专利名称：一种微生物转化制备s-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，特别涉及一种 以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266为生物催化剂、以3_酮基四氢呋 喃为底物制备(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃的新方法。
背景技术：
(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃((S) - (+)-3-Hydroxytetrahydrofuran)，CAS 登录号 86087-23-2，分子式C4H8O2，分子量88. 11。(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃是合成治疗艾滋病药 物安普那韦的一个重要的中间体。在二苯醚类除草剂农药中引入(S)-(+)-3-羟基四氢呋 喃基团后可以明显提高二苯醚类除草剂的除草活性和选择性。文献报道中(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃的合成可以通过二氢呋喃的不对称硼 氢化或氢硅化得到，需要手性催化剂，手性催化剂制备过程繁琐，价格昂贵；可以通过 4-氯-3-羰基丁酸酯的不对称氢化-还原-分子内醚化制备，该方法成本较高，不适于工业 化生产；可以通过3-羟基四氢呋喃消旋体的酶法拆分制备，酶法拆分的拆分效率最高只能 达到50%，生产效率较低；可以通过苹果酸的还原-分子内醚化合成，但此方法需要用昂贵 的氢化铝锂来还原苹果酸二酯，而且需要保护仲羟基以防止消旋。上述的制备方法多数情 况下产物的光学纯度不够，或者存在着分离提取困难等不利于工业化生产的因素。采用微生物转化法不对称还原3-酮基四氢呋喃可以获得对映体过剩值较高的光 学纯(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃，常温常压下即可实现转化，反应条件温和，环境友好，成本 低廉。微生物细胞中含有还原过程中需要的辅酶供氢体，同时微生物细胞中含有丰富的酶 系有利于通过在反应液中添加廉价的辅助底物(如蔗糖或葡萄糖)实现辅酶的原位再生， 大大提高底物的转化效率，理论上底物可以100%地转化为(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。微 生物易于大规模培养，易于工业化生产。因此，微生物转化法是制备(S)-(+)-3-羟基四氢 呋喃的绿色合成工艺。
发明内容
本发明目的是提供一种微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，该方法 催化效率高、反应条件温和、环境友好、成本低廉，易于工业化生产。本发明采用的技术方案是—种微生物转化制备S-(+)_3-羟基四氢呋喃的方法，所述方法是以3-酮基四氢 呋喃为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌 体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述S-(+)-3-羟基四氢呋喃。本发明所述方法在如下条件下进行在pH 5.0 8.0的磷酸盐缓冲液中，以3-酮 基四氢呋喃为底物，以酿酒酵母CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于 25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述S_(+)_3_羟 基四氢呋喃。
所述3-酮基四氢呋喃在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为1 lOmmol/L。所述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1 70g/g3_酮基四氢呋喃底物；所述含 酶菌体细胞干重的测定是将发酵液离心分离后，弃去上清液，将湿细胞在120°C烘干48小 时至恒重，测定干细胞的重量；取部分发酵液中离心所得湿细胞测定细胞干重，计算出发酵 液中单位含酶菌体细胞中干细胞比率，再以这个比率计算定量细胞干重所需含有含酶菌体 细胞发酵液用量。所述磷酸盐缓冲液中添加有终浓度为10 150g/L的葡萄糖作为辅助底物，有利 于提高底物的摩尔转化率。所述含酶菌体细胞按照以下方法制备将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培 养基中，摇床转速为150 200r/min，26 35°C培养18 30h，将发酵液离心，制得含酶菌 体细胞。本发明所述S-(+)_3-羟基四氢呋喃分离纯化方法如下反应结束后，将转化液 4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙 酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙 酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。所述的微生物转化制备S-(+)_3-羟基四氢呋喃的方法，推荐按照以下步骤进行 (1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基，^ 35°C培养4 6天得菌 体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为麦芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，琼脂15 25g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜 面取一接种环菌体转接到种子培养基，26 35°C，摇床转速为150 200r/min，培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖^5 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸 铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L, K2HPO4 · 3Η200· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L,用 NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；( 发酵培养取种子液，以体积 分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为沈 35°C，摇床转速为150 200r/min，培养18 30h，将发酵液离心，分离得到含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度 组成为葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸铵3 6g/L，无水MgSO4O. 2 0. 4g/L， K2HPO4 ·3Η20 0· 5 1. 5g/L，KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用 NaOH 或 HCl 溶液调整液体培养基的 pH 值为7.0，溶剂为水；(4)生物转化在pH 5.0 8.0的磷酸盐缓冲液中，加入1 lOmmol/L 的3-酮基四氢呋喃，添加10 150g/L的葡萄糖作为辅助底物，以及细胞干重质量为3-酮 基四氢呋喃1 50倍的含酶菌体细胞，于25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束制 得转化液；(5)分离纯化将转化液4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等 体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠 除去少量水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃。酿酒酵母CGMCC No. 2266，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保 藏中心，位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内，保藏号CGMCC No. 2266，保 藏日期2007年11月沈日，已在先前授权专利200810059686中作为新菌株予以保护。菌株来源本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCC No. 2266是从杭州西湖啤 酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化3-酮基四氢呋喃，得到酿 酒酵母CGMCC No. 2266具有良好的转化3-酮基四氢呋喃生产(S) - (+)-3-羟基四氢呋喃的能力。所述酿酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光 泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均勻的菌落形态。具体的，本发明用微生物转化制备S-(+)_3-羟基四氢呋喃的方法，按照以下步骤 进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基，沈 35°C培养4 6天得菌体斜面；所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/ L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，琼脂15 25g/L，自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌 20min，灭菌后冷却制成斜面；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，沈 35°C，摇床转 速为150 200r/min，培养18 沈1!得种子液；所述的种子培养基按如下组成配制葡萄糖 26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η200· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积比10 20%的接种量接种于发酵培养基中，培养 温度为26 35°C，摇床转速为150 200r/min，培养18 30h得到含有含酶菌体细胞的 发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基按如下组成配制葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(4)生物转化在pH 5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中，加入1 10mmol/L的3_酮 基四氢呋喃，添加10 150g/L的葡萄糖作为辅助底物有利于提高底物的摩尔转化率，以及 细胞干重质量为3-酮基四氢呋喃1 50倍的含酶菌体细胞，于25 45°C下进行转化反应 8 40小时；(5)分离纯化反应结束后将转化液4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将 上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入 无水硫酸钠除去少量水分，抽滤后，得到的乙酸乙酯溶液减压蒸馏除去乙酸乙酯即得所述 (S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。本发明(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃纯品可用气相色谱-质谱联用仪检测确定产物 的纯度和分子量。本发明摩尔转化率和产物(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃的对映体过剩值(ee% )的确 定采用气相色谱分析检测。色谱柱为Varian CP Chirasil-DEX手性柱。该手性柱 可以检测到(R)-(-)-3-羟基四氢呋喃和(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃两种对映体的含量，进 一步计算出反应的摩尔转化率和(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的对映体过剩值(ee% )。本发明中采用微生物细胞不对称还原3-酮基四氢呋喃制备( - (+) -3-羟基四氢 呋喃，可以获得高对映体过剩值的产品，添加终浓度为10 150g/L的葡萄糖作为辅助底 物，有利于提高底物的摩尔转化率。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在本发明采用的微生物转化法制备(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃与化学合成法、酶催 化法相比具有以下优点(1)生产菌株安全无毒，微生物菌体易于大规模培养，可以获得大量的生物催化剂，比化学催化剂成本低廉；(2)操作简便，反应过程中不需要添加价格昂贵 的辅酶，通过添加辅助底物葡萄糖可以大幅度提高底物的转化效率，收率高；C3)易于实现 大规模工业化生产；(4)常温常压下就能实现生物转化反应，反应条件温和，环境友好，是 (S) - (+) -3-羟基四氢呋喃的清洁合成工艺。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此斜面培养基的配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂 20g/L,自然pH值，溶剂为水；121°C灭菌20min，冷却后制成斜面。种子培养和发酵培养基的配制种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组 成配制葡萄糖 30g/L，酵母粉 3g/L，硫酸铵 5g/L，无水 MgSO4O. 25g/L，K2HPO4 · 3H20 lg/L， KH2P04lg/L，溶剂为水，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0，121°C灭菌20min。实施例1将CGMCC No. 2266菌种接种至斜面培养基，30°C培养4 6天得菌体斜面。用接种 针从菌体斜面上取一接种环菌体接种在含有IOOmL液体培养基的250mL三角瓶中，于30°C、 180r/min的条件下培养24h获得种子液。将IOmL种子液(接种量以培养基体积分数10% 计)接种于含有IOOmL液体培养基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养Mi 获得发酵液，将发酵液离心，得含酶菌体细胞。菌体干重的测定是将发酵液离心后从含酶菌体细胞的湿菌体中取小部份在120°C 烘干48小时至恒重，测定干细胞的重量，计算出发酵液中单位含酶菌体细胞中干细胞比 率，再以这个比率计算定量细胞干重所需含有含酶菌体细胞发酵液用量。本实施例的每升 发酵液中含有含酶菌体细胞的干重为50克。在10份含有IOOmL pH7. 0磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述所得200毫升 发酵液离心后获得的湿细胞，其中含有含酶菌体细胞的干重为10g，各自加入3-酮基四氢 呋喃，使3-酮基四氢呋喃的终浓度分别为lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、 6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L 和 10mmol/L，置于 30°C，180r/min 的摇床中反应 24h。 反应结束后，将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙 酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水 分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃，底物初始浓度 对S-(+)-3-羟基丁酸甲酯的摩尔转化率及对应体过剩值(ee%)的影响见表1。表1 底物初始浓度对转化率及(S)-(+)_3-羟基四氢呋喃的影响
权利要求
1.一种微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于所述方法是以 3-酮基四氢呋喃为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo. 2266发酵获 得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述S-(+)-3-羟基四氢呋喃。
1.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于 所述方法为在PH 5. O 8. O的磷酸盐缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，以酿酒酵母 CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25 45°C下转化反应8 40 小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述S-(+)-3-羟基四氢呋喃。
2.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于所 述3-酮基四氢呋喃在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为1 lOmmol/L。
3.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于所 述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1 70g/g底物。
4.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于所 述磷酸盐缓冲液中还添加有终浓度为10 150g/L的葡萄糖作为辅助底物。
5.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于所 述含酶菌体细胞按照以下方法制备将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培养基中，摇 床转速为150 200r/min，26 35°C培养18 30h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞。
6.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于 所述S- (+) -3-羟基四氢呋喃分离纯化方法如下反应结束后，将转化液4000r/min离心20 分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在 乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述 (S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
7.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于所 述方法按照以下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种到斜面培养基， ^ 35°C培养4 6天得菌体斜面；( 种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子 培养基，26 35°C，摇床转速为150 200r/min，培养18 2 得种子液；(3)发酵培养 取种子液，以体积分数10 20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为沈 35°C，摇 床转速为150 200r/min，培养18 30h，将发酵液离心，分离得到所述含酶菌体细胞；(4) 生物转化在PH 5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为1 lOmmol/L的3-酮基四 氢呋喃，再添加终浓度为10 150g/L的葡萄糖作为辅助底物，以及以细胞干重为3-酮基 四氢呋喃质量1 50倍的含酶菌体细胞，于25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束 制得转化液；(5)分离纯化将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液 用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫 酸钠除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
8.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于所 述方法按照以下步骤进行(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266接种到斜面培养基，26 35°C培养4 6天 得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为麦芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨 4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，琼脂15 25g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，沈 35°C，摇床转速为150 200r/min，培养18 2 得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖沈 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积比10 20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度 为26 35°C，摇床转速为150 200r/min，培养18 30h得到含有含酶菌体细胞的发酵 液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖沈 32g/L， 酵母粉 2 4g/L，硫酸铵 3 6g/L，无水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L， KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水；(4)生物转化在pH5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中，加入1 lOmmol/L的3-酮基四 氢呋喃，再添加终浓度10 150g/L的葡萄糖作为辅助底物，以及细胞干重为3-酮基四氢 呋喃1 50倍的含酶菌体细胞，于25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束制得转化 液；(5)分离纯化反应结束后将转化液4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液 用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫 酸钠除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
全文摘要
本发明公开了一种微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法在pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物、以酿酒酵母CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25～45℃下转化反应8～40小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述S-(+)-3-羟基四氢呋喃；本发明有益效果主要体现在(1)生产菌株安全无毒，易于大规模培养，成本低廉；(2)操作简便，反应过程中不需要添加价格昂贵的辅酶，收率高；(3)易于实现大规模工业化生产；(4)反应条件温和，环境友好。
文档编号C12P17/14GK102071231SQ20101056780
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者欧志敏, 沈文和, 陈庆美, 隋志红 申请人:浙江九洲药业股份有限公司, 浙江工业大学