专利名称：一种猪免疫性状相关的cd169基因及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种猪免疫性状相关的CD169基因，同时还涉及一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，还涉及一种猪免疫性状相关的⑶169基因的用途。
背景技术：
自从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)被发现以来，其在全世界大部分地区流行，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。为了深入地了解猪繁殖与呼吸综合症的发病机理并控制该疾病，研究者们需要研究PRRSV受体的生物学特征，具体包括参与病毒吸附、内化、拆卸核衣壳、基因组释放过程中的受体。但是传统的治疗方法有很多局限性，无法有效地解决问题，而且药物及其有害物质残留影响动物食品安全和环境，因此动物遗传育种和分子标记辅助技术越来越受到重视。CD169(Sial0adheSin，Sn)，又名唾液酸粘附素，是一种I型跨膜糖蛋白。被鉴定为一种唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素受体，具有17个区域的复杂结构，分子结构包括细胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区含有免疫球蛋白V区和C区样结构(Crocker PR 等.Sialoadhesin, a macrophage sialic acid binding receptor for haemopoietic cells with 17 immunoglobulin-like domains.The EMBO Journal,1994,13(19) 4490-4503.)。⑶169具有强烈的巨噬细胞趋性，主要在组织巨噬细胞上表达。PRRSV侵入猪肺泡巨噬细胞后，CD169主要起粘附和内吞的作用，此过程需要借助病毒表面的唾液酸(Delputte PL 等.Porcine arterivirus infection of alveolar macrophages is mediated by sialic acid on the virus.Journal of Virology,2004,78(15) 8094-8101.)。Van Breedam等通过实验证明了病毒囊膜上的唾液酸与猪肺泡巨噬细胞 (PAM)上的pSn发生反应后，继而激发病毒的内吞。并且构建可溶的pSn与PRRSV的溶解产物发生免疫沉淀反应，结果表明是病毒的M/GP5 二聚体与pSn相互作用。虽然PRRSV有严格的细胞嗜性，但是在哺乳动物的非允许细胞表面表达重组的猪唾液酸粘附素后，PRRSV可以有效地吸附这些重组细胞。例如将包含Sn的质粒转染到非允许细胞H(-15，使Sn表达后接种PRRSV，虽然在重组细胞中没有发现病毒核衣壳拆卸及核病毒粒子的复制，但是在阳性细胞浆内发现了大量的病毒，表明PSn是介导PRRSV吸附和内吞的受体。安同庆等的实验结果表明，PSn的N端17-150氨基酸可能与病毒的吸附有关，而 C端胞质尾区可能是介导病毒内吞的因素。近来，有实验表明，病毒能够吸附一个仅由pSn 的N端区域直接偶联跨膜区和C短胞质尾区的片段(An TQ等.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment is mediated by the N-terminal domain of the sialoadhesin receptor. Vet Microbiol, 2010,143(2/4) :371-378.)。唾液酸凝集活性在PRRSV与受体CD169的结合中发挥了重要的作用，利用点突变的方法将N端的R116氨基酸转换成E"6氨基酸后，虽然整个蛋白质的结构没有明显的改变，但是pSn丧失了唾液酸凝集的能力，导致病毒无法吸附禾口内吞(Delputte PL等.Porcine arterivirus attachment to the macrophage-specific receptor sialoadhesin is dependent on the sialic acid-binding activity of the N-terminal immunoglobulin domain of sialoadhesin. J Virol, 2007,81 (17) :9546-9550.)，表明 R116 是 CD 169 与病毒的 M/GP5 二聚体结合的重要的位点。此外，CD169的唾液酸结合区域的R97不仅可以和唾液酸的碳水化合物形成盐桥， 而且可以和唾液酸的甘油侧链形成疏水性的接触，当R97被替换为赖氨酸之后，影响CD169 和唾液酸之间的疏水性作用，阻碍盐桥的形成，导致与唾液酰乳糖的结合能力显著降低。类似地，将R97转换成丙氨酸也会导致CD169丧失结合唾液酸的能力。同时使用肝素酶和pSn的特异性抗体MAb 41D3处理PAM后，完全阻断了 PRRSV对 PAM的吸附作用，说明硫酸乙酰肝素和pSn都介导了病毒对受体的吸附作用，并且PAM表面可能不存在参与吸附PRRSV过程的其他的受体，或存在但是数量很少以至于无法检测。鉴于⑶169基因在PRRSV感染PAM过程中的重要作用，因此以受体基因⑶169为靶基因，调控其功能，从而达到有效控制猪繁殖与呼吸综合症的目的，并且借助分子标记辅助选择，筛选CD169基因潜在的与免疫功能相关分子标记，为抗病育种提供参考。
发明内容
本发明的第一个目的是在于提供了一种猪免疫性状相关的CD169基因，该基因主要的作用是介导PRRSV的粘附和内吞。PRRSV侵入机体后，首先和细胞膜上的受体蛋白(例如⑶169)结合，然后在⑶169的协助下通过包吞作用进入细胞内。本发明的第二个目的是在于提供了一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，该方法通过设计特异性的引物，扩增包括一个突变位点的CD169基因的部分片段，并且根据HinfI-RFLP方法得到的不同酶切片段确定不同的基因型。本发明的第三个目的是在于提供了一种猪免疫性状相关的CD169基因在猪分子标记辅助选择中的应用。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，其步骤是1.引物设计利用引物设计软件I^rimer 5. 0 (Premier公司，加拿大)，以猪CD169基因 (GeneBank登录号NC_010459. 2)为模板设计出包含部分序列的扩增引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物对的DNA序列如下正向引物5‘-GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3‘ (SEQ ID NO 2)；反向引物5‘ -CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3 ‘ (SEQ IDNO 3)。2. PCR产物的纯化和测序PCR 扩增反应体系 20ul，包括 500ng 的 DNA，2. Oul 10XPCR buffer, 0.6ul IOmM dNTP,0. 8ul of each primer (IOuM) and 1 U Ampli Taq DNA polymerase (
物工程技术公司)。PCR反应条件为PCR的反应程序为95°C 5min ；94°C 40s, 58°C 30s， 72°C 30s，34个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图 2)。回收5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的PCR产物，每个品种选3个样本，混合测序。测序产物与猪⑶169基因(GeneBank登录号NC_010459.幻比对，成功获得猪⑶169基因部分序列615bp的片段(见序列表SEQ ID NO :1)。测序图出现明显双峰， 突变位点是C305-A305 (见序列表SEQ ID NO :1)。3. CRS-PCR-RFLP 方法检测分子标记 C305-A305 用引物序歹Ij (见序列表SEQ ID NO :2和SEQ IDNO 3)扩增CD169基因，得到615bp 的片段(见序列表SEQ ID NO :1)，用限制性内切酶HinfI鉴别CC、CA、AA三种基因型。在NCBI网站上查到与⑶169的615bp片段(见序列表SEQ ID NO 1)对应的氨基酸序列，用在线软件分析(http://smart, embl-heidelberg. de/)，该序列属于CD169蛋白的Igc2区域，包含成纤维细胞生长因子受体，血管内皮细胞生长因子受体，白介素6受体和神经细胞黏附分子，而这些细胞因子结合位点在免疫调节作用中有重要作用，表明该区域与免疫功能密切相关。一种猪免疫性状相关的CD169基因在猪分子标记辅助选择中的应用，以猪的DNA 为模板，利用引物(见序列表SEQ IDNO 2和SEQ IDNO 3)扩增⑶169的部分片段，得到 615bp 的 PCR 产物(SEQID NO 1)，用 PCR-HinfI-RFLP 方法检测 C305-A305 的多态性，鉴别出CC、CA、AA三种基因型，通过统计分析三种基因型的基因型频率与发病相对危险度的关联，筛选出AA基因型可能是与免疫相关的分子标记，为猪分子标记辅助选择提供参考。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1.分子标记是以DNA多态性为基础，表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；2.等位变异存在于自然界中，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为样本采集创造了条件；3.标记辅助选择可以缩短世代间隔，减少培育优良品种所需时间；4.操作简单，所需仪器设备较少，成本低，一般实验室均可进行；5.测序图直观，可以准确地筛选突变位点；6.琼脂糖凝胶电泳即可鉴别基因型，简单快捷，图片直观、准确。
图1为一种猪免疫性状相关的⑶169基因的制备方法流程图。图2为一种猪⑶169基因部分序列扩增的电泳图谱。片段大小为615bp (琼脂糖胶浓度为1.5%)。图中=Marker泳道为DNA分子量标准。图3为一种猪⑶169基因测序后发现的C305-A305突变位点。图4为一种是本发明中猪CD169基因PCR-HinfI-RFLP的三种基因型(CC，CA和 AA)电泳图谱。
具体实施例方式实施例1 —种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，其步骤是根据猪CD169基因(GeneBank登录号NC_010459. 2)序列设计引物，从猪的血液中提取DNA作为模板，扩增PCR，回收，纯化，测序。查找突变位点，用CRS-PCR-RFLP的方法鉴别基因型，并分析3种基因型的发病相对危险度，筛选与免疫相关的分子标记(图1)。1.引物设计利用引物设计软件I^rimer 5. 0 (Premier公司，加拿大)，以猪CD169基因 (GeneBank登录号NC_010459. 2)为模板设计出包含部分序列的扩增引物，用来扩增“杜长大”(由国外品种“杜洛克”，“长白”和“大白”三个品种杂交得到，是一种中国普遍推广应用的商用猪)CD169基因的部分序列。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物对的 DNA序列如下正向引物5 ‘ -GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3 ‘，反向引物5‘ -CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3 ‘。2. PCR产物的纯化和测序(I)PCR 扩增从猪品种血液中提取总DNA，以此DNA作为模板。PCR扩增反应体系20ul，包括 500ng 的 DNA，2. OullOXPCR buffer, 0. 6ul IOmM dNTP，0.8ul of each primer (IOuM) and 1 U Ampli Taq DNA polymerase (上海生工生物工程技术公司)。PCR反应条件为PCR的反应程序为95°C 5min ；94°C 40s, 58°C 30s, 72°C 30s，;34 个循环；72°C延伸 lOmin。扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图2)。(2) PCR产物的纯化及测序以5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的DNA为模板，每个品种内随机挑选3个个体用于PCR扩增，回收猪5个品种PCR扩增产物，混合测序。利用北京天根生物技术公司生产的小量DNA片段纯化试剂盒进行纯化回收，具体方法参考该试剂盒的操作说明书。序列测定由上海生工生物工程技术公司完成。(3) DNA序列同源性检索鉴定通过NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的参考序列(登录号NC_010459. 2)进行比对，其序列为SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，结果显示成功克隆得到猪CD169基因部分序列615bp的片段 (见序列表SEQ ID NO :1)。(4) DNA序列中突变位点的筛选通过NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的序列(登录号NC_010459. 2)进行比对，将5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的混合测序峰图导入^qMan软件(DNASTAR公司，美国)进行比对分析，结果显示在猪CD169基因部分序列1个位点出现明显的双峰，这说明该基因在这个位点处发生了碱基突变(见图幻。这个突变位点是C305-A305 (见序列表SEQ ID NO 1)。CRS-PCR-RFLP基因型检测方法的建立1.引物设计针对多态位点C305-A305点设计了一对引物，用于基因型检测，其核苷酸序列序列分别如下所示(与序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的序列相同)正向引物5，-GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3，(见序列表SEQ ID NO 2)
反向引物5，-CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3，(见序列表SEQ ID NO 3)2. PCR 扩增20uL 的反应体系中加入 DNA模板 1 μ L，双蒸水 14. 3 μ L，10 X PCR buffer 2. 0 μ L， IOmMdNTP 0. 6 μ L, IOuM 引物各 0. 8 μ L, Taq 酶 IU0 PCR 反应条件为94°C预变性 5min 后， 94°C变性 40s、58°C退火 30s、72°C延伸 30s，;34 个循环，最后 72°C延伸 IOmin0 3 μ L PCR 产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测(见图3)，阳性样品用于下一步酶切检测。3. RFLP 检测HinfI-RFLP 检测分子标记 C305-A305将PCR产物6 μ L，10XBuffer 1 μ L，限制性内切酶HinfI为4U，加双蒸水补至 ομ L，将样品混勻后离心，37°C培养箱放置12h，酶切产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测分型。分子标记基因型分析如图4所示，分别代表C305-A305处单核苷酸多态性(SNP) 3 种不同的基因型(基因型用其突变碱基表示044丄幻，电泳结果显示0基因型(有4条带，长度为 471bp、92bp、36bp、17bp)、CA 基因型(有 6 条带，长度为 471bp、268bp、202bp、 92bp、36bp 和 17bp)和 AA 基因型(有 5 条带，长度为 268bp/202bp/92bp/36bp/17bp)，其中 36bp和17bp由于片段太小，无法用琼脂糖胶显示出来。实施例2 CD169分子标记分型方法在免疫性状关联分析中的应用试验共检测了 256头“杜长大”猪个体的多态性，包括发病猪215头，健康猪41 头。用CRS-PCR-RFLP方法确定其基因型，并进行基因突变位点与猪繁殖与呼吸综合征的关联分析。应用SAS软件(赛仕软件(北京)有限公司，北京)的Logistic回归模型分析方法，设定一个基因型的OR值(OR值的全称是odd ratio，又称比值比，对于发病率很低的疾病来说，它的OR值即是相对危险度的精确估计值)为参考值(OR= 1)，计算另外2种基因型的OR值，如果OR值大于1，且P值小于0. 05，则此基因型可能是一个危险因子，即猪群中携带此基因型的个体容易感染猪繁殖与呼吸综合征；反之，如果OR值小于1，且P值小于0. 05，则此基因型可能是保护因子，即猪群中携带此基因型的个体对猪繁殖与呼吸综合征有抵抗力。95% CI表示OR值的95%置信区间(Andrew Μ. Smith MD 等，Environmental Tobacco Smoke and Interleukin 4 Polymorphism(C-589T)Gene Environment Interaction Increases Risk of Wheezing in African-American Infants. The Journal of Pediatrics,2008,152(5) :709-715 ；Yen-Li Lo φ, ATM polymorphisms and risk of lung cancer among never smokers. LungCancer，2010，69 :148—154.)。(一)基因型检测结果表明在256个个体中，CC基因型有85个个体，CA基因型有 127个个体，AA基因型有44个个体。等位基因C与等位基因A在各个群体中的分布情况见表1，通过观察可以看出在“杜长大”中，C等位基因为优势等位基因。表1CD169基因的SNP在群体中基因型频率和基因频率分布
权利要求
1.一种分离的猪免疫力相关的切彬9基因，其序列为SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。
2.一种检测基因片段的引物，其特征在于所述的正向引物为SEQ ID NO :2，反向引物为 SEQ ID NO :3ο
3.权利要求1所述的一种分离的猪免疫力相关的CD169基因在猪分子标记辅助选择中的应用。
4.权利要求2所述的一种检测基因片段的引物在猪分子标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪免疫性状相关的CD169基因及制备方法和应用，从猪的血液中提取总DNA，根据GenBank公布的猪CD169序列(GeneBank登录号NC_010459.2)为模板设计引物(正向引物5'-GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3'，反向引物5'-CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3')，PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得了序列为SEQIDNO1所示的核苷酸序列，该序列包括一个突变位点C305-A305，此位点可以被HinfI内切酶识别，因此应用CRS-PCR-RFLP方法检测猪CD169基因的多态性。该基因主要的作用是介导PRRSV的粘附和内吞。PRRSV侵入机体后，首先和细胞膜上的受体蛋白(例如CD169)结合，然后在CD169的协助下通过包吞作用进入细胞内。本发明为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12N15/10GK102296074SQ20111026368
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者任钰为, 周傲, 张淑君, 张演寅, 方六荣, 杨利国, 梁爱心, 贾启涛, 赵俊龙, 陈星 , 陈焕春 申请人:华中农业大学