专利名称：一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法。
背景技术：
最近30 50年中，癌症治疗主要依赖于放疗和化疗，这些治疗方式在抑制癌细胞的同时也损伤了正常的细胞，所以寻找对正常细胞无副作用的癌症治疗药物有非常重要的意义。研究表明，白桦脂醇及其衍生物具有这种潜在的能力，特别是白桦脂酸，在癌症治疗方面表现出巨大的潜能，有实验表明其对小鼠恶性肿瘤有良好的抑制作用，而对正常细胞的毒性却极低，是最有潜力的新型药物制剂，相关研究已成为近年来天然有机药物研究的执占。微生物转化是指利用微生物代谢过程中某个酶或酶系，对底物进行结构改造或修饰，转化为相关产物的过程。微生物转化反应范围广，几乎包括了所有的有机化学反应类型，如氧化反应、还原反应、水解反应、缩合反应等。微生物转化步骤少，副反应少，周期短， 而且往往具有专一性和选择性。目前，制备白桦脂酸主要通过直接提取法或化学合成法，均存在一定的缺陷，而通过微生物转化法合成白桦脂酸目前研究甚少。公告号为CN101457250B的发明专利公开了一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括向灭菌过的培养液中接入黄绿蜜环菌ZJUQH，得到预反应体系； 再加入含有白桦脂醇的底物溶液，于25 30°C转化反应5 7天得到转化后的培养液，经后处理得到白桦脂酸，其中白桦脂醇加入量以每升培养液计为0.01 0. Igo该专利方法白桦脂酸产率仍较低，转化反应时间较长，附加产物较多，且由于转化机理不明确，后续很难进一步提高白桦脂酸产率。细胞色素P450酶系是一类含高铁血红素的蛋白，在生物界中广泛存在。作为一种末端氧化酶，细胞色素P450主要催化机体内源和外源性物质在体内的氧化反应，参与大部分药物的氧化代谢和杀虫剂、除草剂等外源物的解毒，以及固醇类、萜类、黄酮类等次级天然产物的生物合成，在医学和药学领域受到广泛关注。真菌，尤其是丝状真菌对许多药物的转化反应都是由细胞色素P450酶介导的，通过使用一些经典的细胞色素P450酶抑制剂，如 SKF525A，美替拉酮(metyrapone)或CO等对转化反应的抑制作用已经间接证明了细胞色素 P450酶参与了转化反应。与哺乳动物类似，真菌的细胞色素P450酶也是结合在内质网膜上。Cunninghammella Matruchot是一类丝状真菌，根据形态及生理特性分为5个种 刺孢(短刺)小克银汉霉(C. echinulata(Thaxt.) Thaxter)、班氏小克银汉霉(C. bainieri N. Naumov = C. japonica (Saito) Ito)、布氏小克银汉霉(C. blakesleeana Lendner = C. verticillata Paine)、巴西果小克银汉霉(C. bertholletial Madel)、绮丽(雅致)小克银汉霉(C. elegans Lender)。小克银汉霉菌属的许多菌株具有与人体类似的I相和II相药物代谢酶，在模拟人体的药物代谢研究方面得到广泛的应用。黄海华等选用短刺小克银汉霉菌AS 3. 153对普萘洛尔进行了芳环氧化试验，结果显示该菌株具有良好的选择性氧化能力，主要形成5-羟基普萘洛尔，转化4 产率达76%左右，证明该菌体中存在与药物代谢有关的氧化酶(黄海华，陈笑艳，崔红霞等.采用微生物转化法合成5-羟基普萘洛尔.药物生物技术，2001,8(5) :268-271.)。钟大放等以小克银汉霉菌CunninghamellaAS 3.910 为转化株，对SFZ-47进行了代谢转化，通过改变转化条件获得了多种类、高产率的代谢物 (钟大放，王英等.小克银汉霉菌对SFZ-47的代谢转化.Pharmaceutical Biotechnology 1997,4(3) :158-163.)。其中，短刺小克银汉霉是一种常用的微生物转化菌，被称为“药物代谢载体”，其具有与哺乳动物药物代谢酶功能相似的细胞色素P450同工酶和其他与药物代谢有关的酶系，可进行某些I相和II相药物代谢反应，经过I相代谢反应包括氧化、还原、 水解等，药物能产生羧基、羟基、氨基等基团，改变原有基团或增加新的基团，使底物的生物活性改变包括药用功能的活化。
发明内容
本发明提供了一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，以植物中来源丰富的白桦脂醇为底物，利用短刺小克银汉霉生物转化合成白桦脂酸，工艺简单，转化条件温和，转化时间短，产物得率高，安全性高。一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括(1)向培养液中接入短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)AS 3.910， 得到预培养体系；(2)向步骤⑴得到的预培养体系中加入白桦脂醇溶液，使白桦脂醇的浓度达到 0. 01 0. lg/L，于25 30°C转化反应2 6天得到转化液；(3)所述的转化液经分离纯化得到白桦脂酸。所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株编号为3. 910。步骤(1)中，为获得预培养体系可采用直接生长转化法或静息细胞转化法。采用直接生长转化法时所述的步骤(1)为向生长培养基中接入短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液， 于25 30°C培养1 3天得到预培养体系。优选地，以体积IL计，所述的生长培养基包括葡萄糖0 40g，酵母膏1 5g， 蛋白胨2 5g，磷酸氢二钾1 5g，生长培养基的pH为6. 0 7. 0。更优选地，以体积IL 计，所述的生长培养基包括葡萄糖40g，酵母膏5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾5g，生长培养基的pH为6. 5。优选地，所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液的接入量以每升生长培养基计为10 50mL，更优选为20mL。其中，所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液中短刺小克银汉霉AS 3. 910的孢子浓度优选为1 X IO6 1 X IO8个/毫升。所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液的制备可以采用如下方法将在4°C 下保藏的短刺小克银汉霉AS 3. 910接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于25 30°C活化培养5 6天，菌株活化后用接种针刮入无菌水中，振荡制得短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液。
优选地，所述的生长培养基接种后的培养温度为^°C，培养时间为2天。采用静息细胞转化法时所述的步骤(1)为向含有葡萄糖的磷酸缓冲溶液中接入短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞，得到预培养体系。优选地，所述的磷酸缓冲溶液的pH为6，磷酸缓冲溶液中葡萄糖的质量百分比溶度为1 3%。所述的磷酸缓冲溶液采用本领域常规配制方法进行配制即可。优选地，所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞的接入量以每升磷酸缓冲溶液计为100 250g。所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞的制备可以采用如下方法取短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液加入生长培养基中，于25 30°C、转速160 200rpm的摇床中培养2 3天后停止培养，通过冷冻离心或无菌过滤的方法除去培养液，得到短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞。其中，短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液的制备方法、生长培养基的成分可以与上述直接生长转化法中的相同。步骤(2)中，所述的白桦脂醇可以为市售商品或自制产品，纯度为90%以上。 CN1013^201A的发明专利申请公开了一种从桦树皮中提取白桦脂醇的方法，能得到纯度 90%左右的白桦脂醇，本发明可采用该方法制备白桦脂醇作为本发明的底物，不但能降低成本、综合利用资源，而且更能为工业化生产提供参考。优选地，所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇浓度达到7 9mg/mL的二甲基亚砜溶液，即该溶液的溶剂为二甲基亚砜。二甲基亚砜属于极性非质子溶剂，可与多种有机溶剂或水互溶，对某些反应具有加速、催化等作用。底物白桦脂醇微溶于水，以二甲基亚砜作为溶剂能提高白桦脂醇在水相培养液中的溶解性，同时也更有利于细胞与底物的接触。优选地，所述的白桦脂醇在预培养体系中的浓度为0. 03g/L。此添加量下，能确保所加入的二甲基亚砜和白桦脂醇不会影响水相培养液中菌体细胞的催化活性。优选地，所述的预培养体系中还加有体积百分比浓度为0. 1 1. 0%的表面活性剂；更优选地，所述的表面活性剂为吐温80，吐温80在所述的预培养体系中的体积百分比浓度为0. 1%。表面活性剂能降低两种液体间的界面张力，提高有机相在水相中的可溶性。 本发明在添加底物的同时添加低浓度的吐温80，更有利于底物白桦脂醇在预培养体系中的分散和溶解，提高微生物细胞与底物之间的接触。优选地，所述的转化反应温度为^°C，转化反应时间为4天，该条件下进行转化反应最有利于微生物细胞的生长和产物的积累。所述的预培养体系中加入白桦脂醇溶液后，可以置于摇床中进行转化反应，摇床转速优选为120 200rpm，更优选为ISOrpm，这样更有利于细胞的分散及其与底物的充分接触。步骤(3)中，所述的分离纯化包括转化液经离心取上清液，调节上清液pH至3 4，用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩得到白桦脂酸。采用萃取法能从转化液中有效分离出白桦脂酸产物，操作简单方便；所得到的白桦脂酸可根据需要进一步提纯。调节上清液的pH可采用常用的酸或碱，如盐酸、氢氧化钠等。传统化学合成法中，白桦脂酸可由白桦脂醇经几步氧化、还原反应制得。本发明利用短刺小克银汉霉为载体，以桦树皮中提取获得的白桦脂醇为底物，通过直接生长转化法
5或静息细胞转化法催化合成白桦脂酸，具有比较清晰的作用机理，是一种机理清晰、转化路线简单且具有可操作性的转化方式和体系。本发明工艺简单，条件温和，便于控制，转化周期短，且环境友好，能获得较高得率的白桦脂酸。同时，针对本发明所用的短刺小克银汉霉， 后续可深入研究相关催化转化机理，以便进一步提高白桦脂酸的转化得率。
图1为本发明方法的流程示意图。
具体实施例方式实施例1采用直接生长转化法转化白桦脂醇合成白桦脂酸(1)短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液的制备将在4°C下保藏的短刺小克银汉霉AS 3. 910(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于活化培养6天；在超净台上，将活化后的短刺小克银汉霉AS 3. 910 用接种针刮入装有IOOmL无菌水和若干个玻璃珠的锥形瓶中，振荡制得短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液，其中短刺小克银汉霉AS 3. 910的孢子浓度为IX IO6个/毫升。(2)预培养体系的制备取葡萄糖20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾5g，加入IOOOmL水中，加热混勻，调pH至6. 5，获得生长培养基，分装于锥形瓶，使每个锥形瓶含 30mL生长培养基；向30mL生长培养基中接入ImL短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液， 于^°C、转速ISOrpm的摇床中培养2天得到预培养体系。(3)转化合成白桦脂酸向预培养体系中加入0. 2mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液 (浓度7. 5mg/mL,白桦脂醇纯度为90% )，于、转速ISOrpm的摇床中转化反应3天得到转化液。(4)后处理及产物含量测定转化液经3000rpm冷冻离心30分钟，取上清液，调节上清液PH至3 4，用乙酸乙酯萃取，萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦脂酸。采用RP-HPLC 法测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量。其中，测定白桦脂醇、白桦脂酸含量的RP-HPLC法可参照发明专利CN101457250B 公开的相关部分。白桦脂酸得率(Pg/lOOmL)=生成的白桦脂酸质量(μ g)/培养液体积 (mL)X 100;白桦脂醇转化率(％)=消耗的白桦脂醇质量(mg)/加入的白桦脂醇总质量 (mg) X 100%。实施例2采用静息细胞转化法转化白桦脂醇合成白桦脂酸(1)短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞的制备取ImL短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液(孢子浓度为IX IO6个/毫升)加入30mL生长培养基中，于、转速ISOrpm 的摇床中培养2天后停止培养，于3000rpm冷冻离心30分钟，蒸馏水洗3次，除去培养液， 得到短刺小克银汉霉AS3. 910湿细胞。其中，短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液的制备方法、生长培养基的成分与实施例1中的相同。(2)预培养体系的制备于超净台上，向30mL含有2%葡萄糖的磷酸缓冲溶液(pH 为6)中接入5g短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞，得到预培养体系。(3)转化合成白桦脂酸向预培养体系中加入0. 2mL白桦脂醇的二甲基亚砜溶液(浓度7. 5mg/mL,白桦脂醇纯度为90% )，于、转速ISOrpm的摇床中转化反应3天得到转化液。(4)后处理及产物含量测定转化液经3000rpm冷冻离心30分钟，取上清液，调节上清液PH至3 4，用乙酸乙酯萃取，萃取液经旋转蒸发浓缩得到白桦脂酸。采用RP-HPLC 法测定样品中白桦脂醇、白桦脂酸的含量。对比实施例1、实施例2两种不同转化方式下的白桦脂醇转化率和白桦脂酸得率， 具体结果见表1。表1直接生长转化法与静息细胞转化法催化合成白桦脂酸的比较
权利要求
1.一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括(1)向培养液中接入短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleeana)AS 3. 910，得到预培养体系；(2)向步骤(1)得到的预培养体系中加入白桦脂醇溶液，使白桦脂醇的浓度达到 0. 01 0. lg/L，于25 30°C转化反应2 6天得到转化液；(3)所述的转化液经分离纯化得到白桦脂酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)为向生长培养基中接入短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液，于25 30°C培养1 3天得到预培养体系；其中， 以体积IL计，所述的生长培养基包括葡萄糖0 40g，酵母膏1 5g，蛋白胨2 5g，磷酸氢二钾1 5g，生长培养基的pH为6. 0 7. 0 ；所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液的接入量以每升生长培养基计为10 50mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)为向生长培养基中接入孢子浓度为1 X IO6 1 X IO8个/毫升的短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液，于培养2天得到预培养体系；其中，以体积IL计，所述的生长培养基包括葡萄糖40g，酵母膏 5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾5g，生长培养基的pH为6.5 ；所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910孢子悬浮液的接入量以每升生长培养基计为20mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)为向含有葡萄糖的磷酸缓冲溶液中接入短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞，得到预培养体系；其中，所述的磷酸缓冲溶液的PH为6，磷酸缓冲溶液中葡萄糖的质量百分比溶度为1 3%;所述的短刺小克银汉霉AS 3. 910湿细胞的接入量以每升磷酸缓冲溶液计为100 250g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤O)中，所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇浓度达到7 9mg/mL的二甲基亚砜溶液；所述的白桦脂醇在预培养体系中的浓度为 0.03g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤O)中，所述的预培养体系中还加有体积百分比浓度为0. 1 1. 0%的表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的表面活性剂为吐温80，吐温80在所述的预培养体系中的体积百分比浓度为0. 1%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤O)中，所述的转化反应温度为 ^°C，转化反应时间为4天。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤O)中，所述的预培养体系中加入白桦脂醇溶液后置于摇床中进行转化反应，摇床转速为120 200rpm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的分离纯化包括转化液经离心取上清液，调节上清液PH至3 4，用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩得到白桦脂酸。
全文摘要
本发明公开了一种短刺小克银汉霉转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括向灭菌过的培养液中接入短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleeana)AS 3.910，得到预培养体系，再加入白桦脂醇溶液和表面活性剂，使白桦脂醇的浓度达到0.01～0.1g/L，于25～30℃转化反应2～6天得到转化液，经分离纯化得到白桦脂酸。本发明方法利用短刺小克银汉霉为载体，以白桦脂醇为底物生物转化合成白桦脂酸，工艺简单，条件温和，转化周期短，产物得率高，环境友好，能获得较高得率的白桦脂酸。
文档编号C12P33/00GK102286595SQ201110263709
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者何国庆, 傅明亮, 冯宇, 刘婧, 董亚晨, 陈启和 申请人:浙江大学