专利名称：在油包水乳液中制备的交联酶聚集体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及在油包水乳液中制备的交联酶聚集体及其制备方法。
背景技术：
固定化酶与游离酶相比稳定性高、易从反应系统中分离、能重复使用、利于实现自动化生产，获得性能优异的固定化酶对实现工业环境下酶的高效利用，促进生物催化产业的快速发展具有重要意义。酶的固定化方法根据是否需要载体可分为载体固定化法和无载体固定化法。载体固定化法由于惰性载体的引入，“稀释”了酶的活性(在整个固定化酶重量中，载体一般占 90%以上)，并且载体通常会影响底物和产物的扩散，所得固定化酶的单位酶活低。其次，有些载体比酶更昂贵，如Eupergit系列、碳纳米管等，制备费用高。还有，一些载体稳定性差或具有毒性，易污染产品。因此，尽管研究人员在载体固定化方法的改进及新型载体的开发上作了许多工作，但真正投入工业化应用的尚不多。近年来，出现了一种无载体固定化酶的方法一交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates)技术，该法最先由荷兰Delft理工大学的Sheldon小组提出，其原理为向酶液中添加盐、有机溶剂、非离子聚合物等沉淀剂，可以使酶蛋白通过非共价键形成超分子结构-不溶性的物理聚集体，然后再利用交联剂对聚集体进行共价捆绑，就得到交联酶聚集体，其结构和活性在反应体系中不易被破坏，可被回收重复使用。利用交联酶聚集体技术可以提高酶对有机溶剂的耐受性，调控酶的功能，并且可同时对多种酶联合固定化。与载体固定化法相比，交联酶聚集体技术所得固定化酶单位酶活高，例如商品化的 Eupergit C固定化青霉素酰化酶活力为100U/g，而青霉素酰化酶的交联酶聚集体的酶活高达9875 12440U/g〔Cao L. van Langen L Μ,van Rantwijk F,Sheldon R A. Cross-linked aggregates of penicillin acylase.robust catalysts for the synthesis of β -lactam antibiotics. Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic,2001,11(4-6) 665-670〕，这样应用时使用较小的反应器即可，投资和操作费用低。此外，与另一种无载体固定化法-交联酶晶体(CLEC)法相比，交联酶聚集体技术对酶的纯度要求不高，不需要结晶等复杂步骤，制备简便。但是SieIdon小组建立的方法是在溶液中构建交联酶聚集体，所得交联酶聚集体成团成簇，不易分散，呈无定形的集簇状，尺寸较大，存在明显的传质问题，影响交联酶聚集体充分发挥活性。
发明内容
为解决上述技术中存在的不足，本发明的目的是提供在油包水乳液中制备的交联酶聚集体及其制备方法，该交联酶聚集体具有较规则的形状，近似球形，单位酶活高。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种在油包水乳液中制备交联酶聚集体的方法，该方法包括以下步骤步骤1 配制酶溶液；步骤2 于酶溶液中加入可以使酶聚集沉淀的沉淀剂，制备含有酶的分散相；步骤3 将步骤2中含有酶的分散相分散于疏水性液体中，形成油包水乳液；步骤4 用交联剂交联油包水乳液中的酶聚集体；步骤5 回收形成的交联酶聚集体。其中所述的酶可以是任何酶或不同酶的组合物，例如蛋白酶、脂酶、青霉素酰化酶、脲酶、果胶酶、乳糖酶、海藻糖合酶、葡萄糖异构酶、半乳糖苷酶、β -淀粉酶、普鲁兰酶、 葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、漆酶、植酸酶、有机磷水解酶、氨基甲酸酯水解酶、拟除虫菊酯水解酶和它们的组合物。所述的沉淀剂是指可以使酶通过非共价键形成聚集体而沉淀的物质，例如硫酸铵、硫酸钠等盐类，丙酮、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乳酸乙酯等有机溶剂，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖等非离子型聚合物。所述的疏水性液体包括矿物油、植物油等油类，己烷、庚烷等碳氢化合物，二辛醚、 二苯醚等醚类化合物以及三酸甘油酯、棕榈酸异丙酯等酯类化合物。所述的交联剂是能与所选的酶交联的双功能或多功能基团试剂，可以选自醛类， 例如戊二醛、乙二醛、丁二醛、葡聚糖聚醛(dextran aldehyde)，异氰酸酯，例如六亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯，环氧化物，有机卤化物，酸酐，偶氮化合物等。为了形成稳定的油包水乳液，在步骤1所述的酶溶液中，或步骤2所述的含有酶的分散相中，或步骤3所述的疏水性液体中加入乳化剂。所述的乳化剂为油包水型乳化剂，可以是一种乳化剂，例如Span系列、失水山梨醇倍半油酸酯、单硬脂酸甘油酯、乙二醇脂肪酸酯、乙二醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、聚甘油脂肪酸酯以及硬脂酰乳酸钠等，也可以是一种以上的乳化剂组成的复合乳化剂。在步骤1所述的酶溶液中或步骤2所述的含有酶的分散相中加入酶的保护剂。保护剂通常可以选自酶的底物、底物类似物、酶反应的产物、酶活抑制剂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或羟丙基-β-环糊精(ΗΡ-β-CD)等，也可以添加其它的蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)。在步骤4交联结束后，还可以加入交联剂的封闭剂，以钝化交联酶聚集体表面存在的未反应的交联剂活性基团，避免或减轻交联酶聚集体之间出现的团聚现象。所述的交联剂的封闭剂是指能与交联剂的活性基团发生反应的物质，例如当交联剂为戊二醛时，可以加入赖氨酸等含氨基化合物来中和交联酶聚集体表面存在的未反应的戊二醛的醛基。在步骤5后还可包括干燥所得交联酶聚集体的步骤，以便能够长期贮存交联酶聚集体。用本发明方法制备的交联酶聚集体，其形状较规则，近似球形。还提供按照本发明方法制备的海藻糖合酶的交联酶聚集体。本发明的优点和积极效果是1、利用本发明方法制备交联酶聚集体时，对酶的纯度要求不高，不需要结晶等复杂步骤，理论上能被沉淀的酶都可用该法制成交联酶聚集体，适用范围广。2、本发明方法制备的交联酶聚集体是无载体固定化酶，与载体固定化酶相比单位酶活高，应用时采用较小的反应器即可，这样就可以减少投资和操作费用。3、本发明方法制备的交联酶聚集体呈较规则的微球状，与在溶液中制备的无定形集簇状交联酶聚集体相比传质影响小，单位酶活高。
图1为实施例3在油包水乳液中制备的交联酶聚集体的光学显微镜图。图2为实施例9在溶液中制备的交联酶聚集体的光学显微镜图。
具体实施例方式结合附图及实施例对本发明进一步说明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。按照下述步骤在油包水乳液中制备交联酶聚集体步骤1:配制酶溶液。所述的酶可以是一种酶，也可以是一种以上的酶组成的复合酶。当所述的酶是海藻糖合酶时，可以通过脂肪杆菌(Pimelobacter sp.)、恶臭假单胞菌(I^eudomonas putida)、栖热菌(Thermus sp.)、亚栖热菌(Meiothermus sp.)或含有海藻糖合酶基因的工程菌发酵而得。当酶是固体形式的酶时，将酶以适宜的缓冲液或蒸馏水溶解，如果有不溶物，再采用离心或过滤的方法予以去除即可。当酶是液体酶时，可以直接使用，也可以用适宜的缓冲液或蒸馏水稀释至所需的浓度后使用。步骤2 于酶溶液中加入可以使酶聚集沉淀的沉淀剂，制备含有酶的分散相。沉淀剂的种类和浓度均可影响酶的活性，可以按照文献〔Schoevaart R，Wolbeis M W, Golubovic Μ, Ottens Μ, Kieboom A P, van Rantwijk F, van der Wielen L A, Sheldon R A. Pieparation, optimization, and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) Biotechnology and Bioengineering, 2004,87 (6)〕方法选择合适的沉淀剂及其使用浓度。加入沉淀剂并混勻的酶溶液，可以马上就作为含有酶的分散相；或者加入沉淀剂并混勻的酶溶液，置于O 300r/min的摇床中或于O 300r/min的转速下搅拌，待酶蛋白充分聚集沉淀后作为含有酶的分散相；或者待酶蛋白充分聚集沉淀后，分离酶聚集体，以酶聚集体作为含有酶的分散相。步骤3 将步骤2中含有酶的分散相分散于疏水性液体中，形成油包水乳液。可以采用均质乳化器、磁力搅拌器、机械搅拌器或其它乳化设备将含有酶的分散相与疏水性液体混合、乳化，形成油包水乳液。乳化时可用的操作条件，例如搅拌转速利搅拌时间等，为不会使酶明显失活的操作条件。为了能够形成稳定的油包水乳液，可以在乳化之前，在步骤1所述的酶溶液中，或步骤2所述的含有酶的分散相中，或步骤3所述的疏水性液体中加入油包水型乳化剂。此外，为了避免或降低油包水乳液中油水界而可能引起的酶活损失还可以在步骤1所述的酶溶液中或步骤2所述的含有酶的分散相中加入聚乙二醇 (PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或羟丙基环糊精(ΗΡ-β-CD)等物质作为酶的保护剂。 疏水性液体的种类、含有酶的分散相与疏水性液体的体积比、乳化剂的种类和添加量等都会影响最终所得交联酶聚集体的酶活，可以通过试验进行选择。通常含有酶的分散相与疏水性液体的体积比可选为1 1 1 100，优选为1 5 1 50。乳化剂的添加量可选为0.1 10% (w/v)，优选为0. 5 5%。步骤4 用交联剂交联油包水乳液中的酶聚集体。于步骤3形成的油包水乳液中加入交联剂，充分混合，然后进行交联。也可以先将交联剂加入到含有酶的分散相中，然后迅速与疏水性液体混合、乳化，形成油包水乳液后进行交联。交联剂与酶分子发生反应，通常会影响酶的高级结构，从而使酶的活性降低甚至丧失，因此为了降低交联反应引起的酶活损失，可以在步骤1所述的酶溶液中或步骤2所述的含有酶的分散相中加入酶的保护剂。交联剂的种类和添加量，交联反应时间、温度和PH 值，以及是否添加保护剂等都会影响所得交联酶聚集体的酶活。对于海藻糖合酶，可以选择戊二醛或葡聚糖聚醛为交联剂，当使用浓度为25%的戊二醛为交联剂时，添加量为0. 1 50% (25%浓度的戊二醛与含有酶的分散相的体积百分比)，优选为0.5 20% ；保护剂可选为麦芽糖、海藻糖、葡萄糖或BSA，可以只加入一种保护剂，也可以加入两种或两种以上的保护剂；含有酶的分散相的PH值可视为交联反应的pH值，可以选为pH5 9，优选为 PH6 8 ；交联反应温度不超过50°C，优选为不超过30°C;交联反应时间为0. 2 36h，优选为0. 5 Mh。交联反应结束后，还可以加入交联剂的封闭剂，以钝化交联酶聚集体表面存在的未反应的交联剂活性基团，避免或减轻交联酶聚集体之间出现的团聚现象。封闭剂的种类依交联剂而定，当交联剂为戊二醛时，常用的封闭剂为赖氨酸。步骤5 回收形成的交联酶聚集体。步骤4结束后，可以采用离心或过滤的方法从油包水乳液中分离形成的交联酶聚集体，将交联酶聚集体充分清洗后即可贮存备用。如果需要的话，还可以采用冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥或其它干燥方法将交联酶聚集体干燥后备用。由此获得的本发明的交联酶聚集体具有较规则的形状，近似球形，可用于相应的酶催化反应中。例如，当酶为海藻糖合酶时，用本发明方法制备的交联酶聚集体可用于转化麦芽糖制备海藻糖。实施例1 沉淀剂的选择用50mmol/L、pH7. 0的磷酸缓冲液配制海藻糖合酶溶液，取6份该海藻糖合酶溶液，每份lmL，分别加入饱和硫酸铵、浓度为30%的PEG6000、异丙醇、正丙醇、丙酮和乙醇各 9mL,进行聚集沉淀，定时取样、离心，测定上清液蛋白含量，直至约90%的蛋白被沉淀，离心收集酶聚集体沉淀，将酶聚集体用磷酸缓冲液重溶后测酶活，计算酶活回收率，结果见表1。表1沉淀剂对酶活的影响
权利要求
1.一种在油包水乳液中制备交联酶聚集体的方法，其特征是该方法包括以下步骤步骤1 配制酶溶液；步骤2 于酶溶液中加入可以使酶聚集沉淀的沉淀剂，制备含有酶的分散相； 步骤3 将步骤2中含有酶的分散相分散于疏水性液体中，形成油包水乳液； 步骤4 用交联剂交联油包水乳液中的酶聚集体； 步骤5 回收形成的交联酶聚集体。
2.权利要求1所述的制备交联酶聚集体的方法，其特征是在步骤1所述的酶溶液中，或步骤2所述的含有酶的分散相中，或步骤3所述的疏水性液体中加入乳化剂。
3.权利要求1所述的制备交联酶聚集体的方法，其特征是在步骤1所述的酶溶液中或步骤2所述的含有酶的分散相中，加入酶的保护剂。
4.权利要求1所述的制备交联酶聚集体的方法，其特征是在步骤4交联结束后还可以加入交联剂的封闭剂。
5.权利要求1所述的制备交联酶聚集体的方法，其特征是在步骤5后还可包括干燥所得交联酶聚集体的步骤。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法制备的交联酶聚集体，其特征是所述的交联酶聚集体近似球形。
7.权利要求6所述的交联酶聚集体，其中所述的酶为海藻糖合酶。
全文摘要
本发明公开了一种在油包水乳液中制备交联酶聚集体的方法，包括(1)配制酶溶液，(2)于酶溶液中加入可以使酶聚集沉淀的沉淀剂，制备含有酶的分散相，(3)将含有酶的分散相分散于疏水性液体中，形成油包水乳液，(4)用交联剂交联油包水乳液中的酶聚集体和(5)回收形成的交联酶聚集体等步骤。本发明方法制备的交联酶聚集体是无载体固定化酶，单位酶活高，可用于相应的酶催化反应中。
文档编号C12N9/00GK102304498SQ201110264080
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者唐柳, 张峻, 李明春, 杨丽维, 王宇凡, 邢来君, 陈晓云, 陈颖, 齐欣 申请人:南开大学, 天津市林业果树研究所