专利名称：一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能在毕赤巴斯德酵母中高效表达米黑根毛霉脂肪酶的脂肪酶基因序列 和展示有高活力脂肪酶的酵母菌，以及从该重组酵母中得到的基因工程脂肪酶。
背景技术：
脂肪酶(LipaseEC3丄1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂 肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要 的工业酶制剂之一，其催化活性仅仅取决于它的蛋白质结构，因而不同来源的脂肪酶具有 不同的催化特性和催化活力。
米黑根毛霉(i /^o/m/cor /m'e/^')脂肪酶(RML)的工业应用较广泛。Brady等人已将该酶 的高级结构阐述清楚，表明其具有优良的Sn-l立体特异性，对中长链脂肪酸酯较适合，可 用于制造人造黄油和具有不同熔点且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些"重构脂"。天然的 米黑根毛霉脂肪酶产量低下、成分不稳定，存在较大的缺陷，使得其应用成本偏高和应用 受到限制。目前，米黑根毛霉脂肪酶的酶学性质研究较深入，如Zacharis等以米黑根毛霉 脂肪酶的转酯化和酯化反应为模型，针对特定的反应底物、反应介质、酶催化剂，选择合 适的水合盐对调控水活度，提高了非水相催化效率。但就如何提高米黑根毛霉脂肪酶产量 和获得高酶活，国内外鲜有报道，利用传统发酵条件优化显著提高RML酶活力已经是无能 为力。
酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起来的真核展示系统，酵母的蛋白 质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。在酵 母细胞表面展示的酶，可直接进行活性分析，，避免了在大肠杆菌表达时的复杂纯化步骤。 表面展示有酶的酵母，经简单的离心富集后可作为全细胞催化剂，直接应用于催化反应， 具有固定化酶的优点，并且能实现酶的反复利用，大大降低了成本，有利于工业化生产。 人们早期开发的是酿酒酵母表面展示系统，而毕赤酵母表面展示系统是近来研发的。
毕赤酵母具有受甲醇调控的AOX1基因强启动子，能够稳定展示糖基化和二硫键异构 化等修饰的真核蛋白，较酿酒酵母而言，更具有表达量高，胞外表达本底蛋白少等优点。毕赤酵母展示与酿酒酵母展示相比，毕赤酵母展示的比酶活有可能比酿酒酵母展示的比酶 活低，但是毕赤酵母更易实现高密度培养，因此一般可获得高于酿酒酵母的酶产量。目前 报道毕赤酵母表面展示的脂肪酶较少，这与毕赤酵母表面展示系统开发较晚，载体系统不 成熟，展示能力不稳定有关。具体到米黑根毛霉脂肪酶的展示，发明人已将未修饰的原始 RML基因在酿酒酵母表面展示，酶活力为182U/g干细胞，产量低，大大限制了其作为全 细胞催化剂的应用和米黑根毛霉脂肪酶酶制剂的开发(Wei-GuoZhang, Shuang-YanHan， et al， Functional display of Rhizomucor miehei lipase on surface of Saccharomyces cerevisiae with higher activity and its practical properties; Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2008， 83: 329-335)。因而急需在增加酶的展示量、寻找更合适的展示宿主，以及改良展 示载体等方面的研究完善，为其应用奠定基础。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能在毕赤酵母表面高效展示的米黑根毛霉脂肪酶 (RML)的基因序列。
本发明的第二个目的是提供上述基因序列克隆的载体。
本发明的第三个目的是提供指导脂肪酶展示表达在毕赤酵母细胞表面的重组质粒载体。
本发明的第四个目的是提供具有上述基因序列的能展示高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌。
本发明的目的是通过以下技术方案实现
(1) 能在毕赤酵母中高效表达的改良的米黑根毛霉脂肪酶基因米黑根毛霉脂肪酶的
氨基酸序列为SEQ.ID.NOl,利用毕赤巴斯德酵母菌的偏好密码子置换出原米黑根毛霉脂肪 酶基因中酵母不常用的密码子，具体序列如SEQ.ID.N02。接着通过PCR合成的方法来获 得基因片段。具体方法首先根据已设计好的脂肪酶基因设计46条引物，均以阿拉伯数字 命名，其中1、 3、 5……45等单数为正向引物，2、 4、 6……46为反向引物，如SEQ.ID.N03 所示。将不同的引物采用二步PCR法(DNA聚合酶链式反应法)扩增获得全长改良脂肪 酶基因。
本发明中引物的合成、PCR法合成改良脂肪酶基因工作可以通过专门的生物技术公司 或机构来完成。
(2) 具有上述基因序列克隆的载体的构建 利用Taq酶能够在PCR产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带
4有3， T突出端的载体，将获得的改良脂肪酶基因PCR产物与T载体在连接酶作用下实现 体外连接，转化大肠杆菌感受态，涂平板培养过夜，进行蓝白斑筛选，挑选的阳性克隆提 质粒经测序验证。克隆脂肪酶基因用的T载体可以是市售通用的任意T载体，如pUCm-T Vector、 pGEM-T载体、PMD18-T、 PMD19-T等。我们选用了 PMD18-T，获得了携带改良 脂肪酶基因的质粒载体pMD18-T-i M丄。
本发明所述基因的重组载体PMD18-T-y #Z，其中y #Z是指脂肪酶基因序列；携带该质 粒的菌株大肠杆菌T0P10F/PMD18-T-RML Escherichia coli T0P10F/pMD18-T-RML于2008 年9月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCN0: M 208136。保藏地址 为湖北省武汉市武汉大学(430072)。
(3)脂肪酶展示表达到酵母细胞外的重组质粒载体的构建
为实现改良脂肪酶基因在毕赤巴斯德酵母中的展示表达，采用pKFS (已申请专利，申 请号200810028631.9， 此展示载体在pPIC9K (Invitrogen公司真核表达载体)的基础上 利用限制性内切酶和#"1将原载体上的信号肽部分基因切除，在此基础上用来源于 酿酒酵母的絮凝素基因FS替换。该质粒主要包含5MOW、 3M6 J、 FS(絮凝素基因)、#Z54， 以及力历p+、《朋+等元件，同时包含可用来克隆脂肪酶基因的多克隆位点，包括限制性内切 醇醇切位点MmI、 j/ al、 i&cl1、五coRI、爿wll、 〃"I)为克隆表达载体。去除了i M丄上游 编码自身信号肽的24个氨基酸对应的序列，以利用pKFS的絮凝素基因FS展示外源蛋白。 根据GenBank中已报道的米黑根毛霉脂肪酶RML前体序列(P19515， GI:417256)，设计 引物克隆成熟的米黑根毛霉脂肪酶基因，上游引物RMLpl : 5 '-5'-GCAGGCGAATTCGTTCCAATTAAGAGACAATCTAAC國3，，含五coRI酶切位点(以下划 线示出)以及保护碱基；下游引物 RMLp2 : 5 '-GCCAGCe￡I4aQAGTACACAAACCAGTGTTAATACC-3，，含AvrII酶切位点(以下 划线示出)以及保护碱基。
以质粒PMD18-T-及MZ为模板，及MZpl和i MZp2为引物进行PCR扩增。将PCR产物 和pKFS质粒都用￡coi /和双酶切，体外连接构建重组质粒pKFS-i M丄。
")提供具有上述基因序列的能表达高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌
以LiCl法将I线性化的重组质粒pKFS-i MZ转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115或 KM71,转化物涂布于MD平板，培养2—3d。将MD平板上的转化子分别接种于含不同浓 度的G418抗性YPD平板上，培养3—5d。将高浓度G418-YPD平板上出现的转化子挑取 其对应的单克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作为模板，进行酵母基因组PCR鉴定，获得重组转化子。
重组转化子先接种于BMGY培养基中，培养至OD6oo到2-6。离心收集菌体，再将其 悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD柳为1,继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基 中补加甲醇至终浓度为1.0%进行诱导表达，发酵上清液中脂肪酶活力高达468.8U/g酵母 干细胞。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果
本发明采用酵母表面展示系统表达酶，在保持酶高活力、高催化性能的同时，相比游 离酶或固定化酶省略了纯化分离的繁琐步骤，更具有固定化酶的优点，可以反复使用，操 作稳定性强。同其他表达系统一样，酵母表达非同种、非同属的外源基因时，也表现出来 了产量不高，表达能力降低的问题。本发明针对酵母表达系统合成适合其表达的RML基因， 有效了解决了上述问题，实现了酶的高表达，表达活力高达468.8U/g酵母干细胞，为现有 报道的最高水平。
图1是经PCR拼接合成基因的引物示意图； 图2是米黑根毛霉脂肪酶基因的PCR合成鉴定电泳图； 图3是pMD18-T-i M丄送上海生工生物工程有限公司测序图；
具体实施例方式
下面结合幅图与实施例对本发明做进一步的说明，但本发明要求保护的范围并不局限 于实施例表述的范围。
实施例l:改良米黑根毛霉脂肪酶基因的合成
现有的米黑根毛霉脂肪酶基因如SEQ.ID.N04所示，该基因来源为米黑根毛霉，与酵 母不同属，这可能是该基因在毕赤酵母中的表达量不高的主要原因。
本发明是在米黑根毛霉脂肪酶(RML)氨基酸序列(SEQ.ID.NOl)的基础上，釆用毕赤 巴斯德酵母偏好的密码子替换i M丄在酵母中使用频率低的密码子，设计出在毕赤巴斯德酵 母中使用频率高的基因序列，形成以下具体的基因序列，如SEQ.ID,N02，从而提高米黑根 毛霉脂肪酶在酵母中的表达量。
本发明设计的基因可以通过PCR人工合成，步骤如下
首先合成46条引物，弓l物如SEQ.ID.N03所示。如图1所示，弓l物包括正向引物23 条(奇数序，正向箭头)，反向引物23条(偶数序，反相箭头)，正向引物与反相引物彼此 配对互补。将46条寡核苷酸(引物)以200 nmol/L的终浓度加入PCR反应体系，反应
6体系中加入10XTaq DNA聚合酶buffer 5 n L， 2. 5 mmo1/ L dNTPs 4 u L， Taq DNA聚合酶 0.5uL，无菌双蒸水补充至50uL，进行第一轮PCR反应94。C变性10s ，50 。C退火30s ， 72 。C延伸45s ，共35cycles。将此PCR产物稀释100倍后取2uL作为模板，加入上下 游两末端的核苷酸(即Pl和P22)至终浓度200 nrno1/， PCR体系同上。94 。C变性5 min后， 94。C变性45s， 50'C退火lmin, 72。C延伸2min，共30个循环；第30个循环72°(3延伸10min， 将第二轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示。由图可知道，二次PCR产物在 对应DNA Marker分子量为1000的位置上出现了明显的特异性扩增带，同设计的片 段大小相符。初步证实获得了改良的及Mi:基因。 实施例2:
PMD18-T-i ML质粒的构建
上步获得的全长PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，切取约1092bp大小的目的条带， 按QIAGEN的PCR凝胶回收试剂盒说明书纯化目的产物，取回收产物25.5 u L，加入25 mM浓度的dATP 1 n L， 10XPCRbuffer3 u L， Taq酶0.5 u L， 72。C保温30 min。
加A后的产物(A是腺嘌呤)，用pMD18-T simple vector试剂盒进行TA克隆，按照 说明书进行操作。10 u L体积反应体系如下T载体1 !i L (50ng)，加入加A后的PCR产物 3 u L，含ATP的10XBuffer 1 u L， T4 DNA连接酶1 u L，用ddH20补足至10 u L 。稍 加离心，16"C水浴连接夜。连接产物转化Eco/z'DH5a ，然后涂布到含0.5mM IPTG， 40 yg/ml X-Gal指示平板上，过夜培养，挑选白斑提取质粒酶切鉴定后，将重组质粒 PMD18-T-i M丄送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果如图3所示，表明克隆的基因 与我们设计基因一致。
实施例3:
重组质粒pKFS-及Afi的构建
以质粒PMD18-T-及MZ为模板，i M￡pl和及MZp2为引物进行PCR扩增。体系为模板 lpL; 10xTa《DNA聚合酶buffer 5pL(含Mg2+); 2.5附附o〃L dNTP化L; 20nMmol/L的上下 游引物各lpL; r呵DNA聚合酶0.75nL，加无菌水至总体积为50nL。反应条件为:94t:预 变性5min; 94。C变性45s， 45。C退火45s， 72。C延伸2min，共30个循环；第30个循环72°C 延伸10min， PCR产物进行0.8。/。琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化。
将PCR产物和pKFS质粒都用五coi /禾n 双酶切，构建重组质粒pKFS-i M丄后用 CaCl2转化法转入五.co/!'ToplOF，在Amp+LB (50mg/mL)平板上涂板，过夜培养。提取阳 性转化子质粒进行Ecoi /和^rlI双酶切鉴定。鉴定正确后，同样委托上海生工生物工程有限公司进行测序。 实施例4
表达高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌的培养
以LiCl法将Sail线性化的重组质粒pKFS-RML转化宿主菌GS115，转化物涂布于MD 平板，30。C培养2d。将MD平板上的转化子分别接种于含G418 0.5 mg/mL， 1.0 mg/mL， 1.5mg/mL, 2.0mg/mL， 3.0 mg/mL的YPD平板上，3(TC培养3d。将高浓度G418-YPD平 板(3.0 mg/mL)上出现的转化子挑取单克隆。按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作 为模板，利用目的基因序列的PCR引物进行酵母基因组PCR鉴定，总反应体积为20pL， Taq酶量为2U，取2pLPCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
鉴定正确的重组转化子GS115/ pKPS-i Mi:接种于20mLBMGY培养基中，30°C， 200r/min振荡培养160h至0D6W)到3。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀 释至OD600为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度为1.0% 进行诱导表达，发酵4天。发酵液在7000rpm、 4。C离心10分钟，弃上清，用去离子水洗 涤菌体三次，重悬菌体经真空冷冻干燥24h，得菌体冻干粉。利用橄榄油做底物进行NaOH 法滴定测定脂肪酶水解活力，结果显示该脂肪酶活力高达468.8U/g酵母干细胞，比现有技 术(Functional display of Rhizomucor miehei lipase on surface of Saccharomyces cerevisiae with higher activity and its practical properties)报道的酿酒酵母展示的米黑根毛霉脂肪酶的酶活力 182U/g酵母干细胞提高近3倍。
在一定的反应条件下，每克重组脂肪酶干细胞每分钟与底物反应生成lRmol对硝基苯 酚(游离脂肪酸)定义为1个酶活单位(U)。
实施例5脂肪酸甲酯的合成
采用大豆油(或三油酸甘油酯)和甲醇为原料，使用有机溶剂，在毕赤酵母细胞表面
展示的米黑根毛霉脂肪酶作用下发生转酯化反应，得到脂肪酸甲酯产品。
有机溶剂石油醚预先用3A分子筛充分除水。取约2.5mL底物(其中大豆油0.965g，甲 醇0.035g，石油醚2.5ml，醇油摩尔比为1: 1)混合物于25 mL具塞三角瓶中，在40度下 预热20min，然后加入0.2§(约17.29611)实施例4的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉，反应温度 40°C，然后于180rpm下振荡反应，在反应24 h和48h后分别加入0.035g甲醇(最终醇油 摩尔比为3: 1)，反应72h，反应完成后离心取上清，然后上气相色谱分析(气相色谱安 捷伦7890C;检测器氢离子检测器；柱子DB-FFAP毛细管柱)，最终脂肪酸甲酯的含量 为1.5036g。实施例6非水相酯化反应制备己酸乙酯
试剂都预先用3A分子筛充分除水。将无水乙醇和正己酸加入正庚烷中。加入后，无水 乙醇的浓度为0.3mol/L，正己酸的浓度为0.2mol/L。取5 mL底物(其中正己酸125n L， 无7jC乙醇87.6uL,正庚烷4787.4uL，酸醇摩尔比为1: 1. 5)混合物于50mL具塞三角瓶 中，加入含量为40g/ L的实施例4的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉，反应温度4(TC，然后 于200rpm下振荡反应，0.5 h后加入0.5g分子筛，5h后加入0.3g分子筛，反应12h，己酸 的转化率能达到98%。在上述条件下反应后，离心回收菌体，经溶剂正庚烷洗涤，去除产 物和残余的微量底物，再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应，经过10批次的 连续使用，毕赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的转化率保持在95%以上。
由实施例5、 6可见，应用实施例4制备的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉均能有效催化脂 肪酸甲酯和己酸乙酯的合成，由于该菌体冻干粉作为催化剂，与游离酶和固定化酶相比， 省去了分离纯化的繁琐步骤，易于制备，生产周期短，操作稳定性强，有利于降低生产成 本，并实现规模化应用。序列列表 SEQ.ID.NOl:
1 MVLKQRANYL GFLIVFFTAF LVEAVPIKRQ SNSTVDSLPP LIPSRTSAPS SSPSTTDPEA 61 121SEQ.ID,NQ3:
1ATGGTTTTGAAGCAAAGAGCTAACTACTTGGGT 33bp
51 bp
3 TTTTTGATTGTXTTTTXTACTGCTTTTTTGGTTGAAGCTGTTCCAATTAAGA 52 bp
4 AGAATCAACAGTAGAGTTAGATTGTCTCTTAATTGGAACAGCTTCAACC 49 bp
5 GACAATCTAACTCTACTGTTGATTCTTTGCCACCATTGATTCCATCT 47 bp 6AAGAAGATGGAGCAGAAGTTCTAGATGGAATCAATGGTGGCAA 43 bp
7 AGAACTTCTGCTCCATCTTCTTCTCCATCTACTACTGATCCAGAAG 46 bp
8 CCGTTTCTAGACATAGCTGGAGCTTCTGGATCAGTAGTAGATGGAG 46 bp
9 CTCCAGCTATGTCTAGAAACGGTCCATTGCCATCTGATGTTGA 43 bp
10 TCAAAGCCATACCGTACTTAGTTTCAACATCAGATGGCAATGGA 44 bp
11 AACTAAGTACGGTATGGCTTTGAACGCTACTTCTTACCCAGATAC 45 bp
12 ATC A ATAGAC ATAGCTTGAACA AC AGTATCTGGGTAAGA AGTAGCGT 47 bp
13 TGTTGTTCAAGCTATGTCTATTGATGGTGGTATTAGAGCTGCTACT 46 bp
14 GTAAGTCAATTCGTTAATTTCTTGAGAAGTAGCAGCTCTAATACCACC 48 bp
15 TCTCAAGAAATTAACGAATTGACTTACTACACTACTTTGTCTGCTAACTCTT 52 bp
16 ACCTGGAATAACAGTTCTACAGTAAGAGTTAGCAGACAAAGTAGTGTA 48 bp
17 ACTGTAGAACTGTTATTCCAGGTGCTACTTGGGGTTGTATTCATTG 46 bp
18 AATCTTCAAATCTTCAGTAGCATCACAATGAATACAACCCCAAGTAGC 48 bp
19 TGATGCTACTGAAGATTTGAAGATTATTAAGACTTGGTCTACTTTGATTTAC 52 bp
20 CTAGCAACCATAGCGTTAGTATCGTAAATCAAAGTAGACCAAGTCTTAAT 50 bp
21 G ATACTAACGCTATGGTTGCTAG AGGTG ATTCTGA A AAGACTATTTACA 49 bp
23 TTGTTTTTAGAGGTTCTTCTTCTATTAGAAACTGGATTGCTGATTTGACTTT 52 bp
24 GGTGGGTAAGAAACTGGAACAAAAGTCAAATCAGCAATCCAGTT 44 bp
25 TGTTCCAGTTTCTTACCCACCAGTTTCTGGTACTAAGGTTCATAAG 46 bp
26 TCACCGTAAGAATCCAAAAAACCCTTATGAACCTTAGTACCAGAAACT 48 bp
27 GGTTTTTTGGATTCTTACGGTGAAGTTCAAAACGAATTGGTTGCT 45 bp
28 ATTGCTTAAATTGATCCAAAACAGTAGCAACCAATTCGTTTTGAACT 47 bp
29 ACTGTTTTGGATCAATTTAAGCAATACCCATCTTACAAGGTTGCTG 46 bp
55 bp30 CCACCCAAAGAATGACCAGTAACAGCAACCTTGTAAGATGGGT 43 bp
31 TTACTGGTCATTCTTTGGGTGGTGCTACTGCTTTGTTGTGTG 42 bp
32 TCTTCTCTTTGGTACAAATCCAAAGCACACAACAAAGCAGTAGCA 45 bp
33 CTTTGGATTTGTACCAAAGAGAAGAAGGTTTGTCTTCTTCTAACTTGTTT 50 bp
34 TGGTTGACCTTGAGTGTACAAAAACAAGTTAGAAGAAGACAAACCT 46 bp
35 TTGTACACTCAAGGTCAACCAAGAGTTGGTGATCCAGCTTTT 42 bp
36 CCAGTAGAAACAACGTAGTTAGCAAAAGCTGGATCACCAACTCT 44 bp
37 GCTAACTACGTTGTTTCTACTGGTATTCCATACAGAAGAACTGTTAACG 49 bp
38 GCAAATGTGGAACAATATCTCTTTCGTTAACAGTTCTTCTGTATGGAATA 50 bp
39 AAAGAGATATTGTTCCACATTTGCCACCAGCTGCTTTTGGTTTTT 45 bp
40 AGTATTCTTCACCAGCATGCAAAAAACCAAAAGCAGCTGGTG 42 bp
41 TGCATGCTGGTGAAGAATACTGGATTACTGATAACTCTCCAGAAAC 46 bp
42 CAAATCAGAAGTACAAACTTGAACAGTTTCTGGAGAGTTATCAGTAATCC 50 bp
45TTCCATTTACTTCTGTTTTGGATCATTTGTCTTACTTTGGTATTAACACTG 51 bp 46 TTAAGTACACAAACCAGTGTTAATACCAAAGTAAGACAAA 40 bp
SEQ.ID.N04:
1
12<formula>formula see original document page 13</formula>
权利要求
1、一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因，其特征在于，其完整全基因序列为SEQ.ID.NO2。
2、 一种含有权利要求1所述基因的重组载体pMD18-T-Z ifc，其中^1￡是指权利要求1 所述的脂肪酶基因序列；携带该质粒的菌株^sc力en'c力ia T0P10/pMD18-T-RML保藏号 为CCTCC M 208136。
3、 一种含有权利要求l所述基因序列的重组载体沐FS-^fc，其中y ifc是指权利要求l 所述的脂肪酶基因；以质粒PMD18-T-i M丄为模板，及Attpl和及ikttp2分别为上、下游引物， 进行PCR扩增；将PCR产物和pKFS质粒都用和双酶切，体外连接构建重组 质粒pKFS-i ML;上游弓I物RMLpl: 5 '隱5'陽GCAGGCGAATTCGTTCCAATTAAGAGACAATCTAAC-3 ，； 下游引物RMLp2: 5 '墨GCCAGCCCTAGGAGTACACAAACCAGTGTTAATACC-3 ，。
4、 一种由权利要求2所述的重组载体所转化的毕赤酵母菌，其特征在于，将表达载体 pKFS-i Mi转化入毕赤巴斯德酵母。
全文摘要
本发明涉及一种改良的米黑根毛霉脂肪酶基因及其在酵母展示中的应用。改良的米黑根毛霉脂肪酶基因序列为SEQ.ID.No2。含有所述基因的重组载体pMD18-T-RML，RML是指脂肪酶基因；携带该质粒的菌株Escherichia coli TOP10/pMD18-T-RML保藏号为CCTCC M208136。本发明将该基因转入到毕赤酵母宿主菌中，实现米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的展示表达，提供的毕赤酵母菌能有效展示米黑根毛霉脂肪酶，该脂肪酶能广泛应用于制造脂肪酸甲酯、己酸乙酯、具有不同熔点且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些“重构脂”等。
文档编号C12N15/55GK101481695SQ200810198949
公开日2009年7月15日 申请日期2008年10月7日 优先权日2008年10月7日
发明者影 林, 王小宁, 郑穗平, 韩双艳, 韩振林, 黄登峰 申请人:华南理工大学