用于制药废水处理的交联β-内酰胺酶聚集体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于制药废水处理的交联β?内酰胺酶聚集体的制备方法，将重组β?内酰胺酶基因序列转入宿主细胞大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌，再通过诱导表达、超声破碎、离心处理、取上清得到粗酶液；加入牛血清蛋白作为聚集剂及保护剂到粗酶液中，进行沉淀并聚集，形成酶聚集体，将得到酶聚集体用双功能试剂进行交联，从而制备得到交联β?内酰胺酶聚集体。本发明制备得到的交联β?内酰胺酶聚集体，经测试酶活高，稳定性好，可重复利用，用于抗生素废水治理，其化学需氧量降低了72.9％，该交联β?内酰胺酶聚集体在制药工业处理抗生素废水中显示出重要的应用价值。
【专利说明】
用于制药废水处理的交联e-内醜胺酶聚集体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于酶工程技术领域，更为具体地讲，设及一种用于制药废水处理的交联 0-内酷胺酶聚集体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国制药工业得到了迅猛发展，然而在制药过程中排放的大量有毒有害 废水则严重危害着人们的身体健康。因制药工业废水成分复杂、有机物含量高、毒性大、颜 色深、含盐量高、可生化性差，对微生物生长有极强的抑制作用，难W自然降解。同时，制药 工业废水的化学需氧量(Chemical 0巧gen Demand,COD)可高达6000mg/LW上，因此，治理 制药工业废水，保障人们的身体健康已成为全球性课题。
[0003] 目前，国家和地方政府非常重视废水处理工程。根据国内外废水处理现已采用的 工艺及运行情况，当前的制药共工业废水处理技术主要分为：物理处理技术、化学处理技 术、生物处理技术。生物处理技术因其处理成本低、经济效益好和无二次污染等优点，受到 了许多制药企业的青睐。生物处理技术是利用废水中的有机物作为惟一的碳源或能源，从 废水中选育菌种，对废水中的物质进行降解的一种方法。该方法尤其对小分子有机物有良 好的降解效果。
[0004] β-内酷胺酶是针对内酷胺类抗生素分泌的一类酶，能催化水解6-氨基青霉烧酸 (6-ΑΡΑ)和7-氨基头抱烧酸（7-ACA)及其Ν-酷基衍生物分子中β-内酷胺环酷胺键，使β-内 酷胺环裂解而被破坏，失去抗菌活性。
[0005] 交联酶聚集体(CLEAs)固定化方法，是2000年由荷兰Delft大学化eldon小组在交 联酶晶体(CLECs)的基础上提出的一种新型的固定化技术。它首先W有机溶剂、非离子型聚 合物或盐等作为沉淀剂使酶蛋白沉淀并聚集，形成酶聚集体;再进一步将酶聚集体用双功 能试剂进行交联，从而制备得到交联酶聚集体。其中交联酶聚集体中酶的活性位点并不遭 到破坏，蛋白质形成了超分子结构，抗生素通过聚集体的中间缝隙与酶的活性位点作用，从 而酶的活性位点避免了与外界的微环境直接作用，更好地降解抗生素。另外聚集体的形成 使得整个团体形成了一个疏水基团，运样微环境中的pH值、溫度、有机溶剂等对蛋白质的构 型影响显著降低，从而提高了酶的耐受性，较游离酶溶液稳定性显著提高。相较于传统固定 化方法，CLEAs技术具有对酶纯度要求低，获得的固定化酶稳定性好、活性高、无需载体，成 本低廉，易于推广等优点。
[0006] 尽管CLEAs技术优势明显，但它通用性不强，通常对一种酶优化的制备条件可能对 另一种酶甚至是不同酶源的同一种酶均不适用，所W研究新酶的固定化体系还要不断摸 索。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于制药废水处理的交联β-内 酷胺酶聚集体的制备方法，W获得活性高，稳定性好的交联β-内酷胺酶聚集体，用于降解制 药工业废水中的内酷胺类抗生素，达到降低制药废水化学需氧量的目的。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明用于制药废水处理的交联β-内酷胺酶聚集体的制备 方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0009] (1)、将重组β-内酷胺酶基因转入宿主细胞大肠杆菌E.coli ToplO中，得到重组 菌，进行原核体外重组表达；
[0010] (2)、将重组菌进行诱导表达，得到诱导菌，对诱导菌进行离屯、处理，得到菌体，然 后加入缓冲液，并进行超声破碎，离屯、处理，取上清，得到粗酶液；
[0011] (3)、取25111旨/血粗酶液11^加入1/^3粗酶液质量的854(牛血清蛋白），作为聚集剂及 保护剂，放入25mL烧杯中冰浴条件下在磁力揽拌器上揽拌20分钟；5mL 75%的硫酸锭溶液 作为沉淀剂，冰浴条件下，逐滴加入饱和硫酸锭(沉淀剂），揽拌1小时;常溫(25°C)条件下， 浓度0.5%的戊二醒作为交联的双功能试剂，逐滴加入戊二醒(双功能试剂），交联2小时;所 得悬液4°C条件下，400化pm离屯、15分钟，得沉淀即为固化后的酶；
[0012] 固定化后的酶再悬浮于20ml的50mM憐酸盐缓冲液(PH7.0)中，冰浴条件下揽拌30 分钟，运样反复重复Ξ次，所得悬液4 °C条件下，40(K)rpm离屯、15分钟，得沉淀即为所得的交 联0-内酷胺酶聚集体。
[0013] 作为进一步的优选，沉淀溫度为(TC，交联溫度为常溫(25°C)。
[0014] 作为进一步的优选，交联β-内酷胺酶聚集体应用于制药工业废水处理时，pH值为 7.5。
[0015] 作为进一步的优选，交联β-内酷胺酶聚集体应用于制药工业废水处理时，溫度为 3(TC~5(rC。
[0016] 作为进一步的优选，所述制药工业废水优选抗生素废水。
[0017] 本发明的目的是运样实现的。
[0018] 本发明用于制药废水处理的交联β-内酷胺酶聚集体的制备方法，将重组β-内酷胺 酶基因序列转入宿主细胞大肠杆菌E.coli ToplO中，得到重组菌，再通过诱导表达、超声破 碎、离屯、处理、取上清得到粗酶液;加入牛血清蛋白作为聚集剂及保护剂到粗酶液中，进行 沉淀并聚集，形成酶聚集体，将得到酶聚集体用双功能试剂进行交联，从而制备得到交联β- 内酷胺酶聚集体。本发明制备得到的交联0-内酷胺酶聚集体，经测试酶活高，稳定性好，可 重复利用，用于抗生素废水治理，其化学需氧量降低了72.9%，该交联β-内酷胺酶聚集体在 制药工业处理抗生素废水中显示出重要的应用价值。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明中β-内酷胺酶基因改造示意图；
[0020] 图2是本发明中重组β-内酷胺酶基因重组表达示意图；
[0021 ]图3是本发明一种【具体实施方式】下获取粗酶液的表达图；
[0022] 图4是本发明一种【具体实施方式】提供的硫酸锭溶液浓度(a)和含量(b)对所述交联 β-内酷胺酶聚集体酶活性影响图；
[0023] 图5是本发明一种【具体实施方式】提供的牛血清蛋白（BSA)对所述交联β-内酷胺酶 聚集体酶活性影响图；
[0024] 图6是本发明一种【具体实施方式】提供的戊二醒终浓度对所述交联β-内酷胺酶聚集 体酶活性影响图；
[0025] 图7是本发明一种【具体实施方式】提供的不同抑值对所述交联β-内酷胺酶聚集体酶 活性影响图；
[0026] 图8是本发明一种【具体实施方式】提供的不同溫度对所述交联β-内酷胺酶聚集体酶 活性影响图；
[0027] 图9是本发明一种【具体实施方式】提供的所述交联β-内酷胺酶聚集体对抗生素废水 化学需氧量的影响图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】进行描述，W便本领域的技术人员更好地 理解本发明。需要特别提醒注意的是，在W下的描述中，当已知功能和设计的详细描述也许 会淡化本发明的主要内容时，运些描述在运里将被忽略。
[00巧]一、实施例
[0030] 1、重组β-内酷胺酶基因的获得
[0031] 本发明W对头抱嚷朽具有耐药性的GenBank:AF143804.1上的β-内酷胺酶基因为 基础，在其编码区（核巧酸序列）的5'端和3'端分别设计限制性内切酶Ncol即序列5'- ccatgg-3 '和EcoRI即5 ' -gaattc-3 '，在3 '端终止密码子taa前插入6个His标签即组氨酸 catcaccatcaccatcac，得到改造的β-内酷胺酶基因序列，改造重组的过程如图1所示。
[0032] 核巧酸序列GenBank:AF143804.1是来自于美国国家生物技术信息中屯、(化tional Center for Biotechnology Information,NCBI)基因序列数据库中的一种β-内酷胺酶基 因序列。
[0033] 在本实施例中，南京金斯瑞生物有限公司依据改造的β-内酷胺酶基因序列进行合 成，其基因序列见序列表中的序列1。合成的β-内酷胺酶基因克隆到pBAD-TLX表达载体中， 得到重组β-内酷胺酶基因，具体如图2所示。
[0034] 在本发明中，之所W在β-内酷胺酶基因序列的5'端替换上限制性内切酶Ncol和3' 端插入限制性内切酶EcoRI，是因为Ncol和EcoRI产生的黏性末端可与表达（克隆）载体 pBAD-TLX上的限制性内切酶Nco巧此coRI产生的黏性末端进行特异性结合，从而将β-内酷 胺酶基因片段与表达(克隆)载体连接。
[0035] 2、重组β-内酷胺酶的诱导表达
[0036] 在本实施例中，将重组β-内酷胺酶基因转入宿主细胞大肠杆菌Ε. coli ToplO中， 得到重组菌，随后进行原核体外诱导表达。诱导表达条件为：将重组菌单克隆接种到20mL LB化uria-Bertani)培养基中，Amp(氨节青霉素)浓度为lOOyg/mL，放于37°C、转速为180巧m 的摇床中过夜培养。将培养好的菌液按2%的接种量接种到200mL含有Amp的LB培养基中，放 于37°C、转速为18化pm的摇床中培养至OD600为0.7左右，然后在16°C培养箱中静置1.5小时 后，加入0.05mg/mL阿拉伯糖作为诱导剂，诱导溫度调为16°C，摇床转速换为10化pm，诱导细 菌至0〇6日日为2.5左右结束，得到诱导菌。
[0037] 3、获取粗酶液
[003引在本实施例中，诱导菌离屯、得菌体，加入200mM化is-S化缓冲液超声破碎，待破碎 液成透明状，4°C离屯、机，12000g离屯、1小时，得上清和沉淀，取上清，得到粗酶液。在本实施 例中，将上清和沉淀加入2 X SDS上样缓冲液，混匀，加入到SDS-PAGE聚丙締酷胺凝胶电泳中 检测目的蛋白。从图3中可看出目的蛋白在38W)a左右，成功获得了可溶性目的蛋白即粗酶 液
[0039] 4、交联β-内酷胺酶聚集体的制备
[0040] 在本实施例中，用考马氏亮蓝法测上清蛋白浓度，根据浓度换算，取ImL粗酶液粗 酶液加入粗酶液质量的BSA(牛血清蛋白），作为聚集剂及保护剂，放入25mL烧杯中冰浴 条件下在磁力揽拌器上揽拌20分钟。冰浴条件下，逐滴加入饱和硫酸锭(沉淀剂），揽拌1小 时；常溫(25°C)条件下，逐滴加入戊二醒(双功能试剂），交联2小时；所得悬液4°C条件下， 400化pm离屯、15分钟，得沉淀即为固化后的酶。固定化后的酶再悬浮于20ml的50mM憐酸盐缓 冲液(pH7.0)中，冰浴条件下揽拌30分钟，运样反复重复Ξ次，所得悬液4°C条件下，400化pm 离屯、15分钟，得沉淀即为所得的交联β-内酷胺酶聚集体。
[004。二、测试
[0042] 1、饱和硫酸锭浓度对交联β-内酷胺酶聚集体酶活性影响
[0043] 分别配制30% ,45% ,60% ,75%和85%的饱和硫酸锭溶液，对粗酶液进行固定化， 测量交联β-内酷胺酶聚集体相对酶活，结果如图4(a)所示。从图4(a)可W看出，当饱和硫酸 锭溶液浓度为75%时，本发明制备的交联β-内酷胺酶聚集体相对酶活性可达57.1 %。
[0044] 2、饱和硫酸锭用量对交联β-内酷胺酶聚集体酶活性的影响
[0045] 加入不同量饱和硫酸锭对粗酶液进行固定化，测量交联β-内酷胺酶聚集体相对酶 活性，结果如图4(b)所示。从图4(b)可W看出，当加入75%的饱和硫酸锭溶液为5mL时，本发 明制备的交联0-内酷胺酶聚集体相对酶活性可达64%。
[0046] 3、牛血清蛋白（BSA)对交联β-内酷胺酶聚集体酶活性的影响
[0047] 加入不同质量的牛血清蛋白充当聚集剂及保护剂进行固定化时，测量交联β-内酷 胺酶聚集体相对酶活性，结果如图5所示。从图5可W看出，当加入的牛血清蛋白与粗酶液质 量比为1:3时，本发明制备的交联β-内酷胺酶聚集体相对酶活性93.1 %，说明牛血清蛋白有 利于保留联β-内酷胺酶聚集体酶活性。
[004引4、戊二醒终浓度对交联β-内酷胺酶聚集体酶活性的影响
[0049] 加入不同终浓度的戊二醒溶液作为双功能试剂进行固定化时，测量交联β-内酷胺 酶聚集体相对酶活性，结果如图6所示。从图6可W看出，当戊二醒终浓度为0.5%时，本发明 制备的交联β-内酷胺酶聚集体相对酶活性为94.5%。
[0050] 5、ρΗ对交联β-内酷胺酶聚集体酶活稳定性的影响
[0051] 将交联β-内酷胺酶聚集体放于不同pH的憐酸盐缓冲液中，检测其酶活稳定性，结 果如图7所示。从图7中可W看出，本发明制备的交联β-内酷胺酶聚集体在过酸或过碱的环 境下相对酶活性较低，但还是比粗酶液稳定性高。在Ρ册.5-抑8.5之间，交联β-内酷胺酶聚 集体相对酶活性较高。说明本发明制备出的交联β-内酷胺酶聚集体具有较高的pH值稳定 性。
[0052] 6、溫度对交联β-内酷胺酶聚集体酶活稳定性的影响
[0053] 将交联β-内酷胺酶聚集体放于不同溫度的烧杯中，检测其酶活稳定性，结果如图8 所示。从图8可W看出，本发明制备的交联β-内酷胺酶聚集体有很高的耐热性，当在70°C溫 度中放6小时，其仍能保持70%的酶活，而在30°C~50°C为最佳;而粗酶液在60°C环境中半 个小时就失去了 60 %酶活。
[0054] 7、交联β-内酷胺酶聚集体对废水COD值的影响
[0055] 将滤纸放于锥形漏斗，将所述抗生素废水过滤，去除悬浮物及颗粒物质，得滤液； 将滤液高速离屯、，用化学需氧量快速测定仪检测本发明制备的交联β-内酷胺酶聚集体对废 水处理前滤液的化学需氧量;将所述的交联β-内酷胺酶聚集体放入滤液中，放于30°C摇床 中，转速ISOrpm培养35小时，取处理后废水离屯、，巧憶处理后废水的化学需氧量。结果如图9 所示。从图9可W看出，本发明制备的交联β-内酷胺酶聚集体对废水COD去除率可达72.9%， 运说明本发明制备的交联0-内酷胺酶聚集体对抗生素废水具有良好的降化学需氧量的效 果。从图7还可W看出，pBAD细菌对废水COD去除率也可达12%，所述pBAD细菌表示体内导入 了pBAD-化X载体的E. coli Top 10宿主菌，对照组即没有任何细菌处理的废水。粗酶液加入 到废水中不到半小时酶活就丧失，故并没有粗酶液处理结果。
[0056] 尽管上面对本发明说明性的【具体实施方式】进行了描述，W便于本技术领域的技术 人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于【具体实施方式】的范围，对本技术领域的普通技 术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，运些 变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
【主权项】
1. 一种用于制药废水处理的交联β-内酰胺酶聚集体的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 、将重组β-内酰胺酶基因转入宿主细胞大肠杆菌E.coli ToplO中，得到重组菌，进 行原核体外重组表达； (2) 、将重组菌进行诱导表达，得到诱导菌，对诱导菌进行离心处理，得到菌体，然后加 入缓冲液，并进行超声破碎，离心处理，取上清，得到粗酶液； (3) 、取25mg/mL粗酶液lmL加入1/3粗酶液质量的BSA(牛血清蛋白），作为聚集剂及保护 剂，放入25mL烧杯中冰浴条件下在磁力搅拌器上搅拌20分钟；5mL 75 %的硫酸铵溶液作为 沉淀剂，冰浴条件下，逐滴加入饱和硫酸铵(沉淀剂），搅拌1小时;常温(25°C)条件下，浓度 0.5 %的戊二醛作为交联的双功能试剂，逐滴加入戊二醛(双功能试剂），交联2小时;所得悬 液4 °C条件下，4000rpm离心15分钟，得沉淀即为固化后的酶； 固定化后的酶再悬浮于20ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，冰浴条件下搅拌30分钟， 这样反复重复三次，所得悬液4°C条件下，4000rpm离心15分钟，得沉淀即为所得的交联β-内 酰胺酶聚集体。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的重组β_内酰胺酶基因采用以下 步骤获取： 以对头孢噻肟具有耐药性的GenBank:AF143804.1上的β-内酰胺酶基因为基础，在其编 码区（核苷酸序列）的5'端和3'端分别设计限制性内切酶Ncol即序列5'-ccatgg-3'和EcoRI 艮P5'-gaattc-3'，在3'端终止密码子taa前插入6个His标签即组氨酸catcaccatcaccatcac， 得到改造的内酰胺酶基因序列； 依据改造的内酰胺酶基因序列进行合成，合成得到的内酰胺酶基因克隆到PBAD-TLX表达载体中，得到重组β-内酰胺酶基因。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导表达为： 将重组菌单克隆接种到20mL LB(Luria-Bertani)培养基中，Amp(氨节青霉素)浓度为 100yg/mL，放于37°C、转速为180rpm的摇床中过夜培养。将培养好的菌液按2%的接种量接 种到200mL含有Amp的LB培养基中，放于37°C、转速为180rpm的摇床中培养至OD600为0.7左 右，然后在16°C培养箱中静置1.5小时后，加入0.05mg/mL阿拉伯糖作为诱导剂，诱导温度调 为16°(：，摇床转速换为100印111，诱导细菌至00 6()()为2.5左右结束，得到诱导菌。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的沉淀温度为0°C，交联温度为常 温(25。〇。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联β_内酰胺酶聚集体应用于 制药工业废水处理时，pH值为7.5。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联β_内酰胺酶聚集体应用于 制药工业废水处理时，温度为30°C~50°C。
【文档编号】C02F103/34GK106011119SQ201610343627
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】冯娟, 吴雪琴, 汤丽霞, 邓文凤, 廖茜, 仝亚沛
【申请人】电子科技大学