Her3结合多肽的制作方法
【专利说明】HER3结合多肽 发明领域
[0001] 本公开内容涉及与人类表皮生长因子受体3(本文中被称为HER3)结合的多肽，并 且涉及此类多肽在成像和治疗中的用途。
[0002] 背景
[0003]包括EGFR(ErbBl或HER1)、ErbB2 (HER2)、ErbB3 (ERBB3 或HER3)和ErbB4 (HER4) 的跨膜酪氨酸激酶受体中的表皮生长因子受体家族通过细胞内信号通路的复杂网络参与 调节关键细胞功能（例如细胞增殖、存活、分化和迀移）。由于J1ER3的无活性的酪氨酸激酶 结构域，J1ER3与该家族的其它受体不同，并因此通过配体引起的与其它酪氨酸激酶受体一 起形成的异源二聚体来传递信号（Guy等人，ProcNatlAcadSci91:8132-8136(1994); Sierke等人，BiochemJ322(Pt3):757-763(1997))。结果，该受体在肿瘤进展中的意义 长期以来是个谜。但是，最近，ffiR3作为其家族成员的变构的激酶激活剂已被感兴趣。特 别地由HER2和HER3形成的异二聚体被称为是下游细胞内信号转导的异常强烈的激活剂 (Jura等人，ProcNatlAcadSci106:21508-21613(2009);Citri等人，ExpCellRes 284:54-65(2003))。这种HER2-HER3信号转导对甚至被认为是在HER2驱动的乳腺癌中的 致瘤单位（HolbroT等人，ProNatlAcadSci100:8933-8938(2003))。另外，HER3 受体 的上调已显示在体外和体内在过表达HER2的乳腺癌中对酪氨酸激酶抑制剂的抵抗发挥重 要作用（Sergina等人，Nature445:437-441(2007) ;Kong等人，PLoSOne3:e2881 (2008); Garrett等人，ProcNatlAcadSci108:5021-5026(2011))。
[0004] 但是，在人类癌症中HER3的重要性并不局限于HER2驱动的乳腺癌。还显示HER3 是HER3过表达的前列腺癌异种移植物的体内致肿瘤性所需要的、通过自分泌信号转导回 路来维持卵巢癌的亚类的体内增殖，并且参与ER+乳腺癌细胞系的内分泌耐受，仅举几 个例子（Soler等人，IntJCancerl25:2565-2575(2009);ShengQ等人，CancerCell 17:412-412 (2010);Liu等人，IntJCancer120:1874-1882 (2007);Frogne等人&'east CancerResTreat114:263-275(2009))。总而言之，这些发现证明HER3信号通路作为在 人类癌症中的重要的治疗靶点的潜力。另外，HER3表达具有预后价值，因为高水平的受体表 达与过表达HER2的患者相比，与显著地较短的存活时间有关（Tanner等人，JClinOncol 24 (26): 4317-23 (2006)，Reschke等人，ClinCancerRes14 (16): 5188-97 (2008))。
[0005]最近被批准的针对EGFR和HER2受体的疗法的相对大的比例基于单克隆抗体。与ErbB家族的被很好地研宄的EGFR和HER2受体成员形成对比，抗HER3抗体的用途有相对较 少的报道。Ullrich和合作者已报道抗HER3单克隆抗体在乳腺癌的细胞模型中抑制HER3 介导的信号转导（vanderHorst等人，IntJCancer115(4):519_27(2005))。但是，尽管 已报道了几种利用全长单克隆抗体的成功的癌症治疗研宄，但是这类剂对于靶向实体肿瘤 (不是对于诊断也不是对于治疗剂装载目的）并不总是最佳的。治疗效果取决于药物遍及 肿瘤的有效分布，并且分子成像取决于在肿瘤吸收和周围正常组织之间的高的比例。由于 肿瘤渗透率（包括溢出）与分子的大小负相关，相对较大的抗体分子（例如IgG)固有地具 有差的组织分布和渗透能力。而且，对于分子成像，抗体的异常地长的体内半衰期导致相对 较高的血液信号以及从而相对较差的肿瘤-血液反差。
[0006] 最近，利用组合蛋白工程生成了源自来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白A的结构域B的，基于Z结构域的3-螺旋束支架的小的多的HER3特异的分 子（Kronqvist等人，ProteinEngDesSel24:385-396(2010) ;W02011/056124)。这些对 HER3具有亚纳摩尔级亲和力的Z变体被证实在体外通过阻断配体引起的HER3信号转导具 有对乳腺癌细胞系的抗增殖效应（G6strillg等人，PLoSOne7:e40023(2012))。这些生长 抑制效应被进一步证实是在Z变体分子和配体调蛋白（heregulin)之间的竞争性HER3结 合的结果。
[0007] 但是，由于该受体在肿瘤细胞中的相对低的表达，HER3受体的体内靶向可能是 有挑战的。已报道了每细胞1〇3至10 4个受体的典型表达水平（Aguilar等人，Oncogene 18:6050-6062(1999);Robinson等人，BrJCancer99:1415-1425 (2008))。除了高的肿瘤 吸收之外，在肿瘤中延长的保留时间对药物的有效的治疗效果是十分重要的。由于高的血 管通透性并快速地扩散至肿瘤，小的靶向剂诸如源自Z结构域的多肽具有在肿瘤中以高水 平积累的能力（Schmidt和Wittrup,MolCancerTher8:2861-2871(2009))。但是，低分 子量的未结合蛋白将会被快速地从肿瘤清除并且然后通过肾从循环清除。结果，小尺寸靶 向剂对癌细胞的高亲和力对于增加的肿瘤保留是十分重要的。而且，对于具有低表达（每 细胞1〇 4革巴蛋白或更少）的受体蛋白的有效靶向，最近的结果暗示小的多肽（例如源自Z 结构域的多肽）的亲和力应该尽可能地高，优选地具有以低皮摩尔级计或更小的结合常数 KD(Tolmachev等人（2012)，JNuclMed53(6):953-60)。
[0008] 因为HER3可与EGF家族的其它成员在相同的肿瘤细胞上被表达，靶向HER3和EGF 家族的另一个成员的双特异分子的制备最近已引起一些兴趣。此类双特异性分子可例如被 用作靶向载体用于在分子成像应用中增加靶向的特异性以及同时地靶向HER3和在肿瘤上 表达的另一种抗原。
[0009] 发明描述
[0010] 本公开内容的目的是提供一组新颖的HER3结合剂，其以高亲和力结合HER3。
[0011] 本公开内容的另一个目的是提供一组新颖的HER3结合剂，其例如可被用于靶向 HER3表达细胞、此类HER3表达细胞的分子成像和/或HER3相关状况的治疗。
[0012] 本公开内容的另一个目的是提供一组经限定的HER3结合剂，该组与以前在 W02011/056124中限定的HER3结合多肽的组不同。
[0013] 因此，根据本发明的一方面，提供了HER3结合多肽，包含HER3结合基序（BM)，该基 序由选自以下的氨基酸序列组成：
[0014] i)EKYX4AYX7EIffXnLPNLTX17X18QX20AAFIGX26LX28D
[0015] 其中，彼此独立地，
[0016] 父4选自六、￡、1、]\1、队〇、1?、3和1';
[0017] X7选自F和Y;
[0018] Xn选自 E和Q;
[0019] X17选自 K、N、R和 V;
[0020] X18选自 F、M、N、R、T、Y和W;
[0021] X2Q选自 A和K;
[0022] X26选自K和S;
[0023] X28选自E和Q;以及
[0024] ii)与在i)中限定的序列具有至少96%同一性的氨基酸序列。
[0025] 以上关于HER3结合多肽的序列的类的限定是基于几种新颖的多肽变体的序列的 分析，所述几种新颖的多肽变体选自基于以前显示展示J1ER3结合并在W02011/056124中公 开的序列而设计的文库。这些多肽转而是源自葡萄球菌蛋白A的结构域之一的母本支架的 随机变体。
[0026] 鉴定的HER3结合基序或"BM"对应于母本支架的靶结合区域，该区域构成在三螺 旋束蛋白结构域内的两个a螺旋。在母本支架中，两个BM螺旋的变化的氨基酸残基组成 用于与抗体的恒定的Fc部分相互作用的结合表面。通过结合表面残基的随机变异和随后 的变体的选择，结合表面的Fc相互作用能力最初地被与HER3相互作用的能力代替，如在 W02011/156124中所描述的。在导致本公开内容的研宄中，生成了新的序列，其出乎意料地 显示出例如与适合用于分子成像的亲和力参数相关的优越的性能。
[0027] 如技术人员将认识到的，诸如如本文限定的多肽的HER3结合能力的任何多肽的 功能取决于多肽的三级结构。因此对多肽的氨基酸序列进行较小的改变而不大程度地影响 其三级结构和功能是可能的。
[0028] 因此，在一个实施方案中，多肽包括序列i)的BM的修饰的变体，其使得产生的序 列与属于由序列i)限定的类的序列至少96%相同。在一些实施方案中，此类改变可在如本 文公开的HER3结合多肽的序列的所有位置进行。在其它实施方案中，此类改变可仅在也被 称为支架氨基酸残基处的非可变位置进行。在此类情况中，在可变位置即以"X"（例如以上 限定的BM的X4、X7、Xn、X17、X18、X2(l、\6和X28)表示的位置改变是不被允许的。例如，属于 多个氨基酸残基的某一功能分组（例如疏水性、亲水性、极性等）中的氨基酸残基可被取代 为来自相同功能组的另一个氨基酸残基是可能的。
[0029] 可如以下计算如遍及说明书所使用的术语"％同一性"。利用CLUSTALW算法 (Thompson等人，NucleicAcidsResearch，22:4673_4680(1994))将查询序列与革E序列比 对。在窗口中进行对应于最短的对齐序列的比较。在一些实例中最短的对齐序列可以是靶 序列。在其它实例中，查询序列可构成最短的对齐序列。在每一个位置的氨基酸残基均被 比较，并且在查询序列中具有靶序列中相同的对应的位置的百分比被报告为％同一性。
[0030] 在一个实施方案中，发明提供了如以上限定的HER3结合多肽，其中，在序列i)中， 彼此独立地，
[0031] 父4选自六、已、]\1、队〇、3和1';
[0032] X7选自F和Y;
[0033] Xn为Q;
[0034] X17选自K 和 R;
[0035] X18选自M、Y 和W;
[0036] X2(l为K;
[0037] 父26为K;
[0038] 父28为Q。
[0039] 在一个实施方案中，在序列1)中的乂4选自4、￡、11、队〇、3和1'。在更特定的实施 方案中，在序列i)中的X4选自N和Q。在更加特定的实施方案中，在序列i)中的X4SN。 在另一个实施方案中，在序列i)中的\为〇。
[0040] 在一个实施方案中，在序列i)中的XnSQ。
[0041] 在一个实施方案中，在序列i)中的X17选自K、N和R。在另一个实施方案中，在序 列i)中的X17选自K和R。在更特定的实施方案中，在序列i)中的X17SK。在另一个实施 方案中，在序列i)中的X17SR。
[0042] 在一个实施方案中，在序列i)中的X18选自M、Y和W。在更特定的实施方案中，在 序列i)中的X18选自Y和W。在更加特定的实施方案中，在序列i)中的X18SY。在另一个 实施方案中，在序列i)中的X18SW。在另一个实施方案中，在序列i)中的x18Sm。
[0043] 在一个实施方案中，在序列i)中的X17X18选自KW、KY、KM和RY。
[0044] 在一个实施方案中，在序列i)中的X2(l为K。
[0045] 在一个实施方案中，在序列i)中的&6为1(。
[0046] 在一个实施方案中，在序列i)中的\8为〇。
[0047] 在一个实施方案中，序列i)符合以下四个条件I、II、III和IV中的至少两个：
[0048] I)XnSQ;
[0049] II)X17X18选自KW、KY、KM和RY;
[0050] III)X2Q为K;
[0051] iv)x28Sq。
[0052] 在更特定的实施方案中，序列i)符合条件I、II、III和IV中的至少三个，诸如所 有四个。
[0053] 如在随后的实验部分详细描述的，HER3结合变体的选