专利名称：：一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法
技术领域：
：本发明涉及发酵
技术领域：
，具体涉及一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法。
背景技术：
：人参皂苷Rd对心血管，免疫系统，神经系统等具有良好的药理作用，有些药理作用是人参皂苷Rd独有而其他的单体皂苷没有的生物活性。人参皂苷Rd在人参中含量较低，只有0.2%左右，因其结构复杂，化学合成至今尚未成功，目前从人参、三七等植物根、茎、叶中提取来获得Rd单体，提取方法由于其收率低，成本较高，影响了医疗保健市场需求的进一步扩大，因此有必要开发一种产率高，纯度好，并且简单易行的制取人参皂苷Rd的方法。对比相对含量较高的人参皂苷Rbl，Rb2，Rc等主要皂苷，人参皂苷Rd的差别在于20位糖链末端的糖苷键(图l)。理论上可以通过这些糖基的水解得到人参皂苷Rd。目前有研究试图利用加热、酸水解法、碱水解法等化学方法将主要皂苷转化为活性更高的稀有皂苷。但是这些化学水解条件都十分剧烈，不易控制，而且在水解过程中能使皂苷元发生脱水、环合、差向异构、羟化等反应，产生较多副产物，很难得到目标产物。生物转化的区域和立体选择性强、反应条件温和，这就使得酶转化法和微生物转化法制备稀有人参皂苷受到青睐。从动物代谢来看，人参皂苷Rd可以由主要皂苷Rbl代谢而来，与其它皂苷不同的是，在胃中并不能由人参皂苷Rbl水解得到人参皂苷Rd，也不能由肠道菌分解得到人参皂苷Rd，人参皂苷Rd主要通过肠道酶水解得到。目前只有利用微生物来源的酶转化得到人参皂苷Rd的研究报道，这些研究中转化过程中存在转化产物不专一以及人参皂苷对酶的明显抑制，而且转化底物采用的都是高纯度的Rbl，导致这些转化方法酶用量大，在加上底物成本高，对工业化生产造成极大限制。4由于酶转化法应用困难，使得微生物转化法制备Rd单体更有研究价值和应用前景，但是迄今为止还没有利用微生物发酵专一性制备人参皂苷Rd的报道。
发明内容本发明提供一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，包含下列步骤a)人参皂苷加入培养液中，接种拟青霉菌(Paecilomycessp)进行发酵反应；b)收获菌体，菌体加入醇液提取，获得醇提取液；c)饱和正丁醇萃取醇提取液；d)层析柱分离、纯化。在一优选实施例中，所述拟青霉菌为人参皂苷耐受性高的拟青霉菌Paecilomycessp.4685，能进行微生物转化反应，并使主要产物停留在Rd。本发明所述的拟青霉菌Paecilomycessp.4685可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得。在优选实施例中，所述人参皂苷来源于人参、红参、白参、尾参、人参叶或人参花蕾以及同属的植物根、茎、叶。在优选实施例中，所述人参皂苷的投料量为培养液重量的0.5-7%，其中优选1%-2%。在优选实施例中，所述醇液选自甲醇或乙醇。在优选实施例中，所述培养液中碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、马铃薯或淀粉中之一或任何组合，其中优选淀粉。在优选实施例中，所述培养液中迟效氮源选自玉米浆，棉籽粉，酵母粉，黄豆粉，蛋白胨，花生粉中之一或任何组合，其中优选棉籽粉。在优选实施例中，所述培养液中速效氮源选自尿素，硝酸钠，氯化铵，硫酸铵，硝酸钾，醋酸铵中之一或任何组合，其中优选硝酸钠。在优选实施例中，所述培养液包含淀粉2-4%，棉籽'粉2-4%，硝酸钠0.05-0.2%，硫酸镁0.05-0.2%，氯化钙0.05-0.2%,麸皮0.1-1%。在优选实施例中，所述培养液的pH值为pH4-8，其中优选pH5。在优选实施例中，所述层析柱的填料为大孔吸附树脂。本发明所公开的方法转化率高，其转化率能保持在70-卯％，发酵产物人参皂苷Rd的纯度为98%，能够实现人参皂苷Rd的微生物产业化制备，扩充人参皂苷Rd药物资源来源，满足广阔的医疗保健的市场需要都有极大价值。图l.人参皂苷Rd的转化途径示意图。图2.碳源对转化效果的影响。图3.迟效氮源对转化效果的影响。图4.底物投料量对转化效果的影响。图5.转化时间对转化效果的影响。图6，pH值对转化效果的影响。图7.底物和产物的HPLC检测图。具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。实例l原始菌的对三七茎叶皂苷耐受性实验菌株Paecilomycessp.4685，筛选菌株生长情况良好，作为出发菌株。培养基马铃薯培养基(马铃薯20%，葡萄糖2%配制成汤液)，分装于10X150cm试管中，每管4ml，按表1加入三七茎叶皂苷，硅胶塞塞好试管口，121°C，灭菌20min。接种复壮的新鲜斜面用0.9%的生理盐水洗下孢子，制成107个孢子/1111的孢子悬浮液，每根装有培养基的试管中加入0.1ml该孢子悬浮液，28"培养6天，观察菌的生长情况(表1)。表1不同浓度三七茎叶皂苷液体培养基中菌生长情况三七茎叶皂苷浓度(mg/ml)05102025304060A+++++++++++-B+++++++++++*-C+++++++++++---+++不加皂苷时菌很好的生长，出现大块的菌体；++菌能生长，但菌体量只有空白对照的1/3~1/5:+菌基本不能生长，只有微量的菌体可以看见；一基本看不到菌体生长。培养基中不含皂苷时，菌体能很好的生长，最后长成较大的菌块。从表1中可以看出，菌随着三七茎叶皂苷浓度的增加，菌体的量明显减少，皂苷浓度达到30mg/ml，菌受到抑制，基本不能生长。实例2底物诱导筛选高底物耐受性，高专一性的生产菌株拟青霉菌—Paecilomycessp.4685菌株筛选生长情况良好的PaecilomycesBainiersp.4685菌株作为出发菌株。培养基马铃薯培养基(马铃薯20%，葡萄糖2%配制成汤液)，分装于10X150cm试管中，每管4ml，分别加入不同量的三七茎叶皂苷，使终浓度为30，35，40，45，50，55，60mg/ml等，硅胶塞塞好试管口，12KC，灭菌20min。诱导从菌株的耐受实验可以看出，高浓度的皂苷会抑制菌体的生长，因此，不断提高三七茎叶皂苷的浓度，挑选耐受菌株。将耐受实验中25mg/ml皂苷浓度中能生长的菌液，吸取O.lml加入到30mg/ml，35mg/ml，40fflg/ml的马铃薯培养基中，每种浓度重复若干支，28'C培养6-10天，观察菌体生长情况，将能生长的试管中的菌液，再接入更高浓度皂苷培养基中培育，经过不断筛选，最终从60mg/ml三七茎叶皂苷培养基中筛选得到高底物耐受性，高专一性的生产菌株拟青霉菌—Paecilomycessp.4685。实例3转化培养基的优化种子培养基蔗糖3%，黄豆粉3%，硫酸铵0.1%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，7麸皮0.5%。发酵培养基淀粉3%，棉籽粉3%,硝酸钠0.1%,硫酸镁0.1%，氯化铐0.1%，麸皮0.5%。所有培养基均装在250ml三角瓶中，装液量30ml，在121°C,灭菌20min。种子瓶接种后，28°C，220r/min摇床上培养36h，得到种子菌液。按6%的接种量接入发酵瓶中28'C，220r/mm摇床上培养36h，加入2%的三七二醇皂苷和0.6%的吐温80溶液，28°C，220r/min摇床上继续培养72h。碳源优化分别考察了葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，马铃薯，淀粉作为碳源时，对Rd转化率的影响。结果淀粉为碳源时，Rd的转化率，最高达到39.53%(图2)c迟效氮源分别考察了玉米浆，棉籽粉，酵母粉，黄豆粉，蛋白胨，花生粉作为迟效氮源时，对Rd转化率的影响。结果棉籽粉为氮源时，'Rd的转化率最高，达到57.1%(图3)。速效氮源分别考察了尿素，硝酸钠，氯化铵，硫酸铵，硝酸钾，醋酸铵作为速效氮源时，对Rd转化率的影响。结果硝酸钠为氮源时，Rd的转化率最高，达到61.25%(表2)。_表2速效氮源优化_速效氮源Rd产率(％)菌体干重(g)通过优化培养基的碳源，速效及迟效氮源，得到的培养基为淀粉3%，棉籽粉3%，硝酸钠0.1%,硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，麸皮0.5%;转化率为61%。在此基础上，利用统计学方法综合考察碳源，氮源以及微量元素及其含量对转化率的影响，目前可以达到70%以上。57.78±7.4161.25±1.0556.50±5.7351.71土2.6450.70土6.1054.13土3.920.86±0.040.96±0.121.12±0,051.13±0.101.07±0.030.94±0.07t钠铵铵钾铵^酸化酸酸酸厉硝氯硫硝醋实例4培养条件的优化投料量考察了加入底物量为1%-6%时，人参皂苷转化为人参皂苷Rd的产率情况。结果表明1%-2%之间，产率超过80%，达到84。/。，随着底物量增加，转化产率有所降低，投料量初步定为2%(图4)。底物投料量为2%-3。/。时，产率降低明显，底物投料量为3%-6%时，转化产率略有降低，基本维持在70%-80%之间的水平，这可能与提取的效率有一定联系，不同的投料提取时所用的溶剂体积相等，这样低浓度底物样品提取相对比较完全，而高投料量时转化产物残留相对多些。通风量利用装液量的不同考察了通风量对转化产率的影响，250ml三角瓶中分别加入30ml和50ml的培养基。结果表明装液量为30ml时，底物转化为人参皂苷Rd产率最高，装液量为50ml时，转化产率略有降低。转化时间考察了加入底物后转化8h，12h，24h，48h，72h皂苷Rd的产率情况。结果表明转化72h,底物转化完全，人参皂苷Rd产率最高。(图5)。pH:考察了不同pH对转化产率的影响，pH3转化产率最低，pH4-8之间，转化产率都在75%以上，培养基的自然pH为5，转化产率最高，达到80%以上(图6)。实例5产物Rd的检测薄层检测高效硅胶板(涂层厚度0.2111111±0.03111111);展开剂65:35:10(上层)，U0'C加热5min。HPLC检测样品处理将菌体10000r/min离心10min,去除上清，菌体用95%乙醇浸泡，超声处理3次，每次lh。再10000r/min，离心10min或者抽滤，得到乙醇提取液。提取液按Rd含量lmg/ml稀释，0.45um微孔滤膜过滤。流速0.8ml/min;检测波长203nm;柱温30°C。流动相乙腈-水(Omin，38:62;14min，70:30;24min，90:10;30min，38:62)梯度洗脱(图7)。图A:Rbl标准品，图B:转化底物三七皂苷Rbl标准品图C:转化产物Rd实例6产物的分离纯化将得到的菌液10000r/min，离心10min，弃除上清，或者抽滤去除滤液，收获菌体。菌体加入95%乙醇浸泡过夜，沸水浴30min，提取3次，每次lh，再10000r/min，离心10min或者抽滤，得到乙醇提取液。浓縮后，用水饱和正丁醇萃取3次，取正丁醇层，浓縮至干用于分离。称取新大孔吸附树脂(HZ-816、HZ-818、AB-8或D101，不限于这四种)适量，用2倍体积乙醇浸泡2h，并不断搅动，使树脂充分溶胀。将已充分溶胀的吸附树脂装柱，以每小时3-4倍床体积的流速，将5-8倍的乙醇通过树脂层，检测流出的乙醇，当流出的乙醇与水混合不变混，以每小时6-8倍床体积的流速将去离子水流过树脂层，置换出甲醇即可投入使用。吸取菌体提取液(人参皂苷Rd0.1-lg/mL)上柱，预吸附l-3h，过柱流出液重吸附1次，静置吸附6-12h，先用水洗至流出液不含糖(molish反应不显色)，用30-卯％乙醇梯度洗脱，控制流速0.5-2.5mL/min，至流分中检测不出人参皂苷Rd。TLC检测所有流分合并只含人参皂苷Rd的流分，浓縮至干。通过大孔树脂反复纯化(一般2-3次)，可以使人参皂苷Rd纯度达到98。/0。人参皂苷Rd鉴定的核磁数据见表3。表3人参皂苷RdNMR化学位移(C5D5N)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。权利要求1.一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，包含下列步骤a)人参皂苷加入培养液中，接种拟青霉菌(Paecilomycessp)进行发酵反应；b)收获菌体，菌体加入醇液提取，获得醇提取液；c)饱和正丁醇萃取醇提取液；d)层析柱分离、纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述拟青霉菌为人参皂苷耐受性高的拟青霉菌Paecilomycessp.4685。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述人参皂苷来源于人参、红参、白参、尾参、人参叶或人参花蕾。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述人参皂苷的投料量为培养液重量的0.5-7%。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述人参皂苷的投料量为培养液重量的2%。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述醇液选自甲醇或乙醇。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养液中碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、马铃薯或淀粉中之一或任何组合。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述培养液中碳源为淀粉。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养液中迟效氮源选自玉米桨，棉籽粉，酵母粉，黄豆粉，蛋白胨，花生粉中之一或任何组合。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述培养液中迟效氮源为棉籽粉。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养液中速效氮源选自尿素，硝酸钠，氯化铵，硫酸铵，硝酸钾，醋酸铵中之一或任何组合。12.根据权利要求ll所述的方法，其特征在于所述培养液中速效氮源为硝酸钠。13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养液包含淀粉2-4%，棉籽粉2-4%，硝酸钠0.05-0.2%，硫酸镁0.05-0.2%，氯化钙0.05-0.2%，麸皮0.1-1%。14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养液的pH值为pH4-8。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述培养液的pH值为pH5.'16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述层析柱的填料为大孔吸附树脂。全文摘要本发明涉及发酵
技术领域：
，具体涉及一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法。本发明提供一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，包含下列步骤人参皂苷加入培养液中，接种拟青霉菌(Paecilomycessp)进行发酵反应；收获菌体，菌体加入醇液提取，获得醇提取液；饱和正丁醇萃取醇提取液；层析柱分离、纯化。本发明所公开的方法转化率高，其转化率能保持在70-90％，发酵产物人参皂苷Rd的纯度为98％，能够实现人参皂苷Rd的微生物产业化制备，扩充人参皂苷Rd药物资源来源，满足广阔的医疗保健的市场需要都有极大价值。文档编号C12P33/00GK101676402SQ20081020008公开日2010年3月24日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者冯美卿,史训龙,珮周,周超群,宇孙,张亚丽,平方,维黄申请人:上海海泰药业有限公司