本发明属于酶处理
技术领域：
，具体涉及一种增强中性蛋白酶稳定性的方法。
背景技术：
：中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，中性蛋白酶在焙烤行业、大豆分离蛋白、酵母抽提物、啤酒、纺织工业、皮革工业、饲料工业、医药等均有广泛应用。国内现有的中性蛋白酶主要是粉末制剂，但是粉末制剂菌落不好控制，并且使用时需要溶解，还会有残渣，对于一些卫生级别较高的，很难达到卫生标准。由于中性蛋白酶是一种活性物质，又是一种蛋白酶，自身就可以分解自身，酶活力下降很快。室温条件下一周酶活力会损失50％。因此，需要针对上述的中性蛋白酶不稳定性的特点，设计一种能增强保存中的中性蛋白酶稳定性的方法。技术实现要素：为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种能增强中性蛋白酶稳定性的方法。本发明提供的一种保存液体中性蛋白酶的稳定剂，可以在液体条件下较长时间保存中性蛋白酶的酶活力。本实验的技术方案是：本实验保存液体中性蛋白酶的稳定剂由氯化钙、山梨酸钾、山梨糖醇混配搅拌制成。选用山梨糖醇可以使中性蛋白酶分子在水溶液中保持其稳定性，不易变性失去活性；选用山梨酸钾控制菌落数，便于满足食品条件的要求；选用氯化钙可以激活中性蛋白酶活性，提高酶活力。此稳定剂可以使液体中性蛋白酶≤25℃的条件下储存4个月保持中性蛋白酶活力90％，形成稳定的产品工艺配方，便于在食品、皮革、纺织等方面的应用。增强保存中的中性蛋白酶稳定性的方法，该方法是在中性蛋白酶中加入稳定剂。上述的稳定剂包括防腐剂、吸水剂、糖类中的至少一种。上述的中性蛋白酶为液体中性蛋白酶。上述的防腐剂为山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸钠、丙酸钙、对羟基苯甲酸乙酯中的任一种；上述的吸水剂为无水氯化钙；上述的糖类为葡萄糖、麦芽糖、果糖、葡聚糖、木糖醇、赤藓醇、低聚果糖、异构乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇中的任一种。优选的，上述的稳定剂包括吸水剂和糖类，所述的吸水剂为无水氯化钙，无水氯化钙的加入量为中性蛋白酶质量的0.07-0.13％；所述的糖类为山梨糖醇，所述的山梨糖醇的添加量为液体中性蛋白酶质量的40-80％。更优选的，上述的稳定剂包括无水氯化钙、山梨糖醇、山梨酸钾和葡萄糖，无水氯化钙的加入量为中性蛋白酶质量的0.07-0.13％；山梨糖醇的添加量为液体中性蛋白酶质量的40-80％；山梨酸钾的重量为中性蛋白酶质量的0.12-0.3％，所述葡萄糖的重量为中性蛋白酶质量的0.05-0.2％。更优选的，上述的稳定剂包括吸水剂和糖类；吸水剂为无水氯化钙，无水氯化钙的加入量为中性蛋白酶质量的0.07-0.13％；糖类为山梨糖醇、蔗糖和海藻糖，所述的山梨糖醇的添加量为液体中性蛋白酶质量的40-80％；蔗糖添加量为为液体中性蛋白酶质量的10％-25％，海藻糖添加量为为液体中性蛋白酶质量的2％-5％。上述的稳定剂包括无水氯化钙、山梨糖醇、山梨酸钾、葡萄糖、蔗糖和海藻糖；无水氯化钙的加入量为中性蛋白酶质量的0.07-0.13％；山梨糖醇的添加量为液体中性蛋白酶质量的40-80％；山梨酸钾的重量为中性蛋白酶质量的0.12-0.3％；葡萄糖的重量为中性蛋白酶质量的0.05-0.2％；蔗糖添加量为为液体中性蛋白酶质量的10％-25％；海藻糖添加量为为液体中性蛋白酶质量的2％-5％。8.如权利要求1所述的增强保存中的中性蛋白酶稳定性的方法，包括下述的步骤：取中性蛋白酶浓缩液，边搅拌边加入无水氯化钙和山梨酸钾，所述的无水氯化钙的加入量为中性蛋白酶质量的0.07-0.13％，山梨酸钾的重量为中性蛋白酶质量的0.12-0.3％，搅拌至溶解后加入山梨糖醇，所述的山梨糖醇的添加量为液体中性蛋白酶质量的40-80％，继续搅拌至物料充分混匀。将充分混匀后的中性蛋白酶混合物料中加入pH调节剂，调节pH至5.00-6.00；所述的pH调节剂为冰乙酸、柠檬酸中的任一种；将经过pH调节后的中性蛋白酶混合物料置于0-25℃下存放。本发明的有益效果在于，采用本发明的方法能显著的增强中性蛋白酶的稳定性，本发明的方法是在中性蛋白酶中加入稳定剂无水氯化钙、山梨酸钾、山梨糖醇，以增强其稳定性，进一步的，调节上述的加入了稳定剂的中性蛋白酶的pH，然后将上述的中性蛋白酶混合物料置于25℃以下的环境中保存，中性蛋白酶的酶活残留率为90％以上。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。实施例1取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加2g无水氯化钙，加山梨酸钾4g，搅拌至溶解后加入山梨糖醇1000g，继续搅拌10min。用冰乙酸按照下表调pH,检测酶活力。再将各组样分为三组，一组室温放置(温度15-30℃，以下涉及室温均同)，一组25℃静置，另一组37℃水浴恒温振荡。酶活力检测方法参照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的测定福林法，以下测酶活如无特殊说明，均采用此方法。液体中性蛋白酶各组pH及酶活(16.2.27)名称乙酸调pH酶活力06.454022116.442719626.012685335.512719645.0626902三种不同条件下放置4酶活及pH检测结果2016.2-2016.4室温约为15-20℃；2016.5-2016.6室温约为20-30℃。整个实验过程中各实验组外观均澄清透亮，无异味。由表2数据可以看储存出温度对液体中性蛋白酶影响较大。储存温度越高，酶活下降越快。25℃下放置4个月，酶活损失约10％。且pH为5.00-5.50时在各储存条件下酶活残留相对较高。结合液体中性蛋白酶本身的特殊性，储存温度应小于25℃。本发明的液体中性蛋白酶，各原料的重量占液体中性蛋白酶质量的百分比为：山梨糖醇50％，山梨酸钾0.2％，无水氯化钙0.1％，用冰乙酸-乙酸钠调酶液pH控制在5.00-6.00，储存温度≤25℃，酶活残留率为90％以上。对比例1取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加2g无水氯化钙，加山梨酸钾4g，继续搅拌10min。用冰乙酸按照下表调pH,在25℃的条件下静置，检测酶活力。名称乙酸调pH酶活力16.454022126.014036335.514055545.024067925℃条件下静置一段时间后测得其酶活结果如下：由上述表格可以看出未添加山梨糖醇各组酶活均快速下降，25℃放置一个月酶活下降约40％。对比例2取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加山梨酸钾4g，搅拌至溶解后加入山梨糖醇1000g，继续搅拌10min。名称乙酸调pH酶活力16.442599626.012555335.512549645.062590225℃的条件下储存，检测结果如下表：对比例3取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加2g无水氯化钙，搅拌至溶解后加入山梨糖醇1000g，继续搅拌10min。检测结果如下表：25℃的条件下放置1个月，各组外观均变混浊，有异味，镜检结果有杂菌。实施例2验证实验山梨糖醇添加量对液体中性蛋白酶储存稳定性的影响将液体中性蛋白酶添加0.2％的山梨酸钾，用冰乙酸-乙酸钠调pH为5.00，将酶液按照下表添加山梨糖醇，分别搅拌均匀，置于室温条件下，跟踪检测酶活变化,酶活力单位u/g。试验分组编号液体中性蛋白酶,g山梨糖醇，g11000210040310060410080两周后检测各组酶活力及pH，检测结果如下表：不同山梨糖醇添加量中性蛋白酶酶活及pH变化由上述表格可以看出山梨糖醇添加量对液体中性蛋白酶酶活力影响较大。室温放置1个月，1#酶活损失约50％，添加山梨糖醇的其他组酶活变化不明显；室温继续放置三个月，1#酶活残留仅17％，其他组山梨糖醇添加量越高，酶活残留越高，山梨糖醇添加量高于40％时酶活残留率高于90％，添加量为80％时酶活残留率达到100％。实施例3取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加1.4g无水氯化钙，加山梨酸钾2.4g，搅拌至溶解后加入山梨糖醇800g，继续搅拌10min。用冰乙酸调pH为5.12,检测酶活力。再将各组样分为三组，一组室温放置(15℃-30℃)，一组25℃静置，另一组15℃冷藏。酶活力检测方法参照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的测定福林法，以下测酶活如无特殊说明，均采用此方法。三种不同条件下放置酶活及pH检测结果由表格可以看出，按液体中性蛋白酶质量比添加0.07％的无水氯化钙、0.2％的山梨酸钾及50％的山梨糖醇在25℃的条件下放置120d，酶活残留约为94％。实施例4取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加2.6g无水氯化钙，加山梨酸钾6g，搅拌至溶解后加入山梨糖醇1600g，继续搅拌10min。用冰乙酸调pH为5.15,检测酶活力。再将各组样分为三组，一组室温放置(15℃-30℃)，一组25℃静置，另一组15℃恒温冷藏。酶活力检测方法参照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的测定福林法，以下测酶活如无特殊说明，均采用此方法。液体中性蛋白酶各组pH及酶活三种不同条件下放置酶活及pH检测结果实施例5取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加2g无水氯化钙，加山梨酸钾4g，搅拌至溶解后加入蔗糖300g，加入海藻糖60g，继续搅拌10min。用冰乙酸调pH为5.11,检测酶活力。再将各组样分为三组，一组室温放置(15℃-30℃)，一组25℃静置，另一组15℃恒温冷藏。酶活力检测方法参照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的测定福林法，以下测酶活如无特殊说明，均采用此方法。三种不同条件下放置酶活及pH检测结果实施例6取中性蛋白酶浓缩液2000g(检测pH为6.45)，边搅拌边加2g无水氯化钙，加山梨酸钾4g，搅拌至溶解后加入蔗糖300g，加入海藻糖60g、山梨糖醇900g，葡萄糖100g，继续搅拌10min。用冰乙酸调pH为5.11,检测酶活力。再将各组样分为三组，一组室温放置(15℃-30℃)，一组25℃静置，另一组15℃恒温冷藏。酶活力检测方法参照《GB/T23527-2009》中蛋白酶活力的测定福林法，以下测酶活如无特殊说明，均采用此方法。三种不同条件下放置酶活及pH检测结果当前第1页1 2 3