专利名称：一种微生物转化制备(s)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，特别涉及一种以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266为生物催化剂，以乙酰乙酸叔丁酯为底物制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法。
背景技术：
(S) - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯((S) - (+) -t-Butyl-3-Hydroxybutyrate)，CAS 登录号82578-45-8，分子式C8H16O3，分子量160.21。(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯可以用于合成厚壳桂二乙酯(cryptocarya diacetate)。厚壳桂二乙酯是从南美植物Cryptocarya Iatifolia的叶和皮中分离提取的小分子化合物。Cryptocarya Iatifolia具有神奇的药用功效，可以用于治疗头痛、孕妇晨吐，抗肿瘤，抗肺炎、抗真菌和细菌等功效。拆分外消旋体3-羟基丁酸叔丁酯，可以获得(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯，但是拆分效率最大只有50%，生产效率不高。以乙酰乙酸叔丁酯为底物采用化学法和微生物法不对称还原底物中的羰基均可以得到(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。化学法不对称还原需要制备手性化学催化剂，价格昂贵，制备过程繁琐。采用微生物法不对称还原乙酰乙酸叔丁酯可以获得对映体过剩值较高的光学纯( - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯，反应条件温和，环境友好，成本低廉，易于实现辅酶的原位再生，微生物易于大规模培养，易于工业化生产，是 (S) - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯的绿色合成工艺。
发明内容
本发明目的是提供一种微生物转化制备(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯的方法，该方法反应条件温和，操作简便，环境友好，产物转化率高，易于工业化生产。本发明采用的技术方案是一种微生物转化制备(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸叔丁酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述( - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯。进一步，本发明所述的微生物转化制备(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯的方法为 反应体系以PH 5. O 8. O的磷酸盐缓冲液为反应溶剂，以乙酰乙酸叔丁酯为底物、以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述 (S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。所述的乙酰乙酸叔丁酯在磷酸盐缓冲液中的初始终浓度为1 lOOmmol/L。进一步，本发明所述的反应体系中还添加有终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物，有利于提高底物的摩尔转化率。所述的含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1 20g/g乙酰乙酸叔丁酯，这里所述的底物的量即乙酰乙酸叔丁酯的质量；所述含酶菌体细胞干重的测定是将发酵液离心分离后，弃去上清液，将湿细胞在120°C烘干48小时至恒重，测定干细胞的重量；取部分发酵液中离心所得湿细胞测定细胞干重，计算出发酵液中单位含酶菌体细胞中干细胞比率，再以这个比率计算定量细胞干重所需含有含酶菌体细胞发酵液用量。所述的含酶菌体细胞按照以下方法制备将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培养基中，摇床转速为150 200r/minJ6 35°C下培养18 30h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞。所述的反应结束后，获得(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯纯品的方法如下反应结束后，将转化液4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。进一步，本发明所述的微生物转化制备(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯的方法按照以下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基，26 35°C培养4 6天得菌体斜面；( 种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，摇床转速为150 200r/minJ6 35°C培养18 2 得种子液；(3)发酵培养取种子液， 以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中，摇床转速为150 200r/min，26 35°C培养18 30h，将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞；(4)生物转化在pH 5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中，添加终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物，加入终浓度为1 lOOmmol/L的乙酰乙酸叔丁酯为底物，以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1 20 倍的含酶菌体细胞，25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束制得转化液；(5)分离纯化转化反应结束后，将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。更进一步，本发明所述的(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯制备方法推荐按照以下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基，沈 35°C培养4 6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为麦芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，琼脂15 25g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，摇床转速为150 200r/min,26 35°C培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖 26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中， 摇床转速为150 200r/minJ6 35°C培养18 30h，将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸铵3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L, K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用 NaOH 或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(4)生物转化在pH 5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为1 20mmol/L 的乙酰乙酸叔丁酯为底物，添加终浓度为5 15%的乙醇作为辅助底物，以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1 20倍的含酶菌体细胞，25 45°C下转化反应8 40小时， 得转化液；(5)反应结束后获得(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯纯品的方法如下反应结束后， 将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。本发明所述的(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯的对映体过剩值(ee% )及底物转化率的确定反应进行过程中，每间隔1 Ilh取样5mL，样品4000r/min离心20分钟，弃去沉淀，将上清液用5mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯萃取液IyL打入气相色谱进行分析。 气相色谱型号为安捷伦7820A，色谱柱为Varian CP Chirasil-DEX手性柱，进样口温度为 250°C，柱温为80°C，检测口温度为250°C，载气为氮气，载气流量为lmL/min，在该分析条件下能够将底物乙酰乙酸叔丁酯、(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯和(R)-(-)-3-羟基丁酸叔丁酯完全分开，从而进一步计算出底物的摩尔转化率和产物(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯的对映体过剩值。酿酒酵母CGMCC No. 2266，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No. 2266，保藏日期2007年11月沈日，已在先前授权专利200810059686中作为新菌株予以保护。菌株来源本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCC No. 2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化乙酰乙酸叔丁酯，得到酿酒酵母CGMCC No. 2266具有良好的转化乙酰乙酸叔丁酯生产(S) - (+)-3-羟基丁酸叔丁酯的能力。所述酿酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均勻的菌落形态。所述的( - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯纯品可用气相色谱-质谱联用仪检测，确定产物的纯度和分子量。本发明中采用微生物细胞不对称还原乙酰乙酸叔丁酯制备( - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯，可以获得高对映体过剩值的产品，添加5 20%的乙醇作为辅助底物有利于提高底物的摩尔转化率。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在本发明采用的微生物转化法制备 (S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯与化学合成法、酶催化法相比具有以下优点(1)生产菌株安全无毒，微生物菌体易于大规模培养，可以获得大量的生物催化剂，比化学催化剂成本低廉；(2)反应条件温和，环境友好；(3)操作简便，反应过程中不需要添加价格昂贵的辅酶; (4)易于实现大规模工业化生产，摩尔转化率高，是(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的绿色合成工艺。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此斜面培养基配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子和发酵培养基配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水 MgSO4O. 25g/L，K2HPO4 · 3H201g/L, KH2PO4lg/L，溶剂为水，用 NaOH 或 HCl 溶液调整液体培养基的PH值为7. 0，121°C灭菌20min。实施例1将酿酒酵母CGMCC No. 2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养6天制得菌体斜面。 用接种针从菌体斜面取一接种环菌体接种在含有IOOmL液体培养基的250mL三角瓶中，于 30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子液。将IOmL种子液(接种量为液体培养基体积用量10% )接种于含有IOOmL液体培养基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，发酵液离心，得含酶菌体细胞。菌体干重的测定是将发酵液离心后从湿细胞中取小部份在120°C烘干48小时至恒重，测定干细胞的重量，计算出发酵液中单位含酶菌体细胞中干细胞比率，再以这个比率计算定量细胞干重所需含有含酶菌体细胞发酵液用量。本实施例的每升发酵液中含有含酶菌体细胞的干重为50克。在七份含有IOOmL pH7. 0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得200mL发酵液离心后获得的湿细胞，其中含有含酶菌体细胞的干重为10g，分别加入乙酰乙酸叔丁酯，使乙酰乙酸叔丁酯的终浓度分别为 lmmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/ L、1 OOmmo 1/L,均置于30°C，180r/min的摇床中反应36h。反应结束后将转化液于4000r/min 离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水分，抽滤，滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯，底物初始浓度对摩尔转化率及(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的对应体过剩值(ee% )的影响见表1。表1底物初始浓度对转化率及( - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯对映体过剩值的影响
底物浓度(mmol/L )转化率(％)(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的对映体过剩值(ee % )1100100101001002086.21004075.61006062.11008050.510010038.2100表1可以看出随着底物浓度的提高转化率逐渐降低。当底物浓度为lOmmol/L 时转化率为100%。底物浓度对产物(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的对映体过剩值没有影响，在实验的底物浓度范围内产物(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的对映体过剩值始终保持 100%。实施例2将酿酒酵母CGMCC No. 2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养6天得菌体斜面。用接种针从菌体斜面取一接种环菌体接种在含有IOOmL液体培养基的250mL三角瓶中，于 30°CU80r/min的条件下培养24h获得种子液。将IOmL种子液(以10%的接种量)接种于含有IOOmL液体培养基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，发酵液离心，得含酶菌体细胞，每升发酵液中含有含酶菌体细胞的干重为50克。在七份含有IOOmL pH7. 0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得200mL发酵液离心后获得的湿细胞，其中含有含酶菌体细胞的干重为10g，分别加入乙酰乙酸叔丁酯使乙酰乙酸叔丁酯终浓度为20mmol/L，各自加入辅助底物乙醇使乙醇体积用量占反应体系的体积百分比(ν/ν)分别为 0%、5%、10%、15%、20%、25%和 30%，置于 30°C，180r/min 的摇床中反应36h，反应结束后将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水分，抽滤，将滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S) - (+) -3-羟基丁酸叔丁酯，辅助底物乙醇浓度对摩尔转化率及(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的对应体过剩值(ee%)的影响见表2。表2 添加乙醇对转化率及(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯对映体过剩值的影响
权利要求
1.一种微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸叔丁酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(S)-(+)_3-羟基丁酸叔丁酯。
2.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的方法为反应体系以PH 5. O 8. O的磷酸盐缓冲液为反应溶剂，以乙酰乙酸叔丁酯为底物、以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。
3.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的乙酰乙酸叔丁酯在反应体系中的初始终浓度为1 lOOmmol/L。
4.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的反应体系中还添加有终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物。
5.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1 20g/g乙酰乙酸叔丁酯。
6.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的含酶菌体细胞按照以下方法制备将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培养基中，摇床转速为150 200r/minJ6 35°C下培养18 30h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞。
7.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯分离纯化方法如下反应结束后，将转化液4000r/ min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯， 即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。
8.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266接种到斜面培养基，26 35°C培养4 6天得菌体斜面；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，摇床转速为150 200r/min，26 35°C培养18 2 得种子液；(3)发酵培养取种子液，以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中，摇床转速为150 200r/min,26 35°C培养18 30h，将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞；(4)生物转化在pH 5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中，添加终浓度为5 20%的乙醇作为辅助底物， 加入终浓度为1 lOOmmol/L的乙酰乙酸叔丁酯为底物，以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1 20倍的含酶菌体细胞，25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束制得转化液；(5)分离纯化转化反应结束后，将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。
9.如权利要求1所述微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基，26 35°C培养4 6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为麦芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨 4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，琼脂15 25g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，^5 35°C，摇床转速为 150 200r/min，培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖沈 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积分数为10 20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26 35°C，摇床转速为150 200r/min，培养18 30h得到含有含酶菌体细胞的发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖26 32g/ L,酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/ L，KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(4)生物转化在pH5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为1 20mmol/L的乙酰乙酸叔丁酯为底物，添加终浓度为5 15%的乙醇作为辅助底物，以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1 10倍的含酶菌体细胞，于25 45°C下转化反应8 40小时得转化液；(5)分离纯化反应结束后，将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(幻-(+)_3-羟基丁酸叔丁
全文摘要
本发明提供了一种微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法在pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，以乙酰乙酸叔丁酯为底物、以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25～45℃下转化反应8～40h，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯；本发明的有益效果主要体现在(1)生产菌株安全无毒，易于大规模培养；(2)可以获得大量的生物催化剂，成本低廉；(3)反应条件温和，环境友好；(4)操作简便，反应过程中不需要添加价格昂贵的辅酶，底物摩尔转化率高。
文档编号C12P7/62GK102199633SQ201110075348
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者刘拥, 南颖康, 李仁玮, 欧志敏, 陈庆美, 隋志红 申请人:浙江工业大学