水稻抗病相关基因wrky42及在水稻改良中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因WRKY42 的分离克隆、功能验证和应用。W服Y42基因是水稻抗病反应中的负调控因子。抑制表达 WRKY42基因的转基因植株的抗稻癌病能力显著提高。
【背景技术】
[0002] 植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病 毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：（1)病原体成功的在寄主植物内 繁殖，引起相关的病症；（2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性 基因资源改良农作物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
[0003] 植物抗病有多种分类方式。在遗传学水平上，根据抗病反应的强度和速度，可 分为质量抗性（或完全抗性）和数量抗性（或不完全抗性）。质量抗性可由单个主效抗病 (majordiseaseresistance,MR)基因调控，抗性水平高，速度快，但是一般有病原生理 小种特异性狂hangandWang, 2013)。数量抗性由多个基因或数量性状位点（quantitative traitlocus,QTL)调控，一般抗性水平较低，但是通常具有广谱和持久抗性化OUand Wang, 2010)。在分子水平上，植物抗病反应可分为病原相关分子模式/植物来源损伤相关 分子模式（P曰tho邑en-曰ssoci曰tedmolecul曰rP曰ttern/plant-deriveddam曰邑e-曰ssoci曰ted molecularpattern,PAMP)诱导的免疫（PAMP-triggeredimmunity,PTI)和效应子诱 导的免疫（effector-triggeredimmunity,ETI)(JonesandDangl2006)。ΡΤΙ由位于 植物细胞膜上的模式识别受体（patternrecognitionreceptor,PRR)类蛋白启动，它 一般抗性水平低，无病原种类或病原生理小种特异性，故送类抗性又被称为基础抗性 (Thommaetal., 2011)。ETI由位于细胞质中的核巧酸结合-富亮氨酸重复（leucine-rich repeat,LRR)类抗病（diseaseresistance,R)蛋白激活，一般抗性水平高，但是具有病原 生理小种特异性，故送类抗性又被称为基因-对-基因抗性（gene-化r-generesistance) 或病原特异性抗病反应。
[0004] 植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两 类；受体（receptor)基因和抗病相关（defense-responsive)基因化OUandWang, 2010)。 受体基因包括PRR和R基因。根据目前人们对抗病基因功能的认识，调控质量抗性的MR基 因可W是R类基因，也可W是PRR类基因狂hangandWang, 2013)。虽然MR基因介导的抗病 反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用MR基因改良植物抗性受到限制： (1)MR基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的MR基因大约只有30多 个；（2)MR基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速 突变，一个MR基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。抗病相关基因是指位于PRR和 R启动的抗病信号传导路径中除受体基因外的所有基因。送类基因的共同特点是病原诱导 后它们的表达量升高或降低，或它们编码蛋白的修饰发生改变。因此人们可W根据病原诱 导前后基因的表达量的差异或蛋白质修饰的变化大规模地鉴定植物抗病相关基因（Schenk et al.，2000 ;Zhou et al.，2002 ;Wen et al., 2003 ;Qiu et al.，2004;曾等，2008)。目 前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的 抗性能力可能比MR基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源；（1)由于 绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，送类基因可能是具有持久抗 性的基因资源；（2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具 有广谱抗性的基因资源；(3)送类基因的资源丰富。但是，人们虽然在水稻中鉴定了很多抗 病相关基因狂hou et al. ,2002 ;化U et al. ,2004)，送些基因在水稻抗病反应中的作用机 理、W及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。
[0005] 水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。稻 癌病由稻癌病菌（Magnaporthe0巧zae)引起，是世界上对水稻危害最大的真菌性病害之一 (LiandWang, 2013)。发掘和利用优良抗性基因资源改良水稻是控制病害的发生、减少或 避免水稻病害所带来的损失最经济有效的措施。
[0006] 分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。与MR基因的应用相比，抗 病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过抑制表达作为抗病反应负调控 因子的抗病相关基因进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。 送些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用 RNA干扰技术（RNAinterference,RNAi)通过使目标基因沉默，鉴定该基因在抗病反应过 程中所起作用，为利用送个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。该基 因被命名为WRKY42。
[0008] 本发明通过分离WRKY42基因，确定该基因是水稻抗稻癌病菌（Magnaporthe oryzae)的负调控因子。WRKY42基因序列如序列表SEQIDN0;1所示，或者基本上相当于 SEQIDN0;1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQIDN0;1所示序列的亚片段。对其 序列进行分析表明它编码一种WRKY类转录因子。抑制序列表SEQIDNO;1所示序列的表 达可W增强水稻对稻癌病的抗性。
[0009] 可W采用已经克隆的W服Y42基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明 的基因或同源基因。同样，采用PCR技术，也可W从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发 明的W服Y42基因W及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用W上技术，可W 分离得到包含WRKY42基因的序列或者包含一段WRKY42基因的序列，将送一序列与合适的 载体连接，可W转入植物细胞抑制其自身的W服Y42基因的表达，产生抗病转基因植物。采 用送种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。
[0010] 本发明为增强水稻对稻癌病的抗性提供了 一种新的方法。送种方法包括将WRKY42 基因的部分片段和与能够表达双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)的载体连接、转入水 稻，通过抑制其自身WRKY42基因的表达改良水稻对稻癌病的抗性。
[0011] 在本发明的实施例部分，申请人阐述了WRKY42基因的分离、功能验证和应用过程 W及该基因的特点。
【附图说明】
[0012] 序列表SEQIDNO;1是本发明分离克隆的WRKY42基因的核巧酸序列（1 - 946 bp)和它对应的的氨基酸序列。
[0013] 序列表SEQIDN0;2是本发明分离克隆的WRKY42基因编码的蛋白质的序列。
[0014] 图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因WRKY42W及验证WRKY42基因功 能的流程图。
[0015] 图2.用定量RT-PCR技术分析稻癌病菌N2-2侵染后抗病水稻家系C101A51和感 病水稻品种C039中WRKY42基因的表达变化。对照是接种稻癌病菌N2-2前的样品；其它是 接种稻癌病菌N2-2后的样品。每个样品中WRKY42基因的表达量是相对于接种前C101A51 样品中WRKY42基因的表达量。
[0016] 图3.PCR扩增产物和WRKY42基因的结构。"ATG"和"TAG"分别是翻译起始密码和 终止密码。数字示每一种结构的核巧酸数目。
[0017] 图4.PDS1301载体携带表达WRKY42双链RNA片段（313bp),即克隆D153R。RB和 LB代表PDS1301 载体（Caoetal.，2007 ;化anetal.，2007)上的T-DNA右和左边界；GUS 代表PDS1301载体上的目一葡萄糖巧酸酶基因（标记基因）；化t代表PDS1301载体上的 潮霉素磯酸转移酶基因（筛选基因）。35S代表PDS1301载体上的花挪菜花叶病毒启动子； A化I代表PDS1301载体上的玉米己醇脱氨酶基因内含子I;0CS代表PDS1301载体上的章 鱼碱合成酸基因终止子；Wa巧-a代表PDS1301载体上的水稻Wa巧基因内含子。
[0018] 图5.多数T。代遗传转化植株中WRKY42基因的表达被抑制。对照为水稻感病品 种牡丹江8(遗传转化的受体）。
[0019] 图6.抑制表达WRKY42基因的植株明显增强对稻癌病菌N2-2的抗性。
[0020] 图7.T3代遗传转化株系中的WRKY42基因的表达被抑制与抗病表型共分离。对照 为水稻感病品种牡丹江8(遗传转化的受体）。病情指数为接种稻癌病菌N2-2走天后的数 据。遗传转化植株中WRKY42基因的表达量是相对于对照牡丹江8中WRKY42基因的表达量。 +，表阳性遗传转化株系；一，表W阴性遗传转化植株。
【具体实施方式】
[0021] 本发明的前期研究工作结果显示水稻WRKY基因家族的一个成员WRKY13正向调控 水稻抗病反应（Qiuetal.，2007);激活WRKY13影响该家族的另一个成员WRKY42基因的 表达（Qiuet曰1.，2009)。为了探明WRKY42基因是否调控水稻应对稻癌病菌的侵害，产生 了本发明。
[0022] W下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了分离克隆W服Y42基因W及验证 WRKY42基因功能的流程。根据W下的描述和送些实施例，本领域技术人员可W确定本发明 的基本特