专利名称：一种微生物转化制备(3s)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2r)-丁醇的方法
技术领域：
本发明涉及微生物转化方法领域，具体涉及一种生物催化制备(3S)-3-(叔丁氧擬基)氨基_1_氯_4_苯基-(2R) - 丁醇的方法。
背景技术：
(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基_(2R)_ 丁醇，英文名((3S)-3-(tert-Butoxycarbonyl)amino-l-chloro-4-phenyl-(2R)-butanol), CAS 号162536-40-5，分子式 C15H22NClO3，分子量 299. 79。(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基 _1_ 氯 _4_ 苯基-(2R)- 丁醇是制备抗艾滋病药物阿扎那韦的关键中间体。阿扎那韦是一新型氮杂肽类蛋白酶抑制剂(PD，是根据酶-氮杂肽复合物的X射线衍射研究设计而成的，具有C-2对称的化学结构。它是HIV-I蛋白酶的高选择性和高效的抑制剂,通过阻断病毒gap和gap-pol前体多聚蛋白的裂解，从而抑制病毒结构蛋白、逆转录酶、整合酶和蛋白酶的生成，使HIV-I感染的细胞释放出非感染性的不成熟的病毒颗粒。本品对多株HIV-I病毒具有比其他PI更强的抑制活性，在体外培养基中半数有效浓度(EC50)为2. 6 5. 3 nmol/L，90%有效浓度(EC90)为 9 15 nmol/L。拆分外消旋体(3S)-3_(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-丁醇，可以获得(3S) -3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇，但是拆分效率最大只有50%，生产效率不闻。以(3S)-3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮为底物米用化学法和微生物法不对称还原底物中的羰基均可以得到(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。而化学法不对称还原需要制备手性化学催化剂，价格昂贵，制备过程繁琐，且通常环境污染较大。
发明内容
本发明目的是提供一种微生物转化制备(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇的方法，该方法反应条件温和，操作简便，环境友好，产物转化率高，易于工业化生产。
本发明采用的技术方案是
一种微生物转化制备(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法，所述方法是以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，以酿酒酵母{Saccharomyces cere vi si ae )CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)- 丁醇。所述酿酒酵母CGMCC No. 2266，已在先前授权专利200810059686中作为新菌株予以保护，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No. 2266，保藏日期2007年11月26日。所述酿酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。进一步地，本发明所述的微生物转化制备(3S)-3_(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)- 丁醇的方法为以pH 5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液为反应溶剂，以(3S) -3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2- 丁酮为底物、以酿酒酵母cerevisiae) CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25 45°C下转化反应12 72小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇。所述的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2- 丁酮在磷酸盐缓冲液中的初始终浓度为0. ri mmol/L。进一步地，本发明所述的反应体系中还可以添加有终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物。微生物细胞中含有大量的乙醇脱氢酶，乙醇脱氢酶转化乙醇生成乙醛，同时将氢传递给烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态(还原型辅酶I，NADH),乙醇的加入有利于实现辅酶NADH的原位再生，为反应过程提供大量的供氢体，从而 提高反应的转化率。同时，乙醇的加入可以适当增强细胞的通透性，促使更多的底物进入微生物细胞内进行生物转化，提高转化率。所述的含酶菌体细胞用量以细胞干重计为f 20 g/g底物，这里所述的底物的量即(3S) -3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2- 丁酮的质量。所述含酶菌体细胞干重是指将发酵液离心分离，弃去上清液，将所得湿细胞在120°C烘干48小时至恒重后，所得干细胞的重量。定量细胞干重所需的所述含酶菌体细胞发酵液用量的确定方法是取部分发酵液中离心分离，弃去上清液，将湿细胞在120 °C烘干48小时至恒重，测定所得细胞干重，计算出单位含酶菌体细胞发酵液中干细胞比率，再以这个比率计算定量细胞干重所需含有含酶菌体细胞发酵液用量。所述的含酶菌体细胞按照以下方法制备将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培养基中，摇床转速为15(T200 r/min, 26^35 °C下培养18 30 h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞。进一步地，(3S)_3_(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇纯品的获得方法如下反应结束后，将转化液4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。本发明所述的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基_(2R)_ 丁醇制备方法推荐按照以下步骤进行
(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266接种到斜面培养基，26 35 °C培养4 6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为麦芽汁5 15 g/L，酵母粉2 4 g/L，蛋白胨4飞g/L，葡萄糖7 12 g/L，琼脂15 25 g/L，自然pH值，溶剂为水；
(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，摇床转速为15(T200r/min，26 35°C培养18 26 h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖26 32 g/L,酵母粉 2 4 g/L，硫酸铵 3 6 g/L，无水 MgSO4 0. 2 0. 4 g/L，K2HPO4 3H20 0. 5 I. 5 g/L,KH2PO4 0. 6 I. 5 g/L,用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积分数1(T20%的接种量接种于发酵培养基中，摇床转速为15(T200 !■/1^11，26 351培养18 30 h，将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖26 32 g/L，酵母粉2 4 g/L，硫酸铵3飞g/L，无水MgSO40. 2 0. 4 g/L, K2HPO4 *3H20 0. 5 I. 5 g/L，KH2PO4 0. 6 I. 5 g/L，用 NaOH 或 HCl 溶液调整液体培养基的PH值为7. 0，溶剂为水；
(4)生物转化在pH5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液中，添加终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物，加入终浓度为0.1 I mmol/L的(3S)-3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮，以及相当于细胞干重质量为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮广20倍的含酶菌体细胞，25 45 °C下转化反应12 72小时，得转化液；
(5)反应结束后获得(3S)_3_(叔丁氧擬基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇纯品的方法如下反应结束后，将转化液于4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水 硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇。本发明所述的(3S)-3_(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基_(2R)_ 丁醇的对映体过剩值(ee%)及底物转化率的确定反应进行过程中，每间隔f 11 h取样5 mL，样品4000 r/min离心20分钟，弃去沉淀，将上清液用5 mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯萃取液5 U L打入液相色谱进行分析。液相色谱型号为安捷伦1200，色谱柱为手性柱CHIRACEL OD-H(4. 6 mmX250 mm, 5 um)，缓冲液成分为正己烷-叔丁基甲基甲醚-三氟 乙酸(800:200:2)，流动相由上述缓冲液和乙醇按照体积比99:1进行配制，流动相流速为0.5 mL/min，进样量为5 ul。在该分析条件下能够将底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮、(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇和(3S) -3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2S) - 丁醇完全分开，从而进一步计算出底物的摩尔转化率和产物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的对映体过剩值。制得的(3S) _3_ (叔丁氧擬基)氨基-I-氯_4_苯基-(2R) - 丁醇纯品可用液相色谱一质谱联用仪检测，确定产物的纯度和分子量。本发明中采用微生物细胞不对称还原(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基_2_ 丁酮制备(3S)-3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇,可以获得闻对映体过剩值的产品，添加5 20%的乙醇作为辅助底物有利于提高底物的摩尔转化率。本发明米用微生物转化法制备(3S) -3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇，与化学合成法、酶催化法相比具有以下优点(I)生产菌株安全无毒，微生物菌体易于大规模培养，可以获得大量的生物催化剂，比化学催化剂和催化酶成本低廉；
(2)反应条件温和，环境友好，摩尔转化率高，易于实现大规模工业化生产，是工业化生产
(3S)-3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇的绿色工艺。具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的范围并不仅限于此。斜面培养基配制麦芽汁10 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，琼脂20 g/L，自然pH值，溶剂为水；121 °C灭菌20 min，灭菌后冷却制成斜面。
种子和发酵培养基配制葡萄糖30 g/L,酵母粉3 g/L,硫酸铵5 g/L,无水MgSO4
0.25 g/L, K2HPO4 3H20 I g/L, KH2PO4 I g/L，溶剂为水，用 NaOH 或 HCl 溶液调整液体培养基的pH值为7.0，121 °C灭菌20 min。实施例I
将酿酒酵母CGMCC No. 2266菌种接种至斜面培养基，30 °C培养6天制得菌体斜面。用接种针从菌体斜面取一接种环菌体接种在含有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，于300C ,180 r/min的条件下培养24 h获得种子液。将IOmL种子液(接种量用量为液体培养基体积10%)接种于含有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，于30°C、180 r/min的条件下培养24 h获得发酵液，发酵液离心，得含酶菌体细胞。
经测定，本实施例的每升发酵液中含有含酶菌体细胞的干重为50克。在十份含有100 mL PH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述所得发酵液200 mL，其中含有含酶菌体细胞的干重为10 g，分别加入(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮，使(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮的终浓度分别为 0. I mmol/L、0. 2 mmol /1,.0. 3 mmol /1,.0. 4 mmol /1,.0. 5 mmol /1,.0. 6 mmol /1,.0. 7mmol/1,.0. 8 mmol/1,.0. 9 mmol/L、1.0 mmol/L,均置于 30 °C, 180 r/min 的摇床中反应 36h。反应结束后将转化液于4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水分，抽滤，滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇，底物初始浓度对摩尔转化率及(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)- 丁醇的对应体过剩值(ee%)的影响见表I。表I底物初始浓度对转化率及(3S)_3_(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇对映体过剩值的影响
权利要求
1.一种微生物转化制备(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法，其特征在于，所述方法是以(3S)-3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，以酿酒酵母cerevisiae)CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基_(2R)_ 丁醇。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述的方法为以pH5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液为反应溶剂，以(3S)_3_(叔丁氧擬基)氨基_1-氯-4-苯基-2- 丁酮为底物、以酿酒酵母焊Ce1S cerevisiae) CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25 45 °C下转化反应12 72小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(3S) -3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇。
3.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述底物在反应体系中的初始终浓度为 0. I I mmol/L0
4.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中还可以添加有终浓度为5 20%的乙醇。
5.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述的含酶菌体细胞用量以细胞干重计为no g/g底物。
6.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述的含酶菌体细胞按照以下方法制备将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培养基中，摇床转速为150 200 r/min, 26^35°C下培养If 30 h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R)-丁醇分离纯化方法如下反应结束后，将转化液4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S) -3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇。
8.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述的方法按照以下步骤进行 (1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266接种到斜面培养基，26 35 °C培养4 6天得菌体斜面； (2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，摇床转速为15(T200r/min，26 35°C培养18 26 h得种子液； (3)发酵培养取种子液，以体积分数1(T20%的接种量接种于发酵培养基中，摇床转速为15(T200 r/min，26 35°C培养18 30 h，将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞； (4)生物转化在pH5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液中，添加终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物，加入终浓度为0. I I mmol/L的(3S)-3-(叔丁氧擬基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，以及相当于细胞干重质量为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮广20倍的含酶菌体细胞，25 45 °C下转化反应12 72小时，反应结束制得转化液； (5)分离纯化转化反应结束后,将转化液于4000r/min离心20分钟,弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行 (1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266接种到斜面培养基，26 35°C培养4 6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为麦芽汁5 15 g/L，酵母粉2 4 g/L，蛋白胨4飞g/L，葡萄糖7 12 g/L，琼脂15 25 g/L，自然pH值，溶剂为水； (2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26 35°C，摇床转速为150^200 r/min，培养18 26 h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4 g/L，硫酸铵 3 6 g/L，无水 MgSO4 0. 2 0. 4 g/L, K2HPO4 3H20 0. 5 I. 5 g/L，KH2PO4 0. 6 I. 5 g/L,用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水； (3)发酵培养取种子液，以体积分数为1(T20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26 35 °C，摇床转速为15(T200 r/min，培养18 30 h得到含有含酶菌体细胞的发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖26 32 g/L，酵母粉 2 4 g/L，硫酸铵 3 6 g/L，无水 MgSO4 0. 2 0. 4 g/L, K2HPO4 3H20 0. 5 I. 5 g/L,KH2PO4 0. 6 I. 5 g/L,用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水； (4)生物转化在pH5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为0. fl mmol/L的(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2- 丁酮，添加终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物，以及以相当于细胞干重质量为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-2-丁酮f 20倍的含酶菌体细胞，于25 45 °C下转化反应12 72小时得转化液； (5)分离纯化反应结束后，将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-I-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇。
全文摘要
本发明提供了一种微生物转化制备(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物、以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应得到所述产物。本发明生产的菌株安全无毒，微生物菌体易于大规模培养，比化学催化剂和催化酶成本低廉；而且反应条件温和，环境友好，摩尔转化率高，易于实现大规模工业化生产，是工业化生产(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的绿色工艺。
文档编号C12P13/02GK102732579SQ201110081009
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者欧志敏, 沈文和, 车大庆 申请人:浙江九洲药业股份有限公司