专利名称：一种快速检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测IU8B SNP rsl2979860多态性的试剂盒，用于预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果。
背景技术：
丙型肝炎Ofepatitis C infection)是严重危害人类健康的感染性疾病，其流行呈世界性分布。据WHO统计数据，全球约有1.4亿-1.7亿丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus, HCV)感染者。我国HCV的感染率约为3.2%，约3800万HCV感染者，每年新发丙型肝炎病例约3. 5万例。以往的研究表明，丙型肝炎的治疗方式与治疗效果与病毒基因型密切相关，基因型1和基因型4的患者使用聚乙二醇干扰素、利巴韦林(PeglFN/RBV)联合治疗48周；基因型2和基因型3的患者使用聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗M周。新近的研究表明， 除了病毒方面的因素(基因型、HCV RNA水平)外，患者自身的因素也能对抗病毒治疗效果进行预测，其中IU8B多态性是一个重要的预测因子(Manns and others，2001)。IL28B基因位于第19号染色体短臂(19ql3)，编码干扰素λ (IFN- λ -3)参与抗病毒免疫反应，IL28B能刺激干扰素释放，增加细胞毒性T淋巴细胞的数量。通过全基因组相关性研究(GWAQ发现，IL28B基因附近的SNP rsl2979860多态性与聚乙二醇干扰素、 利巴韦林联合治疗的效果显著相关，在HCV基因型1和4的患者中，IL28B保护性变异即 SNP rsl2979860CC型患者获得的持续病毒反应(SVR)比TT型高2倍；在HCV基因型2和 3型的丙型肝炎患者中SVR变化较小(Lange and Zeuzem，2011)。在欧美人群中，IL28B rsl2979860CC型比CT或TT型丙型肝炎患者的病毒清除率高2-3倍之多(Thomas DL, 2009)。在汉族人群中也发现，CC型比非CC型丙型肝炎患者获得显著增高的持续病毒反应与治疗终末反应(ETR) (Liao XW，2011)。IL28B基因多态性是目前为止GWAS发现用于个性化临床治疗的最好典范之一(Maxmen，2011)。IU8B rsl2979860多态性检测还可用于肝移植前的供体筛查，复发性丙型肝炎患者的管理。在丙型肝炎临床治疗中，快速病毒反应(RVR)是评价疗效的重要指标，在不能获得快速病毒反应的患者中，IU8B rsl2979860CC型患者较非CC型患者更易获得持续病毒反应(Clark and others，2011)，充分表明CC型是所谓的“保护型”。综合大量临床研究的结果，在丙型肝炎抗病毒治疗的宿主和病毒多种影响因素中，IL28B多态性是预测持续病毒反应的最有效因子。在抗病毒治疗前，对患者进行IL28B多态性检测，确定IU8B rsl2979860 基因型将极大地有助于临床医生选择治疗方案，如选择抗病毒药物的种类和决定治疗持续时间。目前可用于SNP多态性检测的方法有限制性片段长度多态性、荧光定量PCR、基因测序法等。限制性片段长度多态性技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断；荧光定量PCR和基因测序法成本高，不易临床推广；普通PCR操作简便，成本低廉， 便于临床推广使用。
因此，有必要选择一种简便快速的方法检测IU8B rsl2979860多态性，指导临床治疗，预测丙型肝炎抗病毒治疗效果。我们根据IU8B rsl2979860多态性存在CC，CT, TT 的三种形式，针对SNP位点设计特异性引物，进行普通PCR反应，通过反应产物的“有或无” 来判断待测样品属于哪一种多态性形式。目前尚无文献报道利用普通PCR反应进行IU8B SNP rsl2979860检测的试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测IL28B SNP rsl2979860多态性的试剂盒，用以预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果。本发明的试剂盒利用普通PCR技术，包含人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液，还包含IU8B TT基因型扩增引物和CC基因型扩增引物，以及内部参照基因扩增引物，TT基因型上游扩增引物序列为5' -TCGCCAGGGCCCCTAACCTC-3‘TT基因型下游扩增引物序列为5’ -GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCA-3’CC基因型上游扩增引物序列为5， -GAGGATCCCTCCTGGGGCGG-3，CC基因型下游扩增引物序列为5’ -GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCG-3’内部参照基因上游扩增引物5’ -TTATCGCATACGGCTAGGC-3’内部参照基因下游扩增引物5， -CACAATTCCCACCACGAGA-3，。其中的人外周血基因组提取试剂为去离子水，6M Nal，氯仿/异戊醇Q4 Lv/ ν)混合液，异丙醇和无水乙醇。其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以已知基因型的外周血基因组DNA为阳性对照。其中的PCR反应液包括10XPCR混合液、0. 25pmol/y L的引物、2. 5 4. OmM的 MgCl2,2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4mM 的 dNTPs、0. 3 0. 6mM dUTP、通常取 1 2 μ L 的模板。用本发明的试剂盒检测临床待检者外周血IU8B SNP rsl2979860基因多态性，预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果情况首先使用外周血基因组DNA提取试剂得到患者外周血基因组DNA，利用合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用DNA凝胶电泳，凝胶成像系统下观察电泳条带，判断rsl2979860基因多态性。该试剂盒操作简便、检测过程短、经济有效，可广泛用于丙型肝炎患者抗病毒治疗前的疗效筛查，便于临床医生有针对性的制定治疗方案，有很高的临床应用价值，特别适合临床推广。本发明试剂盒的优点和有益效果如下(1)敏感本方法利用设计的特定性引物，采用PCR技术结合凝胶成像技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异使用针对IU8B SNP rsl2979860多态性位点的特异性引物对其进行分子识别，具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。(4)快速速度快、高通量，可在2 3小时完成。(5)经济、便捷在一次测定中同时完成IU8B SNP rsl2979860TT型、CC型及TC 型的检测，便于临床广泛开展，节省患者开支。
图1IU8B SNP rsl2979860CC基因型分析结果A为PCR扩增产物DNA凝胶电泳结果，B为基因测序比对结果。图2IU8B SNP rsl2979860TT基因型分析结果A为PCR扩增产物DNA凝胶电泳结果，B为基因测序比对结果。图3IU8B SNP rsl2979860CT基因型分析结果A为PCR扩增产物DNA凝胶电泳结果，B为基因测序比对结果。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1本发明试剂盒的制备(1)外周血基因组DNA提取试剂组成如下去离子水，6M Nal，氯仿/异戊醇 (24 1，ν/ν)混合液，异丙醇和无水乙醇。(2)引物TT基因型上游扩增引物序列为5' -TCGCCAGGGCCCCTAACCTC-3‘ (SEQ ID No. 1)TT基因型下游扩增引物序列为5，-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCA-3，(SEQ ID No. 2)CC基因型上游扩增引物序列为5，-GAGGATCCCTCCTGGGGCGG-3，(SEQ ID No. 3)CC基因型下游扩增引物序列为5，-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCG-3，(SEQ ID No. 4)内部参照基因上游扩增引物5，-TTATCGCATACGGCTAGGC-3，(SEQ ID No. 5)内部参照基因下游扩增引物5，-CACAATTCCCACCACGAGA-3，(SEQ ID No. 6)上述引物序列由上海Life Technology公司合成。(3)阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以已知基因型的外周血基因组DNA为阳性对照。(4)PCR 反应液:10XPCR 混合液、0. 25pmol/y L 的引物、2. 5 4. OmM 的 MgCl2,2U 的Taq酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs、0. 3 0. 6mM dUTP、通常取1 2 μ L的模板。
(5) PCR扩增程序的设定在ABI9700仪器上通常是先95°C 5min，然后95°C 30s, 57°C 45s, 72°C lmin，循环 30 次，最后 72°C IOmin0(6)2% (g/ml)的DNA凝胶电泳后，凝胶成像系统下观察PCR产物，判别IU8BSNP rsl2979860 多态性。实施例2用实施例1制备的试剂盒检测人外周血IU8B SNP rsl2979860多态性以检测20例丙型肝炎患者外周血样品基因组DNA中IU8B SNP rsl2979860多态性为例。(1)检测流程首先根据NCBI核酸数据库提供的人IU8B SNP rsl2979860序列设计特异性引物。获取临床丙型肝炎患者外周血样品，快速提取基因组DNA ；配置PCR反应液进行PCR扩增，然后凝胶成像系统下观察特征性PCR扩增产物大小，判别rsl2979860多态性。具体步骤如下(1)外周血基因组DNA的抽提按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提丙型肝炎患者外周血中基因组DNA。(2) PCR 扩增PCR 反应体系为 20 μ 1 含 2X PCR premix (混合液)10. 0 μ L，引物浓度0. 2ymol/L，超纯水补齐。在ABI9700仪器上通常是先95 °C 5min，然后95°C 30s， 57°C 45s, 72°C lmin，循环 30 次，最后 72°C IOmin0(3)2% (g/ml)的DNA凝胶电泳后凝胶成像系统下观察特征性PCR产物大小，判别 rsl2979860多态性(图1、图2、图3)。(4)结果
权利要求
1.一种快速检测IU8B SNP rsl2979860多态性的试剂盒，包含人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液，还包含IU8B TT基因型扩增引物和CC基因型扩增引物，以及内部参照基因扩增引物，TT基因型上游扩增引物序列为 5’- TCGCCAGGGCCCCTAACCTC -3’ TT基因型下游扩增引物序列为 5' -GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCA-3‘ CC基因型上游扩增引物序列为5’ -GAGGATCCCTCCTGGGGCGG-3， CC基因型下游扩增引物序列为 5' -GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCG-3‘ 内部参照基因上游扩增引物 5' -TTATCGCATACGGCTAGGC-3‘ 内部参照基因下游扩增引物 5’ -CACAATTCCCACCACGAGA-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中的人外周血基因组提取试剂为去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇按体积比M 1的混合液，异丙醇和无水乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以已知基因型的外周血基因组DNA为阳性对照。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的PCR反应液包括10XPCR 混合液、0.25 pmol/μ L 的引物、2. 5 4. 0 mM 的 MgCl2、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4 mM 的 dNTPs、 0. 3 0. 6 mM dUTPo
全文摘要
本发明涉及一种快速检测IL28B基因的SNPrs12979860多态性的试剂盒。该试剂盒通过设计特异性引物，与样品中模板DNA进行普通PCR反应，根据PCR反应的结果判断样品IL28BSNPrs12979860的多态性形式(CC、CT、TT)，从而为丙型肝炎患者的临床抗病毒治疗提供疗效预测的结果。该试剂盒操作简便、检测过程短、经济有效，可广泛用于丙型肝炎患者抗病毒治疗前的疗效筛查，便于临床医生有针对性的制定治疗方案，有很高的临床应用价值，特别适合临床推广。
文档编号C12Q1/68GK102277441SQ201110263288
公开日2011年12月14日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者李艳, 童永清 申请人:李艳, 童永清