用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(her-3)相关疾病的材料和方法

专利名称：用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(her-3)相关疾病的材料和方法
技术领域：
本发明涉及通过施用第一剂与第二剂的组合以治疗患有人表皮生长因子受体-3(HER-3)相关疾病的受治疗者的材料和方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与人表皮生长因子受体(HER)家族的另一成员结合和/或抑制该成员。该第一剂和第二剂可能为分别与HER-3结合或与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员的任何种类的分子，包括但不限于生物性化合物，诸如抗原结合蛋白、小分子酪氨酸激酶抑制剂、SiRNA或天然物质。
现有技术
HER-3 (也称为Erb3)是一种受体蛋白酪氨酸激酶，其属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGF-R)家族，该家族也包括HER-I (也称为EGF-R或erbB)、HER-2 (也称为 erbB2)和 HER_4(也称为 erbB4) (Plowman 等人· (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. US. 87 4905-4909 ；Kraus 等人·(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. US. 86 :9193-9197 ；和 Kraus 等人· (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. US. 90 :2900-2904)。与原型表皮生长因子受体一样，该跨膜受体HER-3是由胞外配体-结合结构域(ECD)、ECD内的二聚化结构域、跨膜结构域(TMD)、胞内蛋白酪氨酸激酶结构域(TKD)和C端磷酸化结构域组成。HER-3的配体又称为人表皮生长因子受体调节蛋白(heregulin) (HRG)，其与HER-3的胞外结构域结合，并通过促进与其他人表皮生长因子受体(HER)家族成员的二聚化、随后使该胞内HER-3结构域转磷酸化并活化下游信号级联放大以活化受体介导的信号传递。与多个HER家族成员形成二聚体扩大HER-3的信号传递潜力，且是一种使信号多样化和使信号放大的方式。

发明内容
本发明涉及通过施用第一剂与第二剂的组合以治疗患有人表皮生长因子受体-3 (HER-3)相关疾病的受治疗者的材料和方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员。该第一剂和第二剂可能为分别与HER-3结合或与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员的任何种类的分子，包括但不限于生物性化合物，诸如抗原结合蛋白、小分子酪氨酸激酶抑制剂、siRNA或天然物质。在一个方面中，本发明特征在于一种治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂与HER-3结合且该第二剂与HER家族的另一成员结合和/或抑制该成员的活性。该第一剂可为与HER-3结合的小分子化合物或抗原结合蛋白。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列；该重链氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO236、251、252和256组成的组的CDRHl、选自由SEQ ID NO :258、278、280和282组成的组的CDRH2和选自由SEQ ID NO :283、285、309、313和315组成的组的CDRH3 ;且该轻链氨基酸序列包含选自由SEQ ID N0:320、334、337 和 340 组成的组的CDRL1、选自由SEQ ID NO:343、356、351和344组成的组的CDRL2和选自由SEQ ID NO :360、381、385和387组成的组的CDRL3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的CDR中的至少一种(a)如SEQ IDNO :236、2 51、252 和 256 中所示的 CDRHl ;(b)如 SEQ ID NO :258、278、280 和 282 中所示的 CDRH2;和(c)如 SEQ ID NO :283、285、309、313 和 315 所示的 CDRH3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的CDR中的至少一种(d)如SEQ ID NO :320、334、337和340所示的 CDRLl ； (e)如 SEQ ID NO : 343、356、351 和 344 所示的 CDRL2 ;和(f)如 SEQ ID NO :360、381、385 和 387 所示的 CDRL3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的CDR中的至少一种(a)如 SEQ ID NO :236、251、252 和 256 所示的 CDRHl ； (b)如 SEQ ID NO :258、278、280和 282 所示的 CDRH2 ;和(c)如 SEQ ID NO :283、285、309、313 和 315 所示的 CDRH3 ;且该轻链氨基酸序列包含选自由下列组成的组CDR中的至少一种(d)如SEQ ID NO :320、334、337和 340 所示的 CDRLl ； (e)如 SEQ ID NO :343、356、351 和 344 所示的 CDRL2 ;和(f)如 SEQID NO :360、381、385和387所示的CDRL3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含重链氨基酸序列或轻链氨基酸序列；该重链氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO :236、251、252 和 256 组成的组的 CDRH1、选自由 SEQ ID NO :258、278、280 和 282组成的组的CDRH2和选自由SEQ ID NO :283、285、309、313和315组成的组的CDRH3 ;且该轻链氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO :320、334、337和340组成的组的CDRL1、选自由SEQID NO :343、356、351 和 344 组成的组的 CDRL2 和选自由 SEQ ID NO :360、381、385 和 387 组成的组的CDRL3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQID N0:42、54、70、92和96组成的组的重链氨基酸序列。该抗原结合蛋白可包含选自由SEQID NO :44、56、72、94和98组成的组的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQID N0:42、54、70、92和96组成的组的重链氨基酸序列和选自由SEQ ID NO :44、56、72、94和98组成的组的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含SEQ ID NO 42的重链氨基酸序列和SEQ ID NO 44的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含SEQ ID NO :54的重链氨基酸序列和SEQ ID NO 56的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含SEQ ID NO :70的重链氨基酸序列和SEQ ID NO :72的轻链氨基酸序列。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQ ID NO :283、285、309、313和315组成的组的⑶RH3。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白包含选自由SEQ ID NO :360、381、385和387组成的组的CDRL3。该抗原结合蛋白可定向抗HER-3的胞外结构域。该抗原结合蛋白与HER-3的结合可减少HER-3介导的信号传导、减少HER-3的磷酸化、减少细胞增殖、减少细胞迁移和/或增加HER-3的下调。与HER-3结合的所述抗原结合蛋白可为抗体。该抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人源抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段(例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双价抗体(diabody)或单链抗体分子)。该抗体可为 IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4 类型。该第一剂可为与HER-3结合的抗原结合蛋白，且该抗原结合蛋白可与效应基团偶合。该效应基团可为放射性同位素或放射性核素、毒素、或治疗性或化学治疗性基团(例如选自由刺孢霉素(calicheamicin)、耳抑素-PE(auristatin-PE)、格尔德霉素(geIdanamycin)、美登素(maytansine)及其衍生物组成的组的治疗性或化学治疗性基团)。该第二剂可为小分子化合物或抗原结合蛋白。该第二剂可为，例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)、拉帕替尼(Iapatinib)、来那替尼(neratinib)、帕尼单抗(panitumumab)、 埃罗替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)和T-DM1。在另一个方面中，本发明特征在于一种治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂是与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQ ID NO :42和轻链氨基酸序列SEQ ID N0:44，且其中该第二剂是选自由埃罗替尼、拉帕替尼和来那替尼组成的组。此外，本发明特征在于治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂是与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQ ID NO 54和轻链氨基酸序列SEQ ID NO :56，或与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQID NO 70和轻链氨基酸序列SEQ ID NO :72，且其中该第二剂选自由埃罗替尼、拉帕替尼和来那替尼组成的组。本发明特征还在于一种治疗或预防受治疗者的HER-3相关疾病的方法，该方法包含对该受治疗者施用第一剂和第二剂，其中该第一剂是与HER-3结合的抗原结合蛋白且包含重链氨基酸序列SEQ ID NO :42和轻链氨基酸序列SEQ ID NO :44，且其中该第二剂选自由曲妥珠单抗、T-DMl、帕尼单抗和西妥昔单抗组成的组。本发明所提供的方法可任选地包含施用第三剂或其他治疗剂和/或放射性治疗。该第三剂或其他治疗剂可为抗肿瘤剂(例如抗肿瘤抗体或化学治疗剂，诸如卡培他滨(capecitabine)、蒽环类(anthracycline)、多柔比星(doxorubicin)、环憐酸胺(cyclophosphamide)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他奇(docetaxel)、顺钼(cisplatin)、吉西他滨(gemcitabine)或卡钼(carboplatin))。该第一剂和该第二剂可经静脉、皮下、肌肉或口服施用。该疾病可为过度增殖性疾病(例如选自由乳癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、胰癌、表皮样癌、纤维肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌和鳞状细胞癌组成的组的疾病)。本文所提供的方法可包括以每6周至少一次的频率施用约I至约20mg/kg体重剂量的该第一剂。该方法可包括以每6周至少一次的频率施用约I至约20mg/kg体重剂量的该第二剂。所述方法还可包含在施用前使用包含分析预测性标志以选择患有HER-3相关疾病的受治疗者的方法。所述方法还可包含在施用后监测治疗结果。除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明的相关领域的一名普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料都可被用于实行本发明，但将适当的方法和材料描述于下文。本文所提及的出版物、申请、专利及其他参考文献中的每一个通过引用全文并入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实例仅为示例性的而非意图限制。本发明的一个或多个实施方案的细节在下文所附的附图和说明中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将是由详细说明、图式及由权利要求而显而易见的。附图简沭图I说明单独使用人源抗-HER-3抗体和帕尼单抗或组合使用二者对非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植肿瘤(Calu-3)生长的影响。图2说明单独使用人源抗-HER-3抗体和埃罗替尼或组合使用二者对Calu_3生长的影响。 图3说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4 (HER2 二聚化抑制剂)或曲妥珠单抗对SkBr_3乳癌细胞的基底非贴壁依赖性生长的影响。图4说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或西妥昔单抗对SkBr-3乳癌细胞的经HRG刺激的非贴壁依赖性生长的影响。图5说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或西妥昔单抗对MDA-MB-435卵巢癌细胞的基底非贴壁依赖性生长的影响。图6A至6D说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与曲妥珠单抗(图6A)、拉帕替尼(图6B)、吉西他滨(图6C)或顺钼(图6D)对MDA-MB-175VII乳癌细胞的增殖的影响。图7说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对ZR-75-30乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。图8说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对BT474乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。图9说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4或曲妥珠单抗对经HRG刺激的DLD-I结肠癌细胞的增殖的影响。

图10说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4或曲妥珠单抗或拉帕替尼对HCC-1569乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。图11说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对SkBr-3乳癌细胞的经HRG刺激的增殖的影响。图12说明单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与帕尼单抗对FaDu头颈癌细胞的增殖的影响。图13的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4或曲妥珠单抗对MDA-MB-175VII乳癌细胞中HER-3 (上图)、Akt (中图)和ERK (下图)的磷酸化的影响。图14的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4、曲妥珠单抗或拉帕替尼对经HRG刺激的SkBr-3乳癌细胞中HER-3 (上图)、Akt (中图)和ERK (下图)的磷酸化的影响。
图15的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、帕妥珠单抗(c2C4)或曲妥珠单抗对经HRG刺激的Lsl74T结肠癌细胞中HER_3(上图)或Akt (下图)的磷酸化的影响。图16的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与西妥昔单抗、c2C4或曲妥珠单抗对经HRG刺激的HCC1569乳癌细胞中HER-3 (上图)、Akt (中图)和 ERK (下图)的磷酸化的影响。图17的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与帕尼单抗对A549肺泡上皮细胞中Akt、PGFR、HER-2、HER-3、HER-4和ERK的磷酸化的影响。第I行，IgG对照组；第2行，单独使用帕尼单抗；第3行，单独使用U1-59 ；第4行，组合使用U1-59与帕尼单抗。微管蛋白被用来作为相同上样的对照。图18的蛋白质印迹照片显示单独使用人源抗-HER-3抗体或组合使用人源抗-HER-3抗体与帕尼单抗或拉帕替尼对Calu3 NSCLC细胞中HER-3、Akt、HER-2、ERK和EGF-R的磷酸化的影响。第I行，IgG对照组；第2行，单独使用帕尼单抗；第3行，单独使用U1-59 ;第4行，单独使用拉帕替尼；第5行，组合使用U1-59与帕尼单抗；第6行，组合使用U1-59与拉帕替尼。图19说明单独使用人源抗-HER-3抗体和拉帕替尼或组合使用二者对乳癌异种移植肿瘤(HCC-1569)生长的影响。 图20显示以U1-59治疗A549NSCLC细胞抑制HER3磷酸化和减少吉非替尼(gefitinib)治疗后的再活化。A549细胞经吉非替尼、U1-59或二者治疗，HER3的磷酸化由ELISA分析评估。以吉非替尼治疗I小时导致HER磷酸化的部分抑制，但在24小时后逆转到对照量。相反地，以U1-59治疗导致24小时后持续的HER磷酸化的较大抑制。组合两种剂的治疗防止在以吉非替尼单独治疗24小时后的细胞中所见到的该抑制作用的逆转。实验于一式三份的孔中进行，并重复至少二次。结果以平均值土标准偏差表示。发明详述本文使用的段落标题仅供组织的目的，不可被视为限制所描述的主题。除非本文另外加以定义，关于本申请所使用的科学和技术术语应具有本领域的一般技术人员通常所理解的意义。另外，除非上下文中另外要求，单数术语应包括复数意义且复数术语应包括单数意义。一般来说，本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质和核酸化学和杂交的相关使用的命名法和技术是本领域熟知且经常使用的那些。本申请的方法和技术通常根据本领域中熟知的常规方法进行，并且除非另外说明否则如同本说明书各处引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献所述。见例如SambiOOk等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001), Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学的现有程序)，Greene PublishingAssociates (1992)和 Harlow 和 Lane Antibodies A Laboratory Manual (抗体实验室手册)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N. Y. (1990),每个参考文献的内容通过引用全文并入本文。酶反应和纯化技术是根据制造商说明书，以本领域通常完成或本文所描述的方式进行的。本文所述的分析化学、合成有机化学、医学和制药化学的相关使用的术语以及实验室方法和技术是本领域熟知且经常使用的那些。标准技术可被用于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送及患者治疗。应理解的是，本发明并不限于本文所描述的特定方法、程序和试剂等，因此可以变化。本文所使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并不意图限制仅由该权利要求所定义的范围。除了在操作实施例或另外说明的处以外，应理解所有表示本文所使用的成分的量或反应条件的数字在所有情况下由术语“约”所修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可表不+/_1 %。I. 一般概况
本发明提供涉及使用第一剂与第二剂的组合以治疗或预防HER-3相关疾病的材料和方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与HER家族的其他成员结合和/或抑制该成员的活性。该第一剂和第二剂可以为生物性化合物，诸如抗原结合蛋白或小分子酪氨酸激酶抑制剂。举例来说，本发明提供与HER家族的单个或多个成员(诸如HER-3、HER-2、EGF-R、HER-4和/或HER家族的任何其他成员)结合和/或抑制该成员的分离的多肽(例如结合蛋白诸如抗体)和/或小分子酪氨酸激酶抑制剂。本发明还提供包含第一剂和第二剂的组合物及使用其治疗或预防HER-3相关疾病的方法，该第一剂与HER-3结合且该第二剂与其他HER家族成员中的一个或多个结合和/或抑制该成员的活性。本发明所描述的某些第一剂和/或第二剂为生物制剂，诸如抗原结合蛋白。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白的多肽结构分别基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、迷你抗体(minibody)、结构域抗体、合成抗体(有时称为“抗体拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人源抗体、抗体融合物(有时称为“抗体轭合物”)及其片段。不同的结构进一步描述于下文。在其他实施方案中，该第一剂和/或第二剂是小分子酪氨酸激酶抑制齐U。在还有另外的实施方案中，该第一剂和/或第二剂是siRNA。在还有另外的实施方案中，该第一剂和/或第二剂是天然物质。本发明所描述的组合物及使用其的方法已被证实对表达HER-3和HER家族的至少一种其他成员的实体肿瘤的生长的增加的抑制。特别是相较于单独施用与HER-3结合的第一剂或结合和/或抑制HER家族的至少一种其他成员的第二剂，施用该第一剂与第二剂的组合已在本发明中证实在抑制各种肿瘤生长上的增加的功效。因此，本发明所公开的组合物和方法已证实于治疗和预防肿瘤疾病诸如癌的改进方法中的效用。2. HER-3 结合剂如本发明所述，与HER-3结合的剂可为生物性化合物，包括但不限于抗原结合蛋白，诸如抗体或小分子酪氨酸激酶抑制剂。本发明所使用的“抗原结合蛋白”或本文所使用的“结合蛋白”是指与特定目标抗原诸如HER家族的成员(例如HER-3)特异性结合的蛋白。当抗原结合蛋白与其目标抗原的解离常数(KD)为< KT8M时，被称为“特异性结合”。当Kd为彡5X 10_9M时，该抗体以“高亲和性”与抗原结合，当Kd为彡5X IO^10M时则为“非常高亲和性”的结合。在一个实施方案中，该抗体具有< KT9M的Kd并具有约1X10—4/秒的解离速率。在一个实施方案中，该解离速率为约IX IO5/秒。在其他实施方案中，该抗体将以约10_8M至ΙΟ,Μ之间的Kd与HER家族的特定成员结合，并且在还有另一个实施方案其将以Kd ( 2X IO-10结合。另外，如本文所使用的，小分子化合物是化学合成的以抑制一种或多种蛋白激酶(包括丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸激酶)的酶活性的低分子量化合物。在一些实施方案中，当该HER-3结合剂为生物性化合物时，该剂为抗原结合蛋白，诸如可与HER-3结合的抗体。因此本发明提供用于治疗HER-3相关疾病的组合物和方法中的HER结合蛋白，包括抗-HER-3抗体。在一些实施方案中，靶向HER-3的抗体可以定向抗HER-3的胞外结构域(ECD)。举例来说，如本文所描述的，抗-HER-3抗体可与HER-3的胞外部分的至少一个表位相互作用。该表位可位于氨基末端的LI结构域(氨基酸19至184)、SI (氨基酸185至327)和S2 (氨基酸500至632)富含半胱氨酸的结构域以及在两侧为富 含半胱氨酸的结构域的L2结构域(328至499)或HER-3各结构域的组合中。该表位也可能位于各结构域的组合中，诸如但不限于包含LI和SI的部分的表位。HER-3结合蛋白的另一项表征在于，其与HER-3的结合减少HER-3介导的信号传导。HER-3介导的信号传导减少可能是因为例如HER-3下调导致至少部分的HER-3分子从细胞表面消失，或是因为细胞表面上HER-3以基本上无活性的形式(也就是相较于非稳定形式呈现较低的信号传导的形式)的稳定化所致。可选择地，HER-3介导的信号传导减少也可能是因为影响(例如减少或抑制)配体或HER家族的另一成员与HER-3的结合所致。举例来说，HER-3介导的信号传导减少也可通过减少与其他HER家族成员(例如EGF-R)形成含HER-3的二聚体所致。HER-3结合剂可为具有类抗体结合活性(例如具有类似抗-HER-3抗体的活性)的支架蛋白或抗体(意即抗-HER-3抗体)。本文所使用的术语“支架蛋白”是指具有对氨基酸插入、取代或缺失高度耐受的暴露的表面区域的多肽或蛋白。可用于本发明的支架蛋白的实例包括来自金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A、来自大菜粉蝶(Pieris brassicae)的胆素结合蛋白或其他脂质运载蛋白(Iipocalin)、锚蛋白(ankyrin)重复蛋白和人纤维粘连蛋白(fibronectin)(于 Binz 和 Pluckthun (2005) Curr.Opin. Biotechnol. 16 :459-69中综述)。支架蛋白的工程化可被视为移植或嵌入亲和性功能至稳定折叠的蛋白的结构骨架之上或之中。亲和性功能是指如本发明所述的蛋白结合亲和性。支架在构造上可与赋予结合特异性的氨基酸序列分开。一般来说，看上去适用于发展这类人造亲和性试剂的蛋白质可能通过合理或最常见的组合式蛋白工程技术获得，诸如在体外展示的人造支架库中筛选抗HER_3(不论是经纯化的蛋白或在细胞表面展示的蛋白)的结合剂，该技术为本领域已知的(见例如Skerra(2000) J. Mol. Recog. 13 :167-87 ;和Binz和Pluckthun,同上)。此外,具有类抗体结合活性的支架蛋白可源自包含该支架结构域的受体(acceptor)多肽，该受体多肽可接受供体多肽的结合结构域的移植以将该供体多肽的结合特异性赋予包含支架结构域的该受体多肽。该插入的结合结构域可为例如抗体，特别是抗-HER-3抗体，的互补决定区(OTR)。插入可通过本领域的那些技术人员已知的各种方法完成，包括例如多肽合成、编码氨基酸的核酸合成以及本领域的那些技术人员熟知的各种形式的重组方法。术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体(Jones等人(1986)Nature 321 :522-525 ;Riechmann 等人·(1988)Nature332 :323-329 ;和Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596)、嵌合抗体(Morrison 等人· (1984) Proc.Natl. Acad. Sci. US. 81 =6851-6855)、由至少二个抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)或其抗体片段。术语“抗体片段”包含前述抗体的任何部分，诸如它们的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段、双价抗体(Hollinger 等人.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. US 90 :6444-6448)、单链抗体分子(Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (单克隆抗体的药理学)Il3, Rosenburg 和 Moore 编辑，Springer Verlag,N. Y. (1994), 269-315)和能表现出与HER-3结合的所期望能力的其他片段。此外，本文所使用的术语“抗体”包括含有抗体的工程化亚结构域的类抗体分子或天然存在的抗体变体。这些类抗体分子可能为单结构域抗体，诸如来源于天然来源如骆驼(Muyldermans 等人.(2001) Rev. Mol. Biotechnol. 74 :277-302)或经由人、胳马它或其他物种的体外展示文库(Holt等人(2003)Trends Biotechnol. 21 :484-90)获得的RVh或仅Vlj的结构域。“Fv片段”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区是由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密、非共价的连接形成的二聚体组成。在 这种构型下，各可变结构域的三个CDR相互作用以界定在Vh-'二聚体的表面上的抗原结合位点。这六个CDR赋予该抗体抗原结合特异性。然而，即使是单一可变结构域(或仅包含3个对抗原特异的⑶R的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常以低于完整的结合位点的亲和性。“Fab片段”也包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。“Fab片段”与“Fab’片段”的不同处在于Fab’片段的重链CHl结构域的羧基端增加数个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。“F(ab’)2片段”最初被产生为之间具有铰链半胱氨酸的一对“Fab’片段”。制备这类抗体片段的方法(诸如木瓜酶或胃蛋白酶消化)是本领域的技术人员已知的。抗体可为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类型，包括IgG或IgM类型，诸如但不限于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgMl和IgM2类型。举例来说，在某些情况中，该抗体是IgGl、IgG2或IgG4类型。在某些方案中(例如关于作为抗HER-3的治疗候选物的抗体的产生)，能够固定补体并参与补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体是所期望的。有一些具有相同作用的同种型的抗体，包括例如小鼠IgMdhIl IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人源IgM、人源IgGl、人源IgG3和人源IgA。应理解的是所产生的抗体最初不必然具备该同种型，所产生抗体反而可具有任何同种型且所述抗体可以通过利用本领域熟知的常规分子生物技术于适当的表达载体中通过将分子克隆的V区基因或cDNA添加至分子克隆的恒定区基因或cDNA，接着利用本领域已知的技术于宿主细胞中表达该抗体而被同种型转换。该同种型转换的抗体也可具备经分子工程化以具有相较于天然存在的变体较强⑶C(IduSOgie等人.(2001) J. Immunol. 166 2571-2575)并利用本领域已知的技术于宿主细胞中重组表达的Fe区。这类技术包括使用直接重组技术(见例如美国专利第4，816，397号)、细胞-细胞融合技术(见例如美国专利第5，916，771和6，207，418号)等。在细胞-细胞融合技术中，制备具有带有任何所期望的同种型的重链的骨髓瘤或其他细胞系诸如CHO并制备具有轻链的另一骨髓瘤或其他细胞系诸如CH0。该细胞之后可被融合并分离表达完整抗体的细胞系。举例来说，具有与HER-3抗原的所期望的结合的人源抗-HER-3IgG4抗体可被轻易地同种型转换以产生人源IgM、人源IgGl或人源IgG3同种型，同时仍具有该相同的可变区(该区界定抗体的特异性和部分的亲和性)。该分子接着可能能够固定补体并参与CDC。
另外，抗体也可以能够与效应细胞诸如单核细胞和自然杀伤(NK)细胞上的Fe受体结合并参与抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。有一些抗体同种型具有相同作用，包括但不限于下列小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人源IgGl和人源IgG3。应了解的是所产生的抗体最初不必然具备该同种型，所述抗体反而可具备任何同种型且所述抗体可以通过利用本领域熟知的常规分子生物技术于适当的表达载体中通过将分子克隆的V区基因或cDNA添加至分子克隆的恒定区基因或cDNA，接着利用本领域已知的技术于宿主细胞中表达该抗体而被同种型转换。该同种型转换的抗体也可具备经分子工程化以具有相较于天然存在的变体较强ADCC(Shields等人.(2001) J. Biol. Chem. 276 :6591-604)并利用本领域已知的技术于宿主细胞中重组表达的Fe区。这类技术包括使用直接重组技术(见例如美国专利第4，816，397号)、细胞-细胞融合技术(见例如美国专利第5，916，771和6，207，418号)等。在细胞-细胞融合技术中，制备具有带有任何所期望的同种型的重链的骨髓瘤或 其他细胞系诸如CHO并制备具有轻链的另一骨髓瘤或其他细胞系诸如CH0。该细胞之后可被融合并分离表达完整抗体的细胞系。举例来说，具有与HER-3抗原的所期望的结合的人源抗-HER-3IgG4抗体可被轻易地同种型转换以产生人源IgGl或人源IgG3同种型，同时仍具有该相同的可变区(该区界定抗体的特异性和部分的亲和性)。该分子接着可能能够效应细胞上的Fe Y R结合并参与ADDC。本文的表10提供抗HER-3的抗体中可包括的多种⑶R的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的靶向ffiR-3的结合蛋白可包括重链氨基酸序列和/或轻链氨基酸序列，该重链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的至少一种⑶R : (a)如SEQ ID N0:2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230 所示的 CDRHl ； (b)如 SEQ ID NO 2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230 所示的 CDRH2 ;和(c)如 SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、I12、I16、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230所示的CDRH3 ;且该轻链氨基酸序列包含选自由下列组成的组的至少一种CDR (d)如SEQID NO :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRLl ； (e)如 SEQID NO :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、I10、I14、I18、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL2 ;和(f)如 SEQID NO :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232 所示的 CDRL3，如本文随本申请一起提交的序列表所示。
在一些实施方案中，分离的靶向HER-3的结合蛋白可包含选自由SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26、30、34、36、40、42、46、50、54、60、62、66、70、74、78、80、84、88、92、96、100、104、108、I12、I16、120、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226 和 230 所组成的组的重链氨基酸序列和 / 或选自由 SEQ ID NO :4、8、12、16、20、24、28、32、38、44、48、52、56、58、64、68、72、76、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228 和 232所组成的组的轻链氨基酸序列，如本文随本申请一起提交的序列表所示。
在一些实施方案中，抗-HER-3抗体可包含如SEQ ID NO :2和4、6和8、10和12、14 和 16、18 和 20,22 和 24,26 和 28,30 和 32,36 和 38,42 和 44,46 和 48,50 和 52,54 和56,60 和 58,62 和 64,66 和 68,70 和 72,74 和 76,78 和 82,80 和 82,84 和 86,88 和 90,92和 94,96 和 98,100 和 102,104 和 106,108 和 110,112 和 114,116 和 118,122 和 124,126和 128、130 和 132、134 和 136、138 和 140、142 和 144、146 和 148、150 和 152、154 和 156、158 和 160、162 和 164、166 和 168、170 和 172、174 和 176、178 和 180、182 和 184、186 和188,190 和 192,194 和 196,198 和 200,202 和 204,206 和 208,210 和 212,214 和 216,218和220、222和224、226和228、230和232中所示的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，或如SEQ ID NO :34、40、60、62或120中的任一个所示的重链氨基酸序列，或如SEQ ID NO 58或64所示的轻链氨基酸序列,如本文随本申请一起提交的序列表所示。在一些实施方案中，靶向HER-3的蛋白可为具有类抗体结合活性的支架蛋白(例如具有类似抗-HER-3抗体的活性)或抗体(例如抗-HER-3抗体)。该抗-HER-3抗体可选自由命名为 U1-1、U1-2、U1-3、U1-4、U1-5、U1-6、U1-7、U1-8、U1-9、U1-10、U1-11、U1-12、U1-13、Ul-14、Ul-15、Ul-16、Ul-17、Ul-18、Ul-19、Ul-20、Ul-21、Ul-22、Ul-23、Ul-24、U1-25、Ul-26、Ul-27、Ul-28、Ul-29、Ul-30、Ul-31、Ul-32、Ul-33、Ul-34、Ul-35、Ul-36、U1-37、Ul-38、Ul-39、Ul-40、Ul-41、Ul-42、Ul-43、Ul-44、Ul-45、Ul-46、Ul-47、Ul-48、U1-49、Ul-50、Ul-51、Ul-52、Ul-53、U1-55. I、Ul-55、U1-57. I、Ul-57、Ul-58、Ul-59、U1-61. I、U1-61和U1-62的抗体所组成的组,或者是具有前述抗体中的一个的至少一个重链或轻链的抗体。命名为 U1-49(SEQ ID NO :42/44)、Ul-53 (SEQ ID NO :54/56)和 Ul-59 (SEQ ID NO:70/72)的抗体或具有所述抗体中的一个的至少一个重链或轻链的抗体可为特别有用的。应了解的是本发明所提供的HER-3结合蛋白的氨基酸序列不限于20个常规氨基酸(见 Immunology-A Synthesis (免疫学-合成)(第二版,Golub 和 Gren 编辑.，SinauerAssociates, Sunderland,Mass. (1991),其通过引用全文并入本文)。举例来说，所述氨基酸可能包含所述20个常规氨基酸的立体异构物(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如a-，a - 二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸。非常规氨基酸(其也可能为本发明所提供的结合蛋白的适合成份)的实例包括4-羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸盐、e -N, N, N-三甲基赖氨酸、e -N-乙酰基赖氨酸、0_磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、a -N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨酸，例如4-羟基脯氨酸。另外，在SEQ ID NO :1至390(列示于本申请一起提交的附件中)所示的氨基酸序列中的轻微变异被认为包含于本发明中，条件是所述氨基酸序列中的变异维持至少75 %(例如至少80%、90%、95%或99% )的SEQ ID NO :I至390所示序列。变异可发生在框架区内(即⑶R之外)、⑶R之内或在框架区和⑶R之内。在一些实施方案中，SEQ ID NO:I至390所示的氨基酸序列中的变异，即至少一个氨基酸的缺失、插入和/或取代，可发生在靠近功能性结构域的边界处。结构性和功能性结构域可通过将该核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或专用序列数据库比较来确认。计算机比较法可被用来确定存在于已知结构和/或功能的其他结合蛋白中的序列基序或预测的蛋白质构形结构域。确定折叠为已知的三维结构的蛋白序列的方法是本本领域已知的。(见例如Bowie等人.(1991) Science253 164 ；Proteins, Structures and Molecular Principles (蛋白质、结构和分子原理)(Creighton编辑,W H. Freeman and Company, New York (1984)) ；Introduction to ProteinStructure (蛋白质结构介绍)(Branden 和 Tooze 编辑，Garland Publishing, New York,N. Y. (1991);和Thornton等人.(1991)Nature 354 :105，所述参考文献通过引用全文并入本文。)因此，本领域 的技术人员能识别可用来界定本文所述的蛋白的结构性和功能性结构域的序列基序和结构构形。在SEQ ID NO :1至390所示的氨基酸序列中的变异可包括那些导致对蛋白水解或氧化的感受性降低、改变糖基化模式或改变结合亲和性或者赋予或修饰该结合蛋白的其他物理化学或功能性特性的变异。特别是可考虑保守性氨基酸取代。保守性取代是指那些发生于侧链相关的氨基酸家族内的取代。氨基酸家族包括下列酸性家族=天冬氨酸、谷氨酸；碱性家族=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；及不带电的极性家族=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。可选择地家族包括脂肪族羟基家族=丝氨酸和苏氨酸；含酰胺家族=天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；及芳香性家族=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。举例来说，我们可以合理期待以异亮氨酸或缬氨酸独立取代亮氨酸、以谷氨酸独立取代天冬氨酸、以丝氨酸独立取代苏氨酸或以结构相关的氨基酸类似地取代氨基酸将不会对所形成的结合蛋白的结合或特性产生重大影响，特别是如果该取代并未牵涉在框架区内的氨基酸。然而，所有其他可能的氨基酸取代也被包含于本发明中。氨基酸改变是否产生减少ffiR-3信号传导的功能性的HER-3结合蛋白，可容易地通过ELISA或FACS测定所形成的结合蛋白的特定HER-3结合活性或者体外或体内的功能性测定来确定。在一些实施方案中，HER-3结合蛋白可与效应基团偶合。该结合蛋白特别适用于治疗应用。本发明所使用的术语“效应基团”是指细胞毒性基团诸如放射性同位素或放射性核素、毒素、治疗性基团或其他本领域已知的效应基团。适当效应基团的实例为放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、9°Y、99Tc、mIn、125I、mI)或非放射性同位素(例如2D)、刺孢霉素、多拉司他汀类似物诸如耳抑素和化学治疗剂诸如格尔德霉素和美登素衍生物包括DMl。因此在一些情况中，基团可为标示基团和效应基团。各种连接效应基团与多肽或糖多肽(诸如抗体)的方法是本领域本领域已知的，且可能被用于制备并进行本发明描述的组合物和方法。在一些实施方案中，通过不同长度的间隔臂连接效应基团与结合蛋白可有用地减少例如潜在的空间位阻。本发明也涉及制备分离的HER-3结合蛋白的方法，该方法包含自表达该蛋白的宿主细胞制备该蛋白的步骤。可被使用的宿主细胞包括但不限于杂交瘤、真核细胞(例如哺乳动物细胞如仓鼠、兔、大鼠、猪或小鼠细胞)、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如啤酒酿母菌(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞)、原核细胞(例如大肠杆菌(E. coli)细胞)及其他用于产生结合蛋白的细胞。多种自宿主细胞制备和分离结合蛋白(诸如支架蛋白或抗体)的方法是本领域已知的且可能被用于实施本文所描述的方法。另外，制备结合蛋白片段(例如支架蛋白片段或抗体片段)的方法，诸如木瓜酶或胃蛋白酶消化、现代克隆技术、制备单链抗体分子(Pluckthun，同上)和双价抗体(Hollinger等人，同上)的技术也为本领域的技术人员已知的且可被用于实施本文所描述的方法。在一些实施方案中，HER-3结合蛋白可自分泌该蛋白的杂交瘤制备。见例如Kohler 等人.(1975) Nature 256:495。
在一些实施方案中，HER-3结合蛋白可通过将该结合蛋白于宿主细胞中的表达优化和/或放大并自该宿主细胞分离该结合蛋白来重组制备。为达此目的，宿主细胞可由编码HER-3结合蛋白的DNA (例如载体)的转化或转染，并于产生该结合蛋白的适当条件下培养。见例如美国专利第4，816，567号。可用的宿主细胞包括例如CHO细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚胎肾293细胞、大肠杆菌细胞和啤酒酿母菌细胞。为抗体的HER-3结合蛋白可自经基因工程化以产生完全人源的抗体的动物制备，或自噬菌体、酵母、核糖体或大肠杆菌的抗体展示库制备。见例如Clackson等人.(1991)Nature 352 :624-628 ；Marks 等人 (1991)J.Mol. Biol. 222 :581-597 ;Feldhaus 和Siegel (2004)J. TmmunoI. Methods 290 :69-80 ；Groves 和 Osbourn(2005)Expert Opin.Bioi. Ther. 5 125-135 ；和 Jostock 和 Dubel (2005) Comb. Chem. High Throughput Screen
8:127-133。在一些实施方案中，本文所提供的抗体可为完全人源或人源化的抗体。人源抗体避免了与异种抗体，诸如具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体，有关的某些问题。异种源性蛋白的存在可导致患者产生抗该抗体的免疫反应，接着导致快速清除该抗体、经由该抗体的中和而丧失治疗效用和/或严重、甚至致命的过敏反应。为了避免使用小鼠或大鼠源性抗体，完全人源的抗体可经由将功能性人源抗体基因座引入啮齿动物或其他哺乳动物或动物以使该啮齿动物、其他哺乳动物或动物产生完全人源的抗体来产生。一种产生完全人源的抗体的方法是利用XEN0M0USE 品系的小鼠，该小鼠经工程化以包含人重链基因座和K轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构型片段。其他XEN0M0USE 品系小鼠包含人重链基因座和K轻链基因座的980kb和800kb大小的种系构型片段。还有其他XEN0M0USE 品系小鼠包含人重链基因座和K轻链基因座的980kb和800kb大小的种系构型片段以和740kb大小的种系构型的完全人源的\轻链基因座。见Mendez 等人.(1997) Nature Genetics 15 :146-156 和 Green 和 Jakobovits (1998) J. Exp.Med. 188 MSSigSoXENOMOUSE 品系可得自加州千橡市(Thousand Oaks, CA)安进(Amgen)公司。XENOMOUSE , 小鼠的产生被进一步讨论和描述于美国专利公开案2003/0217373(2002 年 11 月 20 日提交)、美国专利第 5，939，598,6, 075，181,6, 114，598、6，150，584,6, 162，963,6, 673，986,6, 833，268 和 7，435，871 号和日本专利第 3068180B2、3068506B2 和 3068507B2 号中。也见欧洲专利第 EP0463151 号、PCT
发明者托尔·海特曼, 丹尼尔·J·弗里曼, 罗伯特·拉丁斯基 申请人:U3制药有限公司, 安进公司