚糖酶、果胶酶均匀混合，最后加入激活剂，混合均匀后密封包装即得成品含中性蛋白酶的生长猪专用酶。
[0095]实施例2:
[0096]一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成:
[0097]枯草芽孢杆菌培养物30份，酸性木聚糖酶30份，酸性蛋白酶20份，植酸酶20份，^ -葡聚糖酶15份，纤维素酶10份，淀粉酶10份，^ -甘露聚糖酶10份，果胶酶5份，中草药提取物10份，保护剂10份，激活剂10份。
[0098]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、^ -葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、P -甘露聚糖酶、果胶酶均为食品级酶制剂；
[0099]所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法包括如下步骤:
[0100](I)菌种活化
[0101]将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，33°C培养30h进行菌种活化，如此活化2次；
[0102]所述斜面培养基组成为:牛肉膏6g,氯化钠8g,蛋白胨15g,葡萄糖4g, (NH)2S044g,K2HP047g, CaCl22g，琼脂 18g，中草药粉剂 8g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2，121°C灭菌 20min ；
[0103]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0104]以重量份数计，称取黄芪25份；党参16份；柴胡12份；黄芩12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至50°C，加入混合物料总重量8%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.0，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1.2，控制温度至70°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0105]所述混合酶的重量份数组成为:内(6-葡聚糖酶15份，外(6-葡聚糖酶15份，^ -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，P -淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0106](2)液体种子扩大培养
[0107]①一级种子培养:将步骤(1)活化`后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度33°C，培养时间12h ；
[0108]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0109]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度33°C，培养时间12h ；
[0110]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度33 °C，搅拌速度300rpm，通风量(V/V) 1: 1.5，罐压0.05Mpa,培养时间15h ；
[0111]所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0112]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.0%，中草药粉剂1.8%，海藻糖2%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.2%，不足部分纯净水补足，pH值
7.2，121°C 灭菌 30min。
[0113]所述一级种子罐培养基重量组成为:
[0114]麦芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草药粉剂1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.2%，玉米浆
0.3%，磷酸氢二钾1.0%，硫酸镁0.08%,柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121°C 灭菌 30min。
[0115]所述种子罐发酵液菌体浓度为7.5xl08个/ml ；
[0116](3)发酵罐发酵
[0117]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度35°C，搅拌速度400r/m，通风量(V/V)l:2，培养时间12h ;然后以2°C /h降温速率缓慢降温至12°C，恒温培养18h ;继续以2V /h降温速率缓慢降温至4°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h ;最后以2°C /h升温速率缓慢升温至12°C，恒温培养18h ;继续以2 V /h升温速率缓慢升温至33 °C，恒温培养18h ；
[0118]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20% ；
[0119]pH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.2 ；
[0120]补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2_5mg/ml ；
[0121]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0122]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药粉剂40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂 0.5g,纯净水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 灭菌 20min ；
[0123]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草药粉剂8%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121°C灭菌30min。
[0124]所述发酵培养基的调配方法为:
[0125]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.2，加入中温淀粉酶(311/^玉米粉)与高温淀粉酶(3011/^玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温20min，然后缓慢升温至90°C保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始ρΗ7.2，121°C灭菌30min备用。
[0126](4)发酵液经孔径500 μ m过滤纸板粗滤，然后于15°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量为30%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得枯草芽孢杆菌培养物。
[0127]所述中草药提取物的制备方法为:分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70°C保持2h，然后降温至45°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C保持3h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。
[0128]所述中草药的重量份数组成为:沙棘20份，决明子20份，枸杞10份，山药10份，北沙参5份，黄荆子5份，玉竹3份，薏米3份，大麦芽3份，桂花3份，黄芪3份；
[0129]混合酶添加量为混合物料总重量的5% ；
[0130]所述混合酶的重量份数组成为:内葡聚糖酶10份，外β-葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普鲁兰酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份，酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份；
[0131]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20份，NaC120份，(NH4) 2S0410份，半胱氨酸10份。
[0132]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:氯化锌30份，氯化钙10份，硫酸钠10份，氯化镁5份。
[0133]含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法如实施例1。
[0134]实施例3:
[0135]一种含中性蛋白 酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成:[0136]枯草芽孢杆菌培养物40份，酸性木聚糖酶50份，酸性蛋白酶30份，植酸酶30份，^ -葡聚糖酶20份，纤维素酶15份，淀粉酶15份，P -甘露聚糖酶15份，果胶酶10份，中草药提取物15份，保护剂15份，激活剂15份。
[0137]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、3 -葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、3 -甘露聚糖酶、果胶酶均为食品级酶制剂；
[0138]所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法包括如下步骤:
[0139](I)菌种活化
[0140]将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，36°C培养36h进行菌种活化，如此活化3次；
[0141]所述斜面培养基组成为:牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g, (NH)2S045g, K2HP048g, CaCl23g，琼脂 20g,中草药粉剂 IOg,蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 灭菌 20min ；
[0142]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0143]以重量份数计，称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90°C保持4h，然后降温至60°C，加入混合物料总重量10%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1.5，控制温度至78°C保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0144]所述混合酶的重量份数组成为:内(6-葡聚糖酶20份，外(6-葡聚糖酶20份，^ -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，3 -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
[0145](2)液体种子扩大培养
·[0146]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度36°C，培养时间15h ；
[0147]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0148]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度36°C，培养时间15h ；
[0149]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度36°C，搅拌速度400rpm，通风量(V/V) 1:2，罐压0.05Mpa，培养时间20h ；
[0150]所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0151]酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氢二钾1.5%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值
7.2，123°C灭菌 40min。
[0152]所述一级种子罐培养基重量组成为:
[0153]麦芽糊精15%，酵母0.8%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米浆0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123°C灭菌40mino
[0154]所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0xlO8个/ml ；
[0155](3)发酵罐发酵
[0156]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度36°C，搅拌速度700r/m，通风量(V/V)l:3，培养时间15h ;然后以2V /h降温速率缓慢降温至15°C，恒温培养20h ;继续以2V /h降温速率缓慢降温至5°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h ;最后以2°C /h升温速率缓慢升温至15°C，恒温培养20h ;继续以2V /h升温速率缓慢升温至36°C，恒温培养20h ；
[0157]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30% ；
[0158]pH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.2 ；
[0159]补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2_5mg/ml ；
[0160]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0161 ] 所述发酵培养基组成为:麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药粉剂50g，海藻糖40g，酵母粉Sg，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g，消泡剂Ig,纯净水1000mL, pH值7.2，121°C灭菌20min ；
[0162]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草药粉剂10%,不足部分纯净水补足，pH值7.2，123°C灭菌40min。
[0163]所述发酵培养基的调配方法为:
[0164]按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.2，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温30min，然后缓慢升温至90°C保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始ρΗ7.2，123°C灭菌40min备用。
[0165](4)发酵液经孔径1000 μ m过滤纸板粗滤，然后于20°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量为40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得枯草芽孢杆菌培养物。
[0166]所述中草药提取物的制备方法为:分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90°C保持4h，然后降温至60°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至78°C保持4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物。
[0167]所述中草药的重量份数组成为:沙棘30份，决明子30份，枸杞15份，山药15份，北沙参10份，黄荆子10份，玉竹5份，薏米5份，大麦芽5份，桂花5份，黄芪5份；
[0168]混合酶添加量为混合物料总重量的10%;
[0169]所述混合酶的重量份数组成为:内葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
[0170]所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖30份，NaC130份，(NH4) 2S0415份，半胱氨酸15份。[0171]所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:氯化锌40份，氯化钙20份，硫酸钠20份，氯化镁10份。
[0172]含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法如实施例1。
[0173]实施例4本发明实施例1生长猪专用酶的使用效果试验
[0174]1.饲料种类:全价国标生长猪饲料；
[0175]2.生长猪专用酶添加量:每吨饲料添加100g ；
[0176]3.生长猪专用酶试验组设计:生长猪专用酶重量份数组成分为试验组、对照组1、对照组2 ;其中试验组为本发明实施例1制备的生长猪专用酶；对照组I为试验组组份中除了枯草芽孢杆菌培养物的其余组份；对照组2是市售的生长猪专用酶并且其包含的各酶种类、酶活力和酶重量份数与试验组和对照组I相同；各试验组的具体重量份数组成如表1
[0177]表1
[0178]
【权利要求】
1.一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成:枯草芽孢杆菌培养物30-40份，酸性木聚糖酶30-50份，酸性蛋白酶20-30份，植酸酶20-30份，3 -葡聚糖酶15-20份，纤维素酶10-15份，淀粉酶10-15份，^ -甘露聚糖酶10-15份，果胶酶5_10份，中草药提取物10-15份，保护剂10-15份，激活剂10-15份； 所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法如下:枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2013539经斜面菌种活化和一、二、三级种子培养及一级种子罐培养逐级扩大培养得到种子液；将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36°C，搅拌速度200-700rpm，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10_15h ;然后以1_2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1-2°C /h降温速率缓慢降温至2-5°C，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1_2°C /h升温速率缓慢升温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1-2°C /h升温速率缓慢升温至30-36°C，恒温培养15-20h ;发酵液经孔径10-1000 u m过滤纸板粗滤，然后于10-20°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量为20-40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得枯草芽孢杆菌培养物； 所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:氯化锌30-40份，氯化钙10-20份，硫酸钠10-20份，氯化镁5-10份。
2.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，其特征在于，制备枯草芽孢杆菌培养物的斜面培养基组成为:牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，琼脂 15_20g，中草药粉剂 5-10g,蒸馏水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C灭菌 20min。
3.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，其特征在于，制备枯草芽孢杆菌培养物的种子培养基组成为:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.`5%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%,硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.1-0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123 °C灭菌30_40min。
4.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，其特征在于，制备枯草芽孢杆菌培养物的种子罐培养基组成为:麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123 °C灭菌30_40min。
5.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，其特征在于，制备枯草芽孢杆菌培养物时种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0xlO8个/ml。
6.如权利要求1所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶，其特征在于，制备枯草芽孢杆菌培养物的发酵培养基组成为:麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，柠檬酸钠l_5g，消泡剂0.1-1g,纯净水1000mL, pH值7.0-7.2，121°C 灭菌 20min。
7.一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法，其特征在于，将保护剂、中草药提取物分别超微粉碎，确保粒度小于其它酶制剂，然后与枯草芽孢杆菌培养物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、3-葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、3-甘露聚糖酶、果胶酶均匀混合，最后加入激活剂，混合均匀后密封包装即得成品含中性蛋白酶的生长猪专用酶。
8.如权利要求7所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法，其特征在于，所述含中性蛋白酶的生长猪专用酶由以下重量份数的酶制剂组成:枯草芽孢杆菌培养物30-40份，酸性木聚糖酶30-50份，酸性蛋白酶20-30份，植酸酶20-30份，3 -葡聚糖酶15-20份，纤维素酶10-15份，淀粉酶10-15份，P -甘露聚糖酶10-15份，果胶酶5_10份，中草药提取物10-15份，保护剂10-15份，激活剂10-15份； 所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法如下:枯草芽孢杆菌1398-2-12经斜面菌种活化和一、二、三级种子培养及一级种子罐培养逐级扩大培养得到种子液；将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36°C，搅拌速度200-700rpm，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10-15h ;然后以1_2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h降温速率缓慢降温至2-5°C，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1_2°C /h升温速率缓慢升温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h升温速率缓慢升温至30-36°C，恒温培养15-20h ;发酵液经孔径10-1000 u m过滤纸板粗滤，然后于10-20°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量为20-40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得枯草芽孢杆菌培养物； 所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:氯化锌30-40份，氯化钙10-20份，硫酸钠10-20份，氯化镁5-10份。
9.如权利要求8所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法，其特征在于，所述中草药提取物的制备方法为:分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70°C~90°C保持2~4h，然后降温至45_60°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节PH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C~78°C保持3~4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物； 所述中草药的重量份数组成为:沙棘20-30份，决明子20-30份，枸杞10-15份，山药10-15份，北沙参5-10份，黄荆子5-10份，玉竹3-5份，薏米3-5份，大麦芽3_5份，桂花3_5份，黄芪3-5份； 所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10% ； 所述混合酶的重量份数组成为:内P -葡聚糖酶10-20份，外P -葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，3 -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
10.如权利要求8所述的一种含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法，其特征在于，所述含中性蛋白酶的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成:枯草芽孢杆菌培养物35份，酸性木聚糖酶40份，酸性蛋白酶25份，植酸酶25份，3 -葡聚糖酶17份，纤维素酶12份，淀粉酶12份，β -甘露聚糖酶12份，果胶酶8份，中草药提取物12份，保护剂12份，激活剂12份； 所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法包括如下步骤: (1)将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，30°C培养24h进行菌种活化，如此活化2次； 所述斜面培养基组成为:牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,琼脂 15g，中草药粉剂 5g，蒸馏水 1000mL, pH 值 7.0，121°C灭菌 20min ； 所述中草药粉剂的制备方法如下: 以重量份数计，称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70°C保持2h，然后降温至45°C，加入混合物料总重量5%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1，控制温度至60°C保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂； 所述混合酶的重量份数组成为:内P -葡聚糖酶10份，外P -葡聚糖酶10份，P -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普鲁兰酶20份，3 -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份，酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份； (2)液体种子扩大培养 ①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种I环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30°C，培养时间IOh ； ②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同； ③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间IOh ； ④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30°C，搅拌速度200rpm，通风量(V/V)l:l，罐压0.05Mpa，培养时间IOh ； 所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为: 酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，中草药粉剂1.5%，海藻糖1%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121°C 灭菌 30min ； 所述一级种子罐培养基重量组成为: 麦芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草药粉剂1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米浆0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%,柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121°C灭菌30min ； 所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0xlO8个/ml ； (3)发酵罐发酵 将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度30°C，搅拌速度200r/m，通风量(V/V)l:l，培养时间IOh ;然后以1°C /h降温速率缓慢降温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h降温速率缓慢降温至2°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h ;最后以1°C /h升温速率缓慢升温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h升温速率缓慢升温至30°C，恒温培养15h ； 溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15% ； pH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.0 ； 补料控制:添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2-5mg/ml ； 放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢； 所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆饼粉15g，中草药粉剂30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，柠檬酸钠lg，消泡剂 0.1g,纯净水 1000mL, pH 值 7.0，121°C 灭菌 20min ； 所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草药粉剂5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121。。灭菌30min ； 所述发酵培养基的调配方法为: 按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.0，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温15min，然后缓慢升温至90°C保温15min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.0，121°C灭菌30min备用； (4)发酵液经孔径10 过滤纸板粗滤，然后于10°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量为20%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得枯草芽孢杆菌培养物； 所述中草药提取物的制备方法为:分别将中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80°C保持3h，然后降温至53°C，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节PH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至69°C保持4h，过滤；滤液减压浓缩至固形物含量为20%以上，然后冷冻干燥获得中草药提取物； 所述中草药的重量份数组成为:沙棘25份，决明子25份，枸杞17份，山药13份，北沙参8份，黄荆子7份，玉竹4份，薏米4份，大麦芽4份，桂花4份，黄芪4份； 混合酶添加量为混合物料总重量的5-10% ；所述混合酶的重量份数组成为:内P -葡聚糖酶15份，外P -葡聚糖酶15份，P -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普鲁兰酶25份，3 -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份； 所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成:氯化锌35份，氯化钙15份，硫酸钠15份，氯化镁7份； 含中性蛋白酶的生长猪专用酶的制备方法: 将所述保护剂、中草药提取物分别超微粉碎，确保粒度小于其它酶制剂，然后与枯草芽孢杆菌培养物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、3 -葡聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、^ -甘露聚糖酶、果胶酶均匀混合，最后加入激活剂，混合均匀后密封包装即得成品含中性蛋白酶的生长猪专用酶。
【文档编号】A23K1/165GK103667220SQ201310732890
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】李海清, 胡永明, 胡波, 封章平, 王永兰 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司