专利名称：一种微生物转化制备(s)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物转化制备⑶-3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈的方法，特别涉及一种以酿酒酵母CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞再制备的固定化细胞颗粒为生物催化剂，以3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈为底物制备(S) -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈的方法。
背景技术：
(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈((S)-3-hydroxy-3-(2-thienyl) propanenitrile)，分子式C7H7NOS,分子量153。(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈是合成抗抑郁药物度洛西汀的关键手性中间体之一。度洛西汀是一种新型抗抑郁药，是人脑中两种重要的神经递质五羟色胺和去甲肾上腺素再摄取的双重抑制剂，能够有效地治疗抑郁的情绪症状和躯体症状。抑郁症是一种严重的身心疾患，在全球的患病率呈不断上升趋势。现有的抗抑郁药物对于治疗抑郁的情绪症状，如哭泣、悲伤等疗效比较显著，但对于治疗抑郁症躯体症状的治疗不是十分理想。度洛西汀的双通道作用机制使它在有效控制患者情绪症状的同时，还能有效缓解由抑郁引起的躯体疼痛症状。弥补了当前主流抗抑郁药在躯体疼痛症状治疗方面的不足，是一种作用全面的新型抗抑郁药物。文献报道中(S)-3_羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈可以通过脂肪酶拆分外消旋体 3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈来获得。例如，2006年美国专利US7045341中Kamal等人采用脂肪酶催化转酯化拆分3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈合成(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈，固定化pseudomonas cepacia脂肪酶500mg在溶剂异丙醚IOOmL中拆分5mmoL 外消旋3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈，酰基供体乙酸乙烯酯25mmoL，温度25°C，时间14h， 产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈产率为42%，光学纯度大于99% ee。该过程底物外消旋体3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈的理论最高拆分效率只有50 %，反应过程中产生的副产物为分离提取带来困难，因此外消旋体拆分法制备( -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈不是理想的工业化过程。而采用不对称还原3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈理论上可以将底物100%地转化为产物，没有副产物的生成，因此羰基不对称还原过程是制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈的理想途径。采用化学法和生物法都可以实现3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的不对称还原。采用化学法进行羰基不对称还原反应需要化学催化剂，这类具有手性不对称还原能力的化学催化剂制备过程中均需要价格昂贵的金属，催化剂的制备过程价格昂贵而繁琐， 催化剂的制备成为了制约生产成本的关键因素。生物法包括酶法和微生物法两种。酶法中所需要的不对称还原酶要经过分离提取纯化等工艺过程，较为繁琐和麻烦，不对称还原酶应用于还原反应过程时要添加价格昂贵的辅酶NAD(P)H,因此酶法不对称还原制备-3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈成本较高。采用微生物法不对称还原3-羰基-3- (2-噻吩基)_丙腈是利用微生物产生的不对称还原酶还原3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈，微生物容易实现大规模培养，成本较低，环境友好，生产效率高，理论上可以将底物100%地转化为(S) -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈，没有副产物生成，微生物法不对称还原3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈是制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈的较佳途径。在微生物催化的不对称还原反应过程中，底物3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈和产物(S) -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈均为水不溶性化合物，微生物细胞在水相中转化3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的过程存在着物质在相界面传递的阻力，同时有机底物会对微生物细胞存在一定的毒害而降低反应速率。微生物细胞在生物相容性较好的有机溶剂中同样具有较高的生物活性，因此选用合适的生物相容性的有机溶剂做为反应介质，可以提高催化效率，简化分离提取工艺。采用固定化微生物细胞应用于有机介质中催化羰基不对称还原反应有利于实现反应过程的连续化，有利于实现产物的后续分离提取，有利于实现微生物细胞的重复利用，是实现工业化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈的一种新方法。
发明内容
本发明目的是提供一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈的方法，该方法环境友好、反应条件温和；微生物易于大规模培养，成本低廉，生产菌株安全无毒，提高了生物转化的生产效率。本发明采用的技术方案是一种微生物转化制备(S)-3_羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈的方法，所述方法是以 3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No. 2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，进行转化反应制得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩
基)_丙月青。进一步，所述的⑶-3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈的制备方法为以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No. 2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于20 40°C转化反应8 72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈。所述的3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈的初始浓度为0.01 3mol/L，优选为 0. 01 lmol/L，更优选 0. 2mol/L。本发明所述的生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯含有的菌体干重相当于以包埋法将0. 330L菌体浓度为3. 0 10. Og/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中20 40°C增殖培养16 72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重； 所述发酵液中菌体浓度定义为单位体积发酵液中所含有的菌体的干重。所述的生物催化剂按以下方法制备将经酿酒酵母菌株CGMCCNo. 2266发酵培养获得的发酵液与等体积质量浓度1 5%的海藻酸钠水溶液混合，搅拌均勻，得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为2. 5 4. 0%的氯化钙水溶液中，连续搅拌，获得固定化悬浮液，将悬浮液于35 38°C下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中20 40°C增殖培养16 7 获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂，所述的发酵液中菌体浓度为2. 0 25. Og/L ；所述氯化钙水溶液的体积用量以能使固定化细胞颗粒悬浮为宜，一般推荐每10 400mL含有菌体的海藻酸钠混合溶液中氯化钙水溶液的体积用量为100 IOOOmL ；所述的用于固定化细胞颗粒增殖培养的发酵培养基的用量以使固定化细胞颗粒悬浮为宜，发酵培养基的体积用量一般推荐为每10 300g固定化细胞颗粒加入100 IOOOmL发酵培养基。所述的固定化细胞颗粒的直径为1 5mm，优选为2mm，增殖培养后的固定化细胞
颗粒的直径基本没有变化。微生物在固定化细胞颗粒中的增殖培养不会导致固定化细胞颗粒的大小发生太大变化，本发明所述增殖培养后的固定化细胞颗粒大小与增殖培养前固定化细胞颗粒大小相比，变化不大，对本发明结果没有影响。进一步，所述的生物催化剂具体按照如下方法获得将发酵液与等体积2%的海藻酸钠水溶液混合，所述的发酵液菌体浓度为4. 3g/L，搅拌均勻得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3. 5%的氯化钙水溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，获得固定化悬浮液，将固定化悬浮液在37°C条件下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中30°C进行增殖培养Mh，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂。所述的反应结束后，从生物转化体系中获得(S) -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈纯品的方法为反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯得到混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比 10 1，先采用体积比为80 20石油醚和丙酮的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液， 再用体积比70 30石油醚和丙酮的混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，即可获得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用体积比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脱硅胶层析柱回收利用。所述的发酵液按照以下步骤制备(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266菌体接种到斜面培养基，沈 35°C培养 4 6天，得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成麦芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白胨0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，琼脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26 35°C， 150 200r/min，摇床培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸铵 0. 3 0. 6g/L，无水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中， 26 35°C，150 200r/min，摇床培养18 30h得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖2. 6 3. 2g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，硫酸铵0. 3 0. 6g/L，无水MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L, KH2PO4O. 06 0. 15g/L,自然 pH 值，溶剂为水。所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈的制备方法推荐按照以下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266菌体接种到斜面培养基，沈 35°C培养 4 6天，得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成麦芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白胨0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，琼脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26 35°C， 150 200r/min，摇床培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸铵 0. 3 0. 6g/L，无水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中， 26 35°C，150 200r/min，摇床培养18 30h得到发酵液；所述发酵液菌体浓度为3 10g/L ；所述的发酵培养基与步骤( 所述的种子培养基相同；(4)细胞固定化将步骤C3)制备的发酵液与等体积2%的海藻酸钠水溶液相混合，搅拌均勻得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3. 5%的氯化钙水溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化细胞颗粒，获得固定化悬浮液，将固定化悬浮液在37°C条件下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中30°C进行增殖培养Mh，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂；(5)生物转化以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈为底物，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于30°C、 180r/min条件下转化反应72小时，转化液经分离纯化得到(S) -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈；在邻苯二甲酸二丁酯中底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈的初始浓度为0.01 lmol/L，所述的生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯含有的菌体干重相当于以包埋法将 0. 330L菌体浓度为4. 3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中20 40°C增殖培养M 72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述的转化过程中，间隔1 IOh取出ImL转化液作为样品，将样品经有机滤膜过滤后采用高效液相色谱进行检测，流动相为正己烷/异丙醇(90/10)，在紫外254nm处检测样品中产物(S)_3_羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的产量及对映体过剩值(ee%)；所述的转化液样品中含有邻苯二甲酸二丁酯、底物3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈和产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈；(6)分离纯化反应结束后，从生物转化体系中获得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈纯品的方法为反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯得到混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比10 1，先采用体积比为80 20石油醚和丙酮的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用体积比70 30石油醚和丙酮的混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，即可获得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用体积比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脱硅胶层析柱回收利用。本发明所述发酵液菌体浓度根据发酵液中菌落数计算，当发酵液中菌落数为 2 X IO11个/mL时，发酵液的菌体浓度为4. 3g/L ；所述含酶菌体发酵液菌体干重的测定是将发酵液离心分离后，弃去上清液，将湿细胞在120°C烘干48小时至恒重，测定干细胞的重量；取部分发酵液中离心所得湿细胞测定细胞干重，计算出发酵液中单位含酶菌体细胞中干菌体比率，再以这个比率计算定量菌
8体干重所需含有含酶菌体细胞发酵液用量。酿酒酵母CGMCC No. 2266，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No. 2266，保藏日期2007年11月洸日。菌株来源本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCC No. 2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈，得到酿酒酵母CGMCC No. 2266具有良好的转化3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈生产(S) -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈的能力。所述酿酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均勻的菌落形态。本发明采用固定化细胞颗粒作为催化剂，将3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈还原为 (S) -3-羟基-3- (2-噻吩基)-丙腈的生物转化机理如下
权利要求
1.一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的方法，其特征在于所述方法是以3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈为底物，以酿酒酵母菌株CGMCCNo. 2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，进行转化反应制得(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)_丙腈。
2.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的方法为以3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No. 2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于20 40°C转化反应8 72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈。
3.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的初始浓度为0. 01 3mol/L。
4.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯含有的菌体干重相当于以包埋法将0. 330L菌体浓度为3. 0 10. Og/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中20 40°C增殖培养16 72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为单位体积发酵液中所含有的菌体的干重。
5.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的生物催化剂按以下方法制备将经酿酒酵母菌株CGMCC No. 2266发酵培养获得的发酵液与等体积质量浓度1 5%的海藻酸钠水溶液混合，搅拌均勻，得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为2. 5 4. 0%的氯化钙水溶液中，连续搅拌，获得固定化悬浮液，将悬浮液于35 38°C下固化，获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中20 40°C增殖培养16 72h，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂，所述的发酵液中菌体浓度为2. 0 25. Og/L。
6.如权利要求5所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的固定化细胞颗粒的直径为1 5mm。
7.如权利要求5所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的生物催化剂具体按照如下方法获得将发酵液与等体积2%的海藻酸钠水溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4. 3g/L，搅拌均勻得到含有菌体的海藻酸钠混合液，将含有菌体的海藻酸钠混合液逐滴滴入质量浓度为3. 5%的氯化钙水溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液在37°C条件下固化， 获得固定化细胞颗粒，所述的固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中 30°C进行增殖培养Mh，过滤，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂。
8.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的分离纯化方法为反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯得到混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比10 1，先采用体积比为80 20石油醚和丙酮的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用70 30石油醚和丙酮的混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，即可获得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用体积比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脱硅胶层析柱回收利用。
9.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的发酵液按照以下步骤制备(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266菌体接种到斜面培养基J6 35°C培养 4 6天，得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成麦芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白胨0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，琼脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26 35°C，150 200r/min，摇床培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸铵 0. 3 0. 6g/L，无水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中，26 35°C，150 200r/min，摇床培养18 30h得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸铵 0. 3 0. 6g/L，无水 MgSO4O. 02 0. 04g/ L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L, KH2PO4O. 06 0. 15g/L,自然 pH 值，溶剂为水。
10.如权利要求1所述的(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的制备方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266菌体接种到斜面培养基，26 35°C培养 4 6天，得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成麦芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白胨0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，琼脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26 35°C，150 200r/min，摇床培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸铵 0. 3 0. 6g/L，无水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中，26 35°C，150 200r/min，摇床培养18 30h得到发酵液；所述发酵液菌体浓度为3 IOg/ L ；所述的发酵培养基组成与步骤( 所述的种子培养基组成相同；(4)细胞固定化将步骤C3)所制备的发酵液与等体积2%的海藻酸钠水溶液相混合， 搅拌均勻得到含有菌体的海藻酸钠的混合液，将含有菌体的海藻酸钠的混合液逐滴滴入质量浓度为3. 5%的氯化钙水溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化细胞颗粒，将得到的固定化悬浮液在37°C条件下固化，获得固定化细胞颗粒，所述固定化细胞颗粒用无菌生理盐水洗涤后分散于发酵培养基中30°C进行增殖培养Mh，过滤， 获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂；(5)生物转化以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈为底物，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于3(TC、180r/min条件下转化反应72小时，转化液经分离纯化得到(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈；所述的 3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的初始浓度为0. 01 0. lmol/L，所述生物转化体系中每升邻苯二甲酸二丁酯含有的菌体干重相当于以包埋法将0. 330L菌体浓度为4. 3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中20 40°C增殖培养M 72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；(6)分离纯化反应结束后，将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，将滤液旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯得到混合物，将混合物采用硅胶柱层析分离，硅胶型号100目，柱床高径比10 1，先采用体积比为80 20石油醚和丙酮的混合液洗脱至无杂质峰出现弃去洗脱液，再用70 30石油醚和丙酮的混合液洗脱至无目标产物吸收峰出现为止，收集洗脱液，干燥，即可获得产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用体积比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脱硅胶层析柱回收利用。
全文摘要
本发明公开了一种微生物转化制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈的方法，所述方法为以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞再制备的固定化细胞颗粒为生物催化剂，以邻苯二甲酸二丁酯为溶剂组成生物转化体系，于20～40℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈；本发明采用微生物转化法制备(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)-丙腈，反应条件温和、环境友好；微生物易于大规模培养，成本低廉；生产菌株安全无毒；产物易提取；易于实现大规模工业化生产；底物的转化量和生产效率较高。
文档编号C12R1/865GK102199637SQ20111006616
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者刘拥, 南颖康, 李仁玮, 欧志敏, 沈文和 申请人:浙江工业大学