一种螺内酯衍生物及其微生物转化制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物转化制备羟基螺内酯的方法，所述方法为：以雅致小克银汉霉（Cunninghamella?elegans）ATCC9245经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以螺内酯为底物，以无水乙醇为助溶剂，于原发酵液或pH6.8的磷酸缓冲液中构成转化体系，在25～32℃、150～300r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得12β-羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯；本发明生物转化法合成了2种羟基螺内酯，利尿作用较原螺内酯有一定的提高；用作生物催化剂的微生物菌株安全无毒，培养条件简单，抗杂菌污染能力强，易于大规模培养；转化操作简便，反应过程中不需要使用任何其他试剂，转化收率高，成本低，易于实现工业化应用。
【专利说明】一种螺内酯衍生物及其微生物转化制备方法与应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种羟基螺内酯的合成方法，特别涉及一种以雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)ATCC9245为生物催化剂，以螺内酯为底物制备12 β -羟基-螺内酯和2α-羟基-螺内酯的新方法。
(二)【背景技术】
[0002]螺内酯(spironolactone),化学名为17 β -羟基_3_氧_7 α -(乙酰硫基)-17 α -孕甾-4-烯-21-羧酸-Y -内酯,临床药物又称安体舒通(antisterone),分子
结构为式(ΠΙ)所示:
[0003]
【权利要求】
1.一种螺内酯衍生物，其特征在于所述螺内酯衍生物为式(I )所示12β-羟基-螺内酯或式(II)所示2 a -羟基-螺内酯:
2.一种微生物转化法制备权利要求1所述螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述方法为:以雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans) ATCC9245经发酵培养获得的含菌发酵液或发酵液离心后的湿菌体与PH6.8的磷酸缓冲液制成的含菌体悬液为生物催化剂，以螺内酯为底物，以无水乙醇为助溶剂构成反应体系，在25~32°C、150~300r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得12 β -羟基-螺内酯和2 α -羟基-螺内酯；所述生物催化剂的用量以含湿菌体重量计为30~40g/L转化体系，所述底物的初始浓度为20~80mg/L转化体系，所述无水乙醇的体积终浓度为0.2~0.8%。
3.如权利要求1所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述生物催化剂的质量用量以含湿菌体重量计为35g/L转化体系，所述底物的初始浓度为60mg/L转化体系，所述无水乙醇的体积终浓度为0.6%。
4.如权利要求2所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述转化反应时间为I~3天。
5.如权利要求2所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述生物催化剂的制备方法为: (1)菌种活化培养:将雅致小克银汉霉ATCC9245接种到马铃薯琼脂培养基，25~32°C培养2~4天，获得雅致小克银汉霉ATCC9245的孢子； (2)种子扩大培养:从步骤(1)经活化培养的平板上用棉签蘸取孢子转接到马铃薯液体培养基，于25~32°C、150~300r/min振荡培养2~3天，获得种子液； (3)菌体发酵培养:将步骤(2)制备的种子液以体积浓度I~5%的接种量接种于马铃薯液体培养基中，于25~32°C、150~300r/min振荡培养2~4天，获得含菌发酵液，将发酵液离心,去上清,收集沉淀即为湿菌体,将湿菌体悬浮于PH6.8的磷酸缓冲液制成含菌体悬液。
6.如权利要求2所述微生物转化法制备螺内酯衍生物的方法，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为:将反应液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯连续萃取2~3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏除去乙酸乙酯后用无水甲醇溶解并过滤，滤液进行MCI柱色谱分离，以体积浓度30~70%的乙醇水溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，收集体积浓度70%洗脱液的流出液，流出液减压浓缩去除洗脱液，即可得到含12 β -羟基-螺内酯和2 α -羟基-螺内酯的混合液；将混合液进行HPLC分离，以体积比1:1的甲醇和水混合溶液作为流动相，流速lmL/min，检测波长240nm，分别收集含目标组分的流出液，将流出液分别减压浓缩后真空干燥，分别获得12 β -羟基-螺内酯和2 α -羟基-螺内酯。
7.一种权利要求1 所述式(I )所示12 β -羟基-螺内酯或式(II)所示2 α -羟基-螺内酯在制备利尿药物中的应用。
【文档编号】C12P33/20GK103910776SQ201410106863
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】梅建凤, 占纪勋, 王罗医, 王思渊, 张书伟 申请人:浙江工业大学